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利用GFP-Trap和酵母雙雜交技術(shù)篩選TaPR1互作靶標(biāo)

2021-11-10 13:11:38申松松耿懷民孟麟碩王海燕
關(guān)鍵詞:雙雜交文庫靶標(biāo)

申松松,王 菲,耿懷民,孟麟碩,馮 燕,王海燕

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心,河北 保定 071000)

作為世界上最重要的糧食作物之一,小麥的產(chǎn)量受多個(gè)方面的影響,其中對產(chǎn)量影響最大的是小麥病害。小麥在生長發(fā)育過程中葉部病害主要有條銹病、葉銹病和白粉病。近幾年,由于天氣等各方面的原因,由小麥葉銹菌(Puccinia triticina, Pt)引起的小麥葉銹病發(fā)病較為嚴(yán)重,嚴(yán)重時(shí)可造成30%~50%的減產(chǎn)[1]。小麥葉銹病為氣傳性病害,傳播迅速、小種進(jìn)化速度快,生產(chǎn)實(shí)踐中常用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治,雖然見效快,但是長期使用化學(xué)農(nóng)藥給生態(tài)環(huán)境帶來了巨大壓力,且國家推行雙減政策限制了化學(xué)農(nóng)藥的使用。因此,抗病品種的使用是防治小麥葉銹病最安全、有效的方法,而這又依賴于小麥抗葉銹病品種的選育、小麥與葉銹菌相互作用關(guān)系的研究,從基因?qū)用鎭硌芯啃←湹姆烙磻?yīng)機(jī)制,發(fā)現(xiàn)優(yōu)良的基因并轉(zhuǎn)入小麥中進(jìn)行推廣,對全國小麥抗銹病品種的合理布局和對小麥銹病的持續(xù)控制具有重要的理論指導(dǎo)意義。

為了抵御病菌的持續(xù)侵入,植物在受到病菌侵染時(shí)會產(chǎn)生一系列防御反應(yīng),例如活性氧的爆發(fā)(Oxidative burst)[2]、過敏性壞死反應(yīng)(Hypersensitive reaction, HR)、系統(tǒng)獲得性抗性(System acquired resistant, SAR)以及病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-Related Proteins, PRs)的產(chǎn)生。其中病程相關(guān)蛋白PR1(pathogenesis related PR1 proteins, PR1)是發(fā)現(xiàn)最早的一類重要的病程相關(guān)蛋白(PR)。PR1家族的生物活性未知,最早是在煙草中發(fā)現(xiàn),被證實(shí)具有限制真菌入侵、抑制病毒擴(kuò)散和增強(qiáng)植物抵御逆境脅迫等功能,在植物的抗病防御反應(yīng)過程中起到很大的作用[3]。Bozbuga Refik[4]研究發(fā)現(xiàn)水楊酸(Salicylic acid, SA)可以通過上調(diào)PR1基因表達(dá)提高植物的防御能力,影響線蟲對植物的寄生。Alexander等[5]發(fā)現(xiàn)PR1-a基因表達(dá)增加了煙草對2種卵菌侵染的耐受性。Sarowar等[6]將辣椒中的PR1基因CaBPR1在煙草中超量表達(dá),結(jié)果表明該基因不僅增強(qiáng)了其對重金屬脅迫的抗性,還能增強(qiáng)煙草對多種病菌的抗性。通過體外抗菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硬粒小麥中的TdPR1.2對禾谷鐮孢和葉枯病菌具有一定的抑制效果[7]。小麥根腐病菌能夠刺激小麥抗病品 種 中PR1、thaumatin-like protein(TLP)、β-1,3-葡聚糖的基因的表達(dá)顯著增加[8]。

本研究前期獲得了小麥TaPR1基因(Genbank登錄號:HQ848391.1),并明確了葉銹菌誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TaPR1通過與類甜蛋白TaTLP1互作增強(qiáng)了小麥對葉銹病的抗病能力[9]。王菲等[10]利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建重組載體TaTLP1-pEarleyGate 103,使用 GFP-Trap 技術(shù)借助煙草異源表達(dá)TaTLP1篩選到大量與TaTLP1互作的蛋白。本研究擬采用GFP-Trap和酵母雙雜交(Yeast two-hybrid, Y2H)2種技術(shù)篩選與TaPR1蛋白互作的靶標(biāo),為TaPR1參與小麥與葉銹菌互作的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

質(zhì)粒及菌株:pENTR/D-TOPO(Invitrogen)、pEarleyGate 103、pCamA、pGBKT7、pGADT7、Y187、Y2HGold、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。

植物材料:本氏煙草、‘中國春’小麥。

1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶MluI(TaKaRa)、SD/-Leu(普因特)、SD/-Trp/-Leu(普因特)和SD/-Trp/-Leu/-Ade/His(普因特)、植物蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)、40%葡萄糖、2%硫酸腺嘌呤、DMSO、乙酰丁香酮、MES、PEG/LiAc轉(zhuǎn)化液、PEG/LiAc制備液、兔抗GFP一抗(索萊寶)、羊抗兔HRP二抗(索萊寶)、蛋白marker(賽默飛)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 利用primer-premier 5.0軟件設(shè)計(jì)TaPR1用于Gateway克隆的入門載體引物;根據(jù)TaPR1基因序列及pGBKT7載體多克隆位點(diǎn)特征設(shè)計(jì)特異引物,用于Y2H篩選。

