申松松，王 菲，耿懷民，孟麟碩，馮 燕，王海燕

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000）

作為世界上最重要的糧食作物之一，小麥的產(chǎn)量受多個(gè)方面的影響，其中對產(chǎn)量影響最大的是小麥病害。小麥在生長發(fā)育過程中葉部病害主要有條銹病、葉銹病和白粉病。近幾年，由于天氣等各方面的原因，由小麥葉銹菌（Puccinia triticina, Pt）引起的小麥葉銹病發(fā)病較為嚴(yán)重，嚴(yán)重時(shí)可造成30%～50%的減產(chǎn)[1]。小麥葉銹病為氣傳性病害，傳播迅速、小種進(jìn)化速度快，生產(chǎn)實(shí)踐中常用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，雖然見效快，但是長期使用化學(xué)農(nóng)藥給生態(tài)環(huán)境帶來了巨大壓力，且國家推行雙減政策限制了化學(xué)農(nóng)藥的使用。因此，抗病品種的使用是防治小麥葉銹病最安全、有效的方法，而這又依賴于小麥抗葉銹病品種的選育、小麥與葉銹菌相互作用關(guān)系的研究，從基因?qū)用鎭硌芯啃←湹姆烙磻?yīng)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)優(yōu)良的基因并轉(zhuǎn)入小麥中進(jìn)行推廣，對全國小麥抗銹病品種的合理布局和對小麥銹病的持續(xù)控制具有重要的理論指導(dǎo)意義。

為了抵御病菌的持續(xù)侵入，植物在受到病菌侵染時(shí)會產(chǎn)生一系列防御反應(yīng)，例如活性氧的爆發(fā)（Oxidative burst）[2]、過敏性壞死反應(yīng)（Hypersensitive reaction, HR）、系統(tǒng)獲得性抗性（System acquired resistant, SAR）以及病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis-Related Proteins, PRs）的產(chǎn)生。其中病程相關(guān)蛋白PR1（pathogenesis related PR1 proteins, PR1）是發(fā)現(xiàn)最早的一類重要的病程相關(guān)蛋白（PR）。PR1家族的生物活性未知，最早是在煙草中發(fā)現(xiàn)，被證實(shí)具有限制真菌入侵、抑制病毒擴(kuò)散和增強(qiáng)植物抵御逆境脅迫等功能，在植物的抗病防御反應(yīng)過程中起到很大的作用[3]。Bozbuga Refik[4]研究發(fā)現(xiàn)水楊酸（Salicylic acid, SA）可以通過上調(diào)PR1基因表達(dá)提高植物的防御能力，影響線蟲對植物的寄生。Alexander等[5]發(fā)現(xiàn)PR1-a基因表達(dá)增加了煙草對2種卵菌侵染的耐受性。Sarowar等[6]將辣椒中的PR1基因CaBPR1在煙草中超量表達(dá)，結(jié)果表明該基因不僅增強(qiáng)了其對重金屬脅迫的抗性，還能增強(qiáng)煙草對多種病菌的抗性。通過體外抗菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硬粒小麥中的TdPR1.2對禾谷鐮孢和葉枯病菌具有一定的抑制效果[7]。小麥根腐病菌能夠刺激小麥抗病品 種 中PR1、thaumatin-like protein(TLP)、β-1,3-葡聚糖的基因的表達(dá)顯著增加[8]。

本研究前期獲得了小麥TaPR1基因（Genbank登錄號：HQ848391.1），并明確了葉銹菌誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TaPR1通過與類甜蛋白TaTLP1互作增強(qiáng)了小麥對葉銹病的抗病能力[9]。王菲等[10]利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建重組載體TaTLP1-pEarleyGate 103，使用 GFP-Trap 技術(shù)借助煙草異源表達(dá)TaTLP1篩選到大量與TaTLP1互作的蛋白。本研究擬采用GFP-Trap和酵母雙雜交（Yeast two-hybrid, Y2H）2種技術(shù)篩選與TaPR1蛋白互作的靶標(biāo)，為TaPR1參與小麥與葉銹菌互作的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

