蔣 榮， 劉國(guó)兵， 侯 靜，吳 櫻

(1.長(zhǎng)沙市第三醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.長(zhǎng)沙市第三醫(yī)院 心血管內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種復(fù)雜的生殖內(nèi)分泌綜合征，雄激素過高是其在臨床上的主要特征[1]。多囊卵巢綜合征可導(dǎo)致內(nèi)分泌出現(xiàn)嚴(yán)重紊亂，持續(xù)性無(wú)排卵，從而導(dǎo)致患者發(fā)生生殖障礙。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在無(wú)排卵性的不孕癥患者中，因PCOS而導(dǎo)致的不孕癥占75%以上[2]。在臨床上，PCOS主要表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂、高雄激素血癥、低雌激素等癥狀。如果激素長(zhǎng)時(shí)間都處于紊亂的狀態(tài)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率也會(huì)隨著月經(jīng)紊亂的時(shí)間延長(zhǎng)而升高[3]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，慢性的炎癥反應(yīng)也是導(dǎo)致多囊卵巢綜合征的主要原因，PCOS的發(fā)生和發(fā)展與慢性炎癥有著密不可分的關(guān)系[4]。C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)作為炎癥反應(yīng)中最為敏感的指標(biāo)，CRP的含量越高，說明炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)CRP在正常人體內(nèi)含量很低，但在受到損傷或感染的人體內(nèi)CRP的表達(dá)就會(huì)明顯升高，因此在臨床上CRP也被認(rèn)為是早期診斷疾病的指標(biāo)[5]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS大鼠中，其卵巢竇狀卵泡顆粒細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，而半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶[6]。以上研究提示PCOS和體內(nèi)CRP和caspase-3蛋白的表達(dá)有著密切的聯(lián)系，目前對(duì)于PCOS的治療還沒有最為理想的方法。傳統(tǒng)的治療方法有腹腔鏡下卵巢打孔術(shù)、藥物促排卵以及藥物抗雄激素等。但這些方法有的不僅會(huì)造成較大的手術(shù)創(chuàng)傷，治療的效果也不理想，并且不能有效的預(yù)防多囊卵巢綜合征的發(fā)生，其副作用也相對(duì)較大[7]。由此可見在婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域PCOS的治療和預(yù)防仍是研究的熱點(diǎn)。黃芩苷是黃芩中的有效成分之一，具有多種藥理作用，如降壓、鎮(zhèn)靜、抗菌、消炎等。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在LPS誘導(dǎo)的小豬模型中通過NLRP3炎性體通路，發(fā)揮其抗炎作用[8]。但黃芩苷對(duì)PCOS炎癥的影響還沒有明確的研究，所以本文采用黃芩苷對(duì)PCOS大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，并分析其對(duì)大鼠體內(nèi)雌激素、CRP及caspase-3蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)所用的30只大鼠均來自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司。所有大鼠健康并且沒有任何的疾病，體重均在200～280 g之間，37℃的環(huán)境中對(duì)大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，讓大鼠適應(yīng)7 d新的環(huán)境。

1.2 試劑和儀器 黃芩苷(西安賽德有機(jī)科技有限責(zé)任公司)；caspase-3抗體(美國(guó)CST公司)；C反應(yīng)蛋白(CRP)和性激素試劑盒(上海博谷生物生物科技有限公司)；低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；FA精密天平(上海諾科儀器儀表有限公司)。

1.3 動(dòng)物分組與模型建立 把30只大鼠隨機(jī)分為NC組(空白對(duì)照組：正常大鼠僅給予NaCl灌胃干預(yù))、PCOS組(多囊卵巢綜合征大鼠模型給予NaCl灌胃干預(yù))，HQG組(多囊卵巢綜合征大鼠模型給予黃芩苷灌胃干預(yù))。建立PCOS大鼠模型，首先配置脫氫表雄酮，按照每100克大鼠6 mg的計(jì)量進(jìn)行調(diào)配，并把脫氫表雄酮用大豆油稀釋為0.2 mL的溶液。將配置好的脫氫表雄酮溶液分別頸背部皮下注射于PCOS組大鼠和HQG組大鼠，1天1次，連續(xù)對(duì)PCOS組和HQG組大鼠注射20 d。而NC組僅皮下注射大豆油，計(jì)量和注射次數(shù)同HQG組和PCOS組。用顯微鏡分別觀察20 d后大鼠一個(gè)動(dòng)情期的陰道涂片，當(dāng)陰道出現(xiàn)連續(xù)的上皮角化，并且完整的動(dòng)情期都消失時(shí)則代表PCOS模型制備成功。NC組和PCOS組大鼠給予NaCl灌胃干預(yù)，1次/d；HQG組大鼠給予50 mg/kg黃芪苷灌胃，1次/d，3組大鼠連續(xù)灌胃14 d。