1.3.2 pEarleyGate 103-TaPR1△sp重組載體的構(gòu)建利用設(shè)計(jì)的TaPR1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得刪除信號肽的TaPR1序列(TaPR1△sp),將得到的PCR產(chǎn)物純化后用于配制連接體系,構(gòu)建入門重組載體pENTR/D-TOPO-TaPR1△sp,入門載體構(gòu)建成功后,將其與帶有GFP標(biāo)簽的Gateway載體pEarleyGate 103連接,測序成功后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 TaPR1蛋白的異源表達(dá)與檢測 將重組載體pEarleyGate 103-TaPR1△sp轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中,利用異源表達(dá)技術(shù)在煙草中表達(dá)TaPR1蛋白,注射時(shí)選擇6~8周齡的本氏煙草,培養(yǎng)48 h,觀察熒光確認(rèn)蛋白表達(dá),提取注射葉片蛋白,分裝后置于 -20 ℃保存[10]。利用 Western blot技術(shù)檢測融合蛋白的表達(dá),按1:1 000的比例稀釋一抗和二抗,膜上孵育融合蛋白,孵育結(jié)束,洗膜后進(jìn)行膜上曝光,檢測蛋白表達(dá)結(jié)果。

1.3.4 利用GFP-Trap技術(shù)釣取TaPR1互作靶標(biāo) 根據(jù)Chromotek公司GFP-Trap試劑盒的說明書進(jìn)行操作[10],Western blot檢測無誤后,將純化后的蛋白泳道切下來,送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3.5 酵母雙雜交文庫構(gòu)建與篩選 取接種小麥葉銹菌后第1、4、6、8和14天的小麥葉片,采用Trizol方法提取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RNA,等量混合。利用 MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System 構(gòu)建酵母雙雜交文庫(委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成)。通過稀釋涂布法計(jì)算文庫滴度;挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫片段長度與重組率。酵母文庫滴度(CFU/mL)=平板克隆數(shù)量/涂板體積×稀釋倍數(shù)。將前期構(gòu)建成功的誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-TaPR1與酵母文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)中,均勻涂布在2種篩選培養(yǎng)基 SD(-Trp/-Leu)和 SD(-Trp/-Leu/-Ade/His)上,篩選陽性克隆。選取正常生長的單克隆提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化測序。將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gateway重組載體pEarleyGate 103-TaPR1△sp的成功構(gòu)建

利用表1的TaPR1-Gateway引物擴(kuò)增不帶信號肽的TaPR1(TaPR1△sp)基因,將TaPR1△sp連接到Gateway入門載體pENTR/D-TOPO上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,檢測到插入片段大小為423 bp(圖1-A),測序證明序列正確,說明成功獲得pENTR/D-TOPOTaPR1△sp重組載體。在此基礎(chǔ)上,以限制性內(nèi)切酶Mlu I酶切 pENTR/D-TOPO-TaPR1△sp重組載體,將純化后的酶切產(chǎn)物在LR酶的作用下與終載體pEarleyGate 103連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,檢測到插入片段大小為423 bp(見圖1-B),測序結(jié)果說明序列正確,證明終載體pEarleyGate 103-TaPR1△sp構(gòu)建成功。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers for PCR amplification

圖1 重組載體pEarleyGate103-TaPR1△sp 的構(gòu)建Fig 1 Construction of recombinant vector pEarleyGate103-TaPR1△sp

2.2 TaPR1蛋白的表達(dá)檢測

由于pEarleyGate 103載體中的GFP-tag位于插入位點(diǎn)attR1和attR2之后,pEarleyGate 103空載體無法在煙草細(xì)胞中檢測到GFP基因的表達(dá),因此本試驗(yàn)選用pCamA空載(帶有GFP熒光)作為陽性對照(見圖2)。

圖2 TaPR1蛋白的異源表達(dá)Fig.2 Heterologous expression of TaPR1 protein

熒光顯微鏡觀察可見,陽性對照組pCamA中細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁中均可以檢測到GFP發(fā)出的綠色熒光;在實(shí)驗(yàn)組pEarleyGate103-TaPR1△sp中可以清楚地看到GFP綠色熒光出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi),證明pEarleyGate103-TaPR1△sp成功在煙草中表達(dá),可以用于后續(xù)試驗(yàn)(見圖2)。