質(zhì)粒及菌株：pENTR/D-TOPO（Invitrogen）、pEarleyGate 103、pCamA、pGBKT7、pGADT7、Y187、Y2HGold、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。

植物材料：本氏煙草、‘中國春’小麥。

1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶MluI（TaKaRa）、SD/-Leu（普因特）、SD/-Trp/-Leu（普因特）和SD/-Trp/-Leu/-Ade/His（普因特）、植物蛋白提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）、40%葡萄糖、2%硫酸腺嘌呤、DMSO、乙酰丁香酮、MES、PEG/LiAc轉(zhuǎn)化液、PEG/LiAc制備液、兔抗GFP一抗（索萊寶）、羊抗兔HRP二抗（索萊寶）、蛋白marker（賽默飛）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 利用primer-premier 5.0軟件設(shè)計(jì)TaPR1用于Gateway克隆的入門載體引物；根據(jù)TaPR1基因序列及pGBKT7載體多克隆位點(diǎn)特征設(shè)計(jì)特異引物，用于Y2H篩選。

1.3.2 pEarleyGate 103-TaPR1△sp重組載體的構(gòu)建利用設(shè)計(jì)的TaPR1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得刪除信號肽的TaPR1序列（TaPR1△sp），將得到的PCR產(chǎn)物純化后用于配制連接體系，構(gòu)建入門重組載體pENTR/D-TOPO-TaPR1△sp，入門載體構(gòu)建成功后，將其與帶有GFP標(biāo)簽的Gateway載體pEarleyGate 103連接，測序成功后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 TaPR1蛋白的異源表達(dá)與檢測 將重組載體pEarleyGate 103-TaPR1△sp轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，利用異源表達(dá)技術(shù)在煙草中表達(dá)TaPR1蛋白，注射時(shí)選擇6～8周齡的本氏煙草，培養(yǎng)48 h，觀察熒光確認(rèn)蛋白表達(dá)，提取注射葉片蛋白，分裝后置于 -20 ℃保存[10]。利用 Western blot技術(shù)檢測融合蛋白的表達(dá)，按1:1 000的比例稀釋一抗和二抗，膜上孵育融合蛋白，孵育結(jié)束，洗膜后進(jìn)行膜上曝光，檢測蛋白表達(dá)結(jié)果。

1.3.4 利用GFP-Trap技術(shù)釣取TaPR1互作靶標(biāo) 根據(jù)Chromotek公司GFP-Trap試劑盒的說明書進(jìn)行操作[10]，Western blot檢測無誤后，將純化后的蛋白泳道切下來，送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3.5 酵母雙雜交文庫構(gòu)建與篩選 取接種小麥葉銹菌后第1、4、6、8和14天的小麥葉片，采用Trizol方法提取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RNA，等量混合。利用 MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System 構(gòu)建酵母雙雜交文庫（委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成）。通過稀釋涂布法計(jì)算文庫滴度；挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫片段長度與重組率。酵母文庫滴度（CFU/mL）=平板克隆數(shù)量/涂板體積×稀釋倍數(shù)。將前期構(gòu)建成功的誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-TaPR1與酵母文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)中，均勻涂布在2種篩選培養(yǎng)基 SD（-Trp/-Leu）和 SD（-Trp/-Leu/-Ade/His）上，篩選陽性克隆。選取正常生長的單克隆提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化測序。將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gateway重組載體pEarleyGate 103-TaPR1△sp的成功構(gòu)建