1.4 標(biāo)本采集 藥物干預(yù)結(jié)束后，分別采集3組大鼠的尾靜脈血液，將尾靜脈血置入-80℃的冰箱中保存。分別處死NC組、PCOS組和HQG組大鼠，取出大鼠兩側(cè)的卵巢組織，并在天平上稱取其總質(zhì)量，固定后放置在-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 大鼠體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量的測(cè)定 對(duì)3組大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)前和干預(yù)后分別測(cè)量其體重。處死大鼠后把大鼠兩側(cè)卵巢組織取出，并用精密天平稱取大鼠雙側(cè)卵巢的總質(zhì)量。

1.6 大鼠血清激素含量測(cè)定 分別取出3組大鼠2 mL的尾靜脈血進(jìn)行離心處理，取血清，檢測(cè)血清中LH(黃體生成素)、T(睪酮)、FSH(卵泡刺激素)和E2(雌二醇)4種性激素的含量。

1.7 ELISA檢測(cè)大鼠血清炎性因子含量 治療14 d后，麻醉大鼠，取大鼠的靜脈血離心處理，分離3組大鼠的血清，檢測(cè)IL-6和CRP含量。

1.8 卵巢組織病理學(xué)形態(tài)觀察 藥物干預(yù)后，分別處死NC組、PCOS組和HQG組大鼠，把大鼠的卵巢組織分別取出，固定后用石蠟包埋切片，石蠟切片的厚度為4 μm，脫蠟后進(jìn)行HE染色并進(jìn)行觀察。

1.9 Western blot檢測(cè)大鼠卵巢組織中caspase-3蛋白的表達(dá) 將3組大鼠的卵巢組織分別提取100 mg，將細(xì)胞進(jìn)行裂解并提取核蛋白，并對(duì)核蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)量，分裝后，保存在-20℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進(jìn)行混均，按照4∶1的比例進(jìn)行，將蛋白溶液煮沸處置，變性。在電泳板內(nèi)注入50 μg蛋白樣。全部轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再把脫脂奶粉加入，全程封閉時(shí)常為1 h。把一抗加入孵育后用TTBS進(jìn)行洗滌，洗滌后把二抗加入，孵育1 h后取出PVDF膜，再次洗滌后用DAB進(jìn)行顯色，最后數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.10 RT-PCR檢測(cè)大鼠卵巢組織中caspase-3 mRNA的表達(dá) 把保存在-80℃環(huán)境中卵巢組織取出。將液氮冷凍中的卵巢組織進(jìn)行研磨，用Trizol裂解后對(duì)總的RNA進(jìn)行提取，將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA進(jìn)行熒光反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。所有反應(yīng)嚴(yán)格按照反應(yīng)的條件進(jìn)行擴(kuò)增，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。取得到平均值后得到Ct值，計(jì)算方法用2-△△Ct法進(jìn)行分析，引物序列見表1。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量比較 在干預(yù)前PCOS組大鼠和HQG組大鼠的的體重顯著高于NC組(P<0.05)，而PCOS組大鼠和HQG組大鼠的體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；干預(yù)后，PCOS組大鼠的體重明顯高于NC組大鼠，HQG組大鼠的體重顯著低于PCOS組(P<0.05)。PCOS組大鼠的卵巢質(zhì)量明顯高于NC組大鼠，而HQG組大鼠的卵巢質(zhì)量顯著低于PCOS組(P<0.05，見表2)。

表2 3組大鼠干預(yù)前后的體重比較和卵巢質(zhì)量比較

2.2 3組大鼠血清中激素含量比較 與 NC組相比較，PCOS組大鼠血清中LH、T和E2含量顯著升高，而性激素FSH的含量顯著降低(P<0.05)；干預(yù)后的HQG組大鼠性激素水平得到了明顯的抑制，同時(shí)FSH的含量顯著升高(P<0.05，見表3)。

