劉維華，鐘燕燕，鄭 洪

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是女性生殖系統(tǒng)中死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示，2018年，全球新確診出29.5萬(wàn)多例卵巢癌患者，超過(guò)18萬(wàn)名女性因該病死亡[1]。盡管手術(shù)切除聯(lián)合鉑類化療的治療方案取得了一定的治療效果，但由于該病早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已為伴有轉(zhuǎn)移晚期，總體治愈率仍然很低[2]。因此，探究影響卵巢癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制是有必要的。

卵巢是孕激素的主要靶器官，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[3]，口服避孕藥、妊娠(尤其多胎妊娠)及哺乳等可起到預(yù)防卵巢癌的作用。這些均表明孕激素對(duì)卵巢具有保護(hù)作用。FOXO1屬于叉頭框(Forkhead box,FOX)轉(zhuǎn)錄因子O亞家族的成員之一，是磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)與絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-rugulatedkinasea,ERK)等信號(hào)通路的共同下游分子[4]。而在腫瘤中，由于RAS、張力蛋白基因(Phosphatase and tensin homolog,PTEN)或PI3K等上游基因的突變，這些信號(hào)通路經(jīng)常處于異常激活狀態(tài)，均可使FOXO1發(fā)生磷酸化而失活，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[5]。FOXO1在人類多種腫瘤如肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、骨肉瘤等中表達(dá)降低，激活其表達(dá)可抑制腫瘤生長(zhǎng)，因此被認(rèn)為是一種重要的腫瘤抑制因子[6-9]。Diep等[10]研究表明，孕激素可通過(guò)孕激素受體B(Progesterone Receptor-B,PR-B)靶向FOXO1，誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制基因p21的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯于G0期，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞衰老。這提示在卵巢癌中，孕激素可通過(guò)FOXO1對(duì)卵巢癌起到抑制作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，在包括卵巢癌等許多實(shí)體腫瘤中均存在該通路的異常激活，其激活標(biāo)志信號(hào)為β-catenin表達(dá)的明顯升高[11]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在維持細(xì)胞干性和與PI3K/AKT通路的串?dāng)_中起著關(guān)鍵作用[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬使用FOXO1抑制劑AS1842856抑制FOXO1的表達(dá)活性，在體外通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用孕激素和AS1842856檢測(cè)其對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并結(jié)合Western blot檢測(cè)FOXO1和β-catenin的蛋白表達(dá)情況，探索孕激素在卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用機(jī)制是否與調(diào)節(jié)FOXO1-β-catenin有關(guān)，以期為卵巢癌的激素治療和靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人高級(jí)別漿液性卵巢癌HO-8910細(xì)胞株，購(gòu)于江蘇齊氏生物科技有限公司。BI胎牛血清購(gòu)于以色列Biological industries公司；孕激素購(gòu)于美國(guó)Med Chem Express公司；FOXO1抑制劑AS1842856購(gòu)于美國(guó)Selleck生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD Biosciences公司；兔抗人FOXO1單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔抗人β-catenin單克隆抗體購(gòu)于英國(guó)abcam公司；鼠抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)于武漢三鷹Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清，1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，于恒溫 37℃、5%CO2濃度、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HO-8910細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)均選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO-8910細(xì)胞進(jìn)行，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 CCK-8法分別檢測(cè)不同濃度孕激素和AS對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖的影響 為了明確孕激素和FOXO1抑制劑AS1842856(AS)對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞體外生長(zhǎng)情況的影響，并分別選擇一個(gè)適宜濃度進(jìn)行后續(xù)單獨(dú)或聯(lián)合加藥實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)參照前期研究設(shè)定的孕激素濃度范圍及相關(guān)參考文獻(xiàn)，選用不同濃度(0、2.5、5、10、20 μmol/L)的孕激素和不同濃度(0、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L)的AS分別作用于卵巢癌HO-8910細(xì)胞24、48、72 h，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。收集制備HO-8910細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/mL)，接種于96孔板中，100 μL/孔。待細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度孕激素和含不同濃度AS的完全培養(yǎng)基，分別以0 μmol/L的孕激素組和0 μmol/L的AS組為對(duì)照組，同時(shí)設(shè)置空白組，每組3個(gè)復(fù)孔。分別作用24、48、72 h后，加入100 μL/孔含10% CCK-8的檢測(cè)試劑，培養(yǎng)箱中溫育2～3 h，測(cè)定450 nm處的吸光度值(Optical density value，OD)。細(xì)胞存活率=(加藥組OD值﹣空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3 孕激素和AS單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)各組HO-8910細(xì)胞的影響