利用表1的TaPR1-Gateway引物擴(kuò)增不帶信號肽的TaPR1（TaPR1△sp）基因，將TaPR1△sp連接到Gateway入門載體pENTR/D-TOPO上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，檢測到插入片段大小為423 bp（圖1-A），測序證明序列正確，說明成功獲得pENTR/D-TOPOTaPR1△sp重組載體。在此基礎(chǔ)上，以限制性內(nèi)切酶Mlu I酶切 pENTR/D-TOPO-TaPR1△sp重組載體，將純化后的酶切產(chǎn)物在LR酶的作用下與終載體pEarleyGate 103連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，檢測到插入片段大小為423 bp（見圖1-B），測序結(jié)果說明序列正確，證明終載體pEarleyGate 103-TaPR1△sp構(gòu)建成功。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers for PCR amplification

圖1 重組載體pEarleyGate103-TaPR1△sp 的構(gòu)建Fig 1 Construction of recombinant vector pEarleyGate103-TaPR1△sp

2.2 TaPR1蛋白的表達(dá)檢測

由于pEarleyGate 103載體中的GFP-tag位于插入位點(diǎn)attR1和attR2之后，pEarleyGate 103空載體無法在煙草細(xì)胞中檢測到GFP基因的表達(dá)，因此本試驗(yàn)選用pCamA空載（帶有GFP熒光）作為陽性對照（見圖2）。

圖2 TaPR1蛋白的異源表達(dá)Fig.2 Heterologous expression of TaPR1 protein

熒光顯微鏡觀察可見，陽性對照組pCamA中細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁中均可以檢測到GFP發(fā)出的綠色熒光；在實(shí)驗(yàn)組pEarleyGate103-TaPR1△sp中可以清楚地看到GFP綠色熒光出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)，證明pEarleyGate103-TaPR1△sp成功在煙草中表達(dá)，可以用于后續(xù)試驗(yàn)（見圖2）。

2.3 利用 GFP-Trap 技術(shù)釣取與TaPR1互作的蛋白

收集成功表達(dá)的煙草葉片，提取總蛋白，GFP標(biāo)簽大小為26 kD，TaPR1蛋白預(yù)期大小為17 kD，所以融合蛋白大小應(yīng)為43 kD。SDS-PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，蛋白條帶清晰且主帶明顯，滿足預(yù)期要求（圖3-A）。麗春紅染色結(jié)果顯示，在40～55 kD之間可見清晰的蛋白條帶，表明轉(zhuǎn)膜成功（圖3-B）。經(jīng)GFP一抗和二抗雜交，曝光30 s后，在40～55 kD出現(xiàn)了蛋白條帶（圖3-C），與預(yù)期大小一致，說明TaPR1在煙草中成功表達(dá)，可以繼續(xù)進(jìn)行GFP-Trap試驗(yàn)。

圖3 TaPR1蛋白的異源表達(dá)及GFP-Trap檢測Fig.3 Heterologous expression of TaPR1 protein and detection of GFP-Trap

將吸附了TaPR1純蛋白液的GFP-Trap珠子經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，用考馬斯亮藍(lán)染液染色，對比2條泳道中蛋白條帶，發(fā)現(xiàn) “+”和“-” 泳道在50 kD處左右有差異條帶，說明此處可能有與TaPR1互作的寄主中蛋白（圖3-D）。

2.4 TaPR1互作蛋白的質(zhì)譜分析

將在煙草中表達(dá)無誤的TaPR1蛋白通過GFPTrap Beads，獲得的蛋白洗脫液經(jīng)北京華大蛋白研發(fā)中心質(zhì)譜分析，從中挑選出了研究價(jià)值較大的蛋白進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)譜分析共獲得1 966個(gè)蛋白，通過蛋白背景、蛋白綜合分?jǐn)?shù)、蛋白出現(xiàn)次數(shù)進(jìn)行篩選，篩選出了 Glutamine synthetase、zinc finger protein CONSTANS-LIKE 5-like、stress protein DDR48-like、Osmotic和非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白家族等一系列與抗病相關(guān)的蛋白（見表2）。