表3 3組大鼠血清中激素含量比較

2.3 3組大鼠血清中炎性因子含量比較 PCOS組大鼠血清中CRP的含量明顯高于NC組大鼠，經(jīng)過黃芩苷干預(yù)治療后的HQG組大鼠血清中炎性因子CRP含量顯著降低(P<0.05)，見表4和圖1。

表4 3組大鼠血清中炎性因子CRP含量比較

2.4 3組大鼠卵巢組織形態(tài)變化比較 NC組大鼠的顆粒細(xì)胞均能完整顯示，均排列整齊，細(xì)胞無(wú)變性和壞死，無(wú)炎性因子浸潤(rùn)，在卵巢的髓質(zhì)中無(wú)充血及水腫出現(xiàn)。與NC組相比，PCOS組大鼠的組織形態(tài)出現(xiàn)明顯的改變，PCOS組大鼠的卵巢組織中出現(xiàn)嚴(yán)重的彌漫性擴(kuò)張，出現(xiàn)了大量的囊腔且大小不一，粒層細(xì)胞受到了嚴(yán)重的擠壓，形狀也極為不規(guī)則，黃體大量減少，發(fā)育階段卵泡數(shù)量降低。黃芩苷治療后的HQG組大鼠的卵巢組織形態(tài)得到了明顯的改善(見圖2)。

*：與NC組相比，P<0.05；#：與 PCOS組相比，P<0.05。圖1 3組大鼠CRP含量比較

A：NC組；B：PCOS組；C：HQG組；HE染色，×400。圖2 3組大鼠卵巢組織染色結(jié)果

2.5 Western blot檢測(cè)大鼠卵巢組織中caspase-3蛋白表達(dá) 與NC組相比較，PCOS組大鼠卵巢組織中caspase-3蛋白明顯增多(P<0.05)；經(jīng)過黃芩苷干預(yù)后的HQG組大鼠卵巢組織中caspase-3蛋白的表達(dá)顯著減少(P<0.05，見圖3～4)。

圖3 3組大鼠卵巢組織caspase-3蛋白表達(dá)

2.6 RT-PCR檢測(cè)3組大鼠卵巢組織中caspase-3 mRNA的表達(dá) 與NC組比較，PCOS組大鼠的caspase-3 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；而HQG組大鼠表達(dá)量得到了顯著的降低(P<0.05)，見表5和圖5。

*：與NC組相比，P<0.05；#：與PCOS組相比，P<0.05。圖4 3組大鼠卵巢組織中caspase-3蛋白比較

表5 3組大鼠caspase-3 mRNA的表達(dá)(n=10)

*：與NC組相比，P<0.05；#：與PCOS組相比，P<0.05。圖5 3組大鼠caspase-3 mRNA的表達(dá)比較

3 討論

多囊卵巢綜合征(PCOS)是內(nèi)分泌綜合征中的一種，主要特征為雄激素過高和無(wú)排卵[8]。PCOS的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前其T水平和LH水平過高，F(xiàn)SH水平過低，卵巢組織中出現(xiàn)大量的卵泡及由于間質(zhì)出現(xiàn)增生而導(dǎo)致的不排卵特征已形成共識(shí)。LH在正常情況下會(huì)和卵泡膜上的LH受體相結(jié)合，產(chǎn)生以T和雄烯二酮為主的雄激素[9]。FSH通過促進(jìn)竇前卵泡和其顆粒細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育，直至細(xì)胞成熟為止。同時(shí)FSH會(huì)結(jié)合顆粒細(xì)胞上的FSH受體，進(jìn)而讓雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。有研究顯示在PCOS患者體內(nèi)雌二醇和雌酮的水平均降低[10]。雖然目前PCOS的發(fā)病機(jī)制仍然存在較大的爭(zhēng)議，但激素的紊亂、慢性炎癥反應(yīng)已達(dá)成了學(xué)者們的共識(shí)，激素的紊亂和慢性炎癥反應(yīng)之間相互作用，嚴(yán)重影響著疾病的發(fā)生。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，和健康人相比，PCOS患者血清中的CRP含量顯著升高[11]。黃芩是常用的中藥之一，其性寒味苦，能清熱燥濕、瀉火解毒、止血，為清熱燥濕常用藥物。黃芩提取物能抑制炎性滲出，通過降低毛細(xì)血管通透性、抑制組織胺和乙酰膽堿的釋放等降低炎癥反應(yīng)造成的損傷。本文旨在研究PCOS大鼠的性激素水平和炎性因子含量的變化，并用黃芩苷進(jìn)行干預(yù)治療，分析黃芩苷對(duì)PCOS大鼠雌激素變化及CRP和caspase-3蛋白的影響。