1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分4組：對(duì)照組(等量不含藥物的完全培養(yǎng)基)、孕激素(10 μmol/L)組、AS(1 μmol/L)組、AS(1 μmol/L)+孕激素(10 μmol/L)組，作用48 h。

1.2.3.2 CCK-8法檢測(cè)各組HO-8910細(xì)胞的增殖情況 除實(shí)驗(yàn)分組的藥物作用濃度和作用時(shí)間不同外，其余步驟均同1.2.2。

1.2.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HO-8910細(xì)胞的遷移和侵襲情況 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell小室的下室分別加入600 μL/孔的含10%血清的各組含藥培養(yǎng)基，上室加入100 μL/孔的不含血清的各組含藥細(xì)胞懸液(5×105個(gè)/mL)，每組3個(gè)復(fù)孔，作用48 h。固定，染色，倒置顯微鏡觀察拍照并隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：除用50 μL/孔的Matrigel基質(zhì)膠包被膜上室面并水化外，其余步驟均與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.3.4 Western blot檢測(cè)各組HO-8910細(xì)胞的FOXO1和β-catenin蛋白表達(dá)情況 分別收集各組藥物作用48 h后的細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解40 min，離心取上清，BCA法蛋白定量。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，蛋白上樣20 μg/孔，電泳，切膠，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗FOXO1(1∶1 000)、β-catenin(1∶7 500)、GAPDH(1∶1 000)，4℃過(guò)夜。次日，TBST充分洗膜。室溫孵育二抗1.5 h，TBST充分洗膜。滴加ECL發(fā)光液，曝光顯影。Image J軟件分析圖像。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的孕激素和AS分別對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖的影響 不同濃度(0、2.5、5、10、20 μmol/L)的孕激素和不同濃度(0、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L)的AS分別作用于HO-8910細(xì)胞24、48、72 h后，同一作用時(shí)間不同濃度之間的細(xì)胞存活率比較，分別以0 μmol/L孕激素組和0 μmol/L AS組為對(duì)照組，同一濃度不同作用時(shí)間之間的細(xì)胞存活率比較均以0 h的細(xì)胞存活率為對(duì)照，設(shè)為100.00%。結(jié)果顯示：(1)與對(duì)照組相比，除2.5 μmol/L孕激素作用24 h組無(wú)顯著差異(P>0.05)外，其余各組均顯示抑制作用(P<0.05)。孕激素濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越強(qiáng)。(2)與對(duì)照組相比，除4 μmol/L AS作用48 h，2 μmol/L AS作用72 h，4 μmol/L AS作用72 h時(shí)表現(xiàn)為抑制作用外，其余不同作用時(shí)間不同濃度的AS對(duì)HO-8910細(xì)胞均具有促進(jìn)作用(P<0.05)，且在AS濃度為1 μmol/L時(shí)，促進(jìn)作用最強(qiáng)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，10 μmol/L孕激素作用48 h可明顯抑制HO-8910細(xì)胞的增殖，1 μmol/L AS作用48 h可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，采用10 μmol/L孕激素和1 μmol/L AS單獨(dú)或聯(lián)合作用48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)表1)。

表1 不同濃度的孕激素和AS分別對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖的影響

2.2 孕激素和AS單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，孕激素組細(xì)胞增殖活性減低(P<0.05)，AS組細(xì)胞增殖活性升高(P<0.05)，AS+孕激素組細(xì)胞增殖活性減低(P<0.05)。與孕激素組相比，AS+孕激素組細(xì)胞增殖活性升高(P<0.05)；與AS組相比，AS+孕激素組細(xì)胞增殖活性減低(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