表2 與TaPR1相互作用的蛋白Table 2 Proteins of interacting with TaPR1

2.5 小麥Y2H文庫的質(zhì)量鑒定

將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Y187酵母菌株，按1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000 稀釋后取 100 μL 涂布于SD/-Leu平板上，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，在1∶10 000稀釋倍數(shù)下約有500個(gè)單菌落，計(jì)算可得滴度為5.0×107cells/mL。為了檢測構(gòu)建的酵母文庫的完整性，隨機(jī)挑選24個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示陽性克隆23個(gè)，空載1個(gè)，重組率為95.8%，并且23個(gè)陽性克隆片段長度均在1 000～ 2 000 bp之間（見圖4）。由此說明，構(gòu)建的酵母文庫完整性及覆蓋度較好，可以用于后續(xù)的篩庫試驗(yàn)。

圖4 文庫重組率、插入片段檢測結(jié)果Fig.4 Recombination rate of library and detection results of inserted fragments

2.6 酵母雙雜交技術(shù)篩選與TaPR1互作的蛋白

利用Y2H技術(shù)共篩選到28個(gè)陽性克隆。經(jīng)NCBI工具分析后發(fā)現(xiàn)得到的陽性克隆包含11個(gè)蛋白，其中寄主中蛋白9個(gè)，菌中蛋白2個(gè)（見表3）。寄主中出現(xiàn)次數(shù)最多的為 The cystathionine betasynthase（CBS pair）domains，共出現(xiàn)了 6次；菌中互作靶標(biāo)出現(xiàn)次數(shù)最多的為Pt_69，出現(xiàn)了6次。與GFP-Trap篩選結(jié)果相比較，Y2H技術(shù)獲得的互作靶標(biāo)中同樣出現(xiàn)了Glutamine synthetase、Cytochrome b6、Stress protein這 3類蛋白，這 3類蛋白都與植物的非生物脅迫或生物脅迫有關(guān)系，后續(xù)本課題組將重點(diǎn)對這3類蛋白進(jìn)行互作驗(yàn)證。

表3 與TaPR1相互作用的蛋白Table 3 Proteins of interacting with TaPR1

3 討論與結(jié)論

Gateway技術(shù)不需要進(jìn)行傳統(tǒng)的酶切連接等步驟，大大簡化了基因克隆的步驟。本試驗(yàn)通過Gateway克隆技術(shù)將TaPR1基因連接到帶有GFP標(biāo)簽的pEarleyGate 103上。在此基礎(chǔ)上，借助農(nóng)桿菌侵染煙草葉片異源表達(dá)TaPR1蛋白，使用GFP-Trap技術(shù)快速獲得了與TaPR1互作的寄主中的蛋白。該方法快速方便，大大減少了獲取互作蛋白的步驟，但存在一定的局限性，利用煙草異源表達(dá)蛋白進(jìn)行互作篩選需要選擇結(jié)構(gòu)高度保守的誘餌蛋白，且會篩選出大量以煙草為背景的蛋白，對蛋白序列的分析與選擇造成干擾。張平平等[11]利用GFP-Trap篩選到了大量與擬南芥Hippo（Hpo）的同功能基因SIK1可能互作的蛋白，為SIK1的功能研究提供了線索。Guillaume等[12]研究結(jié)果表明GFP-Trap技術(shù)可以更全面的篩選到與誘餌蛋白互作的靶標(biāo)。而Ulrich等人的研究結(jié)果表明GFP-Trap結(jié)合GFP抗體的時(shí)間比普通抗體結(jié)合的時(shí)間快5～30 min[13]。