本文建立PCOS大鼠模型，研究結(jié)果顯示PCOS組大鼠的體重和卵巢質(zhì)量均顯著高于NC組，干預(yù)后的HQG組均得到了明顯的抑制。和NC組相比較，PCOS組大鼠血清中LH、T和E2含量顯著升高，而性激素FSH的含量顯著低于NC組；HQG組大鼠的LH、T和E2均得到明顯的抑制，同時(shí)FSH的含量顯著得到提升，提示黃芩苷可能通過降低大鼠的體重，減少脂肪的累積，從而抑制血清中T的含量。PCOS屬于一種亞臨床的炎性反應(yīng)，和臨床上的急性或慢性的炎癥反應(yīng)所表現(xiàn)出的紅腫等不同，PCOS的發(fā)生沒有任何的身體癥狀[12]。亞臨床的炎性反應(yīng)一般會(huì)損傷全身的毛細(xì)血管內(nèi)皮，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣化，胰島素β細(xì)胞受到損傷的同時(shí)出現(xiàn)胰島素抵抗，讓卵巢發(fā)生損傷，導(dǎo)致多囊樣改變，進(jìn)而使激素的分泌出現(xiàn)異常。本研究發(fā)現(xiàn)PCOS組大鼠血清中炎性因子CRP的含量明顯升高，CRP在HQG組大鼠中得到了明顯的改善，提示黃芩苷可有效的降低PCOS中CRP的含量，同時(shí)還能改善大鼠卵巢的組織形態(tài)。黃芩是常用的清熱解毒中藥之一，其主要有效成分是為黃酮類化合物，尤其是其中的黃芩苷、黃芩素等，已被證明具有廣泛的藥理活性。除了傳統(tǒng)意義上的抗菌、抗感染、消炎、解熱、保肝之外，近年來對(duì)其抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用的研究日趨深入[13]。顧瓊瓊等[14]通過對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，黃芪苷能降低動(dòng)脈粥樣化大鼠血清中TAFI、hs-CRP以及IL-6炎性因子的表達(dá)，從而改善大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化。王敏等[15]通過對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，黃芩苷能降低血清中炎性因子CRP的含量，同時(shí)抑制腫瘤壞死蛋白的表達(dá)。

Caspase家族能有效的調(diào)控細(xì)胞的凋亡，也能對(duì)促細(xì)胞凋亡的分子進(jìn)行誘導(dǎo)[16]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡途徑下游的關(guān)鍵蛋白酶，正常情況下caspase-3一般以沒有活性的酶原形式存在，但出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)，就會(huì)被剪切為誘惑性的片段，從而介導(dǎo)著細(xì)胞的凋亡[17-18]。本研究顯示，caspase-3蛋白在PCOS組大鼠中高表達(dá)，可見PCOS組大鼠中有大量的顆粒細(xì)胞凋亡，由此提示caspase-3的級(jí)聯(lián)反應(yīng)可導(dǎo)致顆粒細(xì)胞大量的凋亡。經(jīng)過黃芩苷治療后的HQG組大鼠中caspase-3蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量都顯著降低，可見黃芩苷可顯著降低PCOS大鼠顆粒細(xì)胞的凋亡。黃芩苷對(duì)變態(tài)反應(yīng)有不同程度的抑制作用。由于黃芩具有很好的藥效和相對(duì)較低的毒性，在臨床上得到了越來越多的關(guān)注。靳楠楠等[19]對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)，其保護(hù)機(jī)制在于黃芩苷可降低Bcl-2和caspase-3蛋白的表達(dá)。周穎璐等[20]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可減少小鼠卵巢組織中caspase-3蛋白的表達(dá)，有效的拮抗卵巢出現(xiàn)的氧化損傷。

綜上，黃芩苷可增加血清中雌激素的表達(dá)，抑制炎性因子CRP表達(dá)，同時(shí)減少卵巢組織中caspase-3蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響多囊卵巢綜合征的發(fā)生、發(fā)展。