*：該組與對(duì)照組比較，P<0.05；#：該組與孕激素組、AS組比較，P均<0.05。圖1 各組HO-8910細(xì)胞的增殖情況

2.3 孕激素和AS單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞遷移和侵襲的影響 將4組進(jìn)行單因素方差分析，4組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4組均數(shù)不完全相等(F=76.07,P<0.05),再進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較。與對(duì)照組相比，孕激素組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少(P<0.05)，AS組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量增多(P<0.05)，AS+孕激素組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少(P<0.05)。與孕激素組相比，AS+孕激素組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量增多(P<0.05)；與AS組相比，AS+孕激素組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少(P<0.05,見(jiàn)圖2～3)。

*：該組與對(duì)照組比較，P<0.05；#：該組與孕激素組、AS組比較，P均<0.05。圖3 各組HO-8910細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量

2.4 孕激素和AS單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞FOXO1和β-catenin蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，孕激素組FOXO1蛋白表達(dá)增多(P<0.05)，β-catenin蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；AS組FOXO1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，β-catenin蛋白表達(dá)增多(P<0.05)；AS+孕激素組FOXO1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，β-catenin蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。與孕激素組相比，AS+孕激素組的FOXO1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，β-catenin蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。與AS組相比，AS+孕激素組的FOXO1蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，β-catenin蛋白表達(dá)減少(P<0.05，見(jiàn)圖4～5)。