目前除了使用GFP-Trap技術(shù)獲得互作蛋白以外，GST-Pull down與酵母雙雜交技術(shù)也是常用的篩選互作蛋白的方法。其中酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用更為廣泛，即使蛋白瞬時(shí)表達(dá)或者表達(dá)微弱也能使用該技術(shù)進(jìn)行互作蛋白的篩選[14]。鄒禹等[15]使用酵母雙雜交技術(shù)，挖掘水稻OsRPK1胞內(nèi)互作蛋白，闡明了OsRPK1參與高鹽脅迫的分子機(jī)制。Qi等[16]以PstGSRE1為誘餌，以小麥條銹菌感染的小麥葉片為材料構(gòu)建酵母雙雜交文庫，從中篩選出了命名為TaLOL的參與ROX過程的基因，解析了該基因通過破壞TaLOL的定位來阻止其發(fā)揮功能。本課題組前期已克隆到TaPR1基因并將其連接到pGBKT7載體上，通過酵母雙雜交篩庫篩選到了寄主中的一些蛋白，也篩選到了菌中具有致病功能的蛋白。酵母雙雜交篩選過程中會出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象，影響互作蛋白的篩選[14]。

綜合上述，本研究嘗試同時(shí)利用2種方法篩選更具有說服力，通過細(xì)胞外GFP-Trap篩選和細(xì)胞內(nèi)酵母雙雜交篩選共同篩選到了寄主中的谷氨酰氨合成酶（Glutamine synthetase）、細(xì)胞色素b6（Cytochrome b6）、應(yīng)激蛋白（Stress protein），三類蛋白均具有抗脅迫或抗病相關(guān)功能。水稻中谷氨酰半胱氨酸合成酶可以減少由于代謝產(chǎn)物脅迫和環(huán)境而引發(fā)的氧自由基的積累，從而消除氧自由基對植物機(jī)體本身的傷害作用[17]。王嘉文等[18]發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺合成酶在氮同化過程中起到了重要作用，是氮素由無機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)氮的關(guān)鍵催化酶，而氮素是植物生長發(fā)育過程中不可或缺的元素。Bao等[19]研究結(jié)果表明過表達(dá)谷氨酰胺合成酶可以提高水稻抗鹽脅能力。細(xì)胞色素復(fù)合物可以通過調(diào)節(jié)光系統(tǒng)Ⅱ過程中相關(guān)蛋白磷酸化間接參與植物的抗逆境生理過程[20]。細(xì)胞色素b6f復(fù)合體還原型鐵硫蛋白前體是由核中的PetC基因編碼的，甘蔗中的該基因可以響應(yīng)強(qiáng)光[21]、干旱脅迫等非生物脅迫，同時(shí)也有報(bào)道稱PetC基因受到了小麥白粉菌的誘導(dǎo)表達(dá)[22]。應(yīng)激蛋白是一類廣泛存在的與抗逆相關(guān)的蛋白，響應(yīng)干旱脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫等。張宇萍等[23]研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫可以激活玉米中鈣依賴型蛋白激（CDPKs），而CDPKs在植物適應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。干旱脅迫蛋白參與代謝物和能量前體合成、核酸代謝、氧化還原輔酶代謝過程、蛋白翻譯調(diào)控、細(xì)胞蛋白質(zhì)及氨基酸代謝過程的調(diào)控、半胱氨酸的生物合成及代謝過程和光合作用等[24]。

TaPR1蛋白可能與上述3種蛋白存在互作關(guān)系，課題組后續(xù)將對這3種蛋白是否與TaPR1互作進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，使用酵母雙雜交一對一回復(fù)驗(yàn)證、雙分子熒光互補(bǔ)以及免疫共沉淀等技術(shù)進(jìn)行互作的真實(shí)性驗(yàn)證，明確互作的意義，探索TaPR1所參與的信號通路以及抗病相關(guān)的互作機(jī)制?？傊?，本研究使用2種方法進(jìn)行TaPR1互作蛋白的篩選，既減少了酵母雙雜交篩庫假陽性的數(shù)量，又彌補(bǔ)了GFPTrap技術(shù)無法篩選菌中靶標(biāo)的劣勢，巧妙地將2種技術(shù)結(jié)合篩選寄主以及菌中靶標(biāo)，為篩選互作靶標(biāo)提供了新思路，為明確TaPR1參與小麥抗葉銹病防御機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。