圖4 各組HO-8910細(xì)胞中FOXO1和β-catenin的蛋白表達(dá)情況

A： HO-8910細(xì)胞中FOXO1；B：β-catenin的蛋白相對(duì)表達(dá)量；*：該組與對(duì)照組相比，P<0.05；&：該組與孕激素組相比，P<0.05；#：該組與孕激素組、AS組相比，P均<0.05。圖5 各組HO-8910細(xì)胞中FOXO1和β-catenin的蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，孕激素濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖活性的抑制作用越強(qiáng)。這與沈倩倩等[13]的孕激素能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果相符。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[14-15]，F(xiàn)OXO1抑制劑AS在1 μmol/L時(shí)可顯著抑制FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性及蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，1 μmol/L AS作用48 h可明顯抑制HO-8910細(xì)胞中FOXO1的蛋白表達(dá)，與之相符。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果及聯(lián)合用藥的需要，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)擬用10 μmol/L孕激素及1 μmol/L AS單獨(dú)或聯(lián)合作用48 h檢測(cè)其對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μmol/L孕激素可以顯著抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，這與傅優(yōu)等[16]研究結(jié)果相符。Jeon等[17]研究也顯示孕激素在卵巢癌細(xì)胞中具有抗增殖和抗轉(zhuǎn)移的作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用1 μmol/L AS抑制FOXO1后，卵巢癌HO-8910細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和侵襲能力均增強(qiáng)，這表明抑制FOXO1后可明顯降低FOXO1的腫瘤抑制作用。Paik等[18]關(guān)于基因工程小鼠模型(GEMMs)的研究表明，F(xiàn)OXO1，F(xiàn)OXO3和FOXO4的所有6個(gè)等位基因完全喪失會(huì)顯著誘導(dǎo)以胸腺淋巴瘤和血管瘤為特征的進(jìn)行性癌癥，同樣說(shuō)明FOXO1失活可消除其腫瘤抑制功能，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μmol/L孕激素作用于卵巢癌HO-8910細(xì)胞后，F(xiàn)OXO1的蛋白表達(dá)上調(diào)，表明孕激素可能具有誘導(dǎo)FOXO1蛋白表達(dá)的作用。Yin等[19]研究表明，孕激素可通過(guò)與PRs結(jié)合，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，上調(diào)核FOXO1的表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展，與本研究觀點(diǎn)相符。與只加入10 μmol/L孕激素相比，當(dāng)加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，F(xiàn)OXO1蛋白表達(dá)減少，卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力都相對(duì)增強(qiáng)。該結(jié)果表明，孕激素可能通過(guò)FOXO1對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲發(fā)揮抑制作用。與Diep等[10]的孕激素可通過(guò)PR-B靶向FOXO1，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞衰老的研究結(jié)果相符。這提示在卵巢癌中，孕激素可通過(guò)FOXO1對(duì)卵巢癌起到抑制作用。與只加入1 μmol/L AS相比，加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，F(xiàn)OXO1蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力都相對(duì)減低，同時(shí)低于對(duì)照組，說(shuō)明FOXO1抑制劑AS對(duì)FOXO1活性表達(dá)的抑制作用強(qiáng)于孕激素對(duì)FOXO1的誘導(dǎo)作用，同時(shí)孕激素可能還通過(guò)其他機(jī)制抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。例如，有研究表明，孕激素可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT途徑增加nm23-H1表達(dá)并抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲[17]；孕激素可通過(guò)降低粘著斑激酶(FAK)和Src磷酸化，抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移侵襲[20]等，可見(jiàn)孕激素抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，多種機(jī)制參與了卵巢癌進(jìn)展。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路是與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的一條信號(hào)通路，在許多腫瘤中激活表達(dá)，β-catenin是該信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μmol/L孕激素作用于卵巢癌HO-8910細(xì)胞后，β-catenin的蛋白表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明孕激素可能具有抑制β-catenin蛋白表達(dá)的作用。Nagendra等[21]的研究表明孕激素可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)抑制小鼠模型中漿液性卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，這與本研究結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入1 μmol/L AS后，β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào)，表明在卵巢癌HO-8910細(xì)胞中抑制FOXO1可上調(diào)β-catenin的蛋白表達(dá)。Ling等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1過(guò)表達(dá)可抑制CCND1的表達(dá)抑制胰腺癌PDAC細(xì)胞周期從G0/G1到S的轉(zhuǎn)變，而CCND1是Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶標(biāo)，并表明FOXO1的下調(diào)導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性增強(qiáng)，促進(jìn)PDAC細(xì)胞增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。Lin等[22]的研究顯示，MiR-5188可直接靶向降低FOXO1的蛋白表達(dá)水平誘導(dǎo)β-catenin的激活，介導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移，化學(xué)耐藥和c-Jun信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Zhang等[23]的研究結(jié)果表明，MiR-27a可通過(guò)靶向FOXO1活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的EMT，均與本研究結(jié)果相符。與只加入1 μmol/L AS組相比，加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，β-catenin的蛋白表達(dá)量減少，說(shuō)明孕激素還可能通過(guò)其它機(jī)制抑制卵巢癌HO-8910細(xì)胞β-catenin的蛋白表達(dá)。例如，F(xiàn)eng等[24]研究顯示，孕激素可通過(guò)調(diào)節(jié)H19和miR-152的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)改善子宮內(nèi)膜息肉癥。與只加入10 μmol/L孕激素相比，加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，β-catenin的蛋白表達(dá)量增多，說(shuō)明抑制FOXO1后，孕激素對(duì)β-catenin蛋白表達(dá)的抑制作用減弱，孕激素可能通過(guò)上調(diào)FOXO1抑制β-catenin的蛋白表達(dá)。Wang 等[25]研究表明，孕激素可通過(guò)誘導(dǎo)DKK1和FOXO1的表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，從而起到維持子宮內(nèi)膜穩(wěn)態(tài)，抑制子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展的作用，與本研究結(jié)果相似。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，孕激素對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲均具有抑制作用，該作用可能是孕激素通過(guò)促進(jìn)FOXO1進(jìn)而抑制β-catenin的蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。然而，本實(shí)驗(yàn)在一株細(xì)胞系中進(jìn)行，結(jié)果相對(duì)較單一，仍需進(jìn)一步增加細(xì)胞系或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)孕激素受體有PR-A、PR-B、PGRMC1、PGRMC2等類型，它們?cè)谠屑に貙?duì)卵巢癌細(xì)胞發(fā)揮作用中的作用及其機(jī)制如何仍有待探索，以更好地為卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究和臨床治療提供理論基礎(chǔ)。