2.3 利用 GFP-Trap 技術(shù)釣取與TaPR1互作的蛋白

收集成功表達(dá)的煙草葉片,提取總蛋白,GFP標(biāo)簽大小為26 kD,TaPR1蛋白預(yù)期大小為17 kD,所以融合蛋白大小應(yīng)為43 kD。SDS-PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果顯示,蛋白條帶清晰且主帶明顯,滿足預(yù)期要求(圖3-A)。麗春紅染色結(jié)果顯示,在40~55 kD之間可見清晰的蛋白條帶,表明轉(zhuǎn)膜成功(圖3-B)。經(jīng)GFP一抗和二抗雜交,曝光30 s后,在40~55 kD出現(xiàn)了蛋白條帶(圖3-C),與預(yù)期大小一致,說明TaPR1在煙草中成功表達(dá),可以繼續(xù)進(jìn)行GFP-Trap試驗(yàn)。

圖3 TaPR1蛋白的異源表達(dá)及GFP-Trap檢測Fig.3 Heterologous expression of TaPR1 protein and detection of GFP-Trap

將吸附了TaPR1純蛋白液的GFP-Trap珠子經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳,用考馬斯亮藍(lán)染液染色,對比2條泳道中蛋白條帶,發(fā)現(xiàn) “+”和“-” 泳道在50 kD處左右有差異條帶,說明此處可能有與TaPR1互作的寄主中蛋白(圖3-D)。

2.4 TaPR1互作蛋白的質(zhì)譜分析

將在煙草中表達(dá)無誤的TaPR1蛋白通過GFPTrap Beads,獲得的蛋白洗脫液經(jīng)北京華大蛋白研發(fā)中心質(zhì)譜分析,從中挑選出了研究價(jià)值較大的蛋白進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)譜分析共獲得1 966個(gè)蛋白,通過蛋白背景、蛋白綜合分?jǐn)?shù)、蛋白出現(xiàn)次數(shù)進(jìn)行篩選,篩選出了 Glutamine synthetase、zinc finger protein CONSTANS-LIKE 5-like、stress protein DDR48-like、Osmotic和非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白家族等一系列與抗病相關(guān)的蛋白(見表2)。

表2 與TaPR1相互作用的蛋白Table 2 Proteins of interacting with TaPR1

2.5 小麥Y2H文庫的質(zhì)量鑒定

將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Y187酵母菌株,按1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000 稀釋后取 100 μL 涂布于SD/-Leu平板上,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,在1∶10 000稀釋倍數(shù)下約有500個(gè)單菌落,計(jì)算可得滴度為5.0×107cells/mL。為了檢測構(gòu)建的酵母文庫的完整性,隨機(jī)挑選24個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,結(jié)果顯示陽性克隆23個(gè),空載1個(gè),重組率為95.8%,并且23個(gè)陽性克隆片段長度均在1 000~ 2 000 bp之間(見圖4)。由此說明,構(gòu)建的酵母文庫完整性及覆蓋度較好,可以用于后續(xù)的篩庫試驗(yàn)。

圖4 文庫重組率、插入片段檢測結(jié)果Fig.4 Recombination rate of library and detection results of inserted fragments

2.6 酵母雙雜交技術(shù)篩選與TaPR1互作的蛋白

利用Y2H技術(shù)共篩選到28個(gè)陽性克隆。經(jīng)NCBI工具分析后發(fā)現(xiàn)得到的陽性克隆包含11個(gè)蛋白,其中寄主中蛋白9個(gè),菌中蛋白2個(gè)(見表3)。寄主中出現(xiàn)次數(shù)最多的為 The cystathionine betasynthase(CBS pair)domains,共出現(xiàn)了 6次;菌中互作靶標(biāo)出現(xiàn)次數(shù)最多的為Pt_69,出現(xiàn)了6次。與GFP-Trap篩選結(jié)果相比較,Y2H技術(shù)獲得的互作靶標(biāo)中同樣出現(xiàn)了Glutamine synthetase、Cytochrome b6、Stress protein這 3類蛋白,這 3類蛋白都與植物的非生物脅迫或生物脅迫有關(guān)系,后續(xù)本課題組將重點(diǎn)對這3類蛋白進(jìn)行互作驗(yàn)證。

表3 與TaPR1相互作用的蛋白Table 3 Proteins of interacting with TaPR1

3 討論與結(jié)論

Gateway技術(shù)不需要進(jìn)行傳統(tǒng)的酶切連接等步驟,大大簡化了基因克隆的步驟。本試驗(yàn)通過Gateway克隆技術(shù)將TaPR1基因連接到帶有GFP標(biāo)簽的pEarleyGate 103上。在此基礎(chǔ)上,借助農(nóng)桿菌侵染煙草葉片異源表達(dá)TaPR1蛋白,使用GFP-Trap技術(shù)快速獲得了與TaPR1互作的寄主中的蛋白。該方法快速方便,大大減少了獲取互作蛋白的步驟,但存在一定的局限性,利用煙草異源表達(dá)蛋白進(jìn)行互作篩選需要選擇結(jié)構(gòu)高度保守的誘餌蛋白,且會篩選出大量以煙草為背景的蛋白,對蛋白序列的分析與選擇造成干擾。張平平等[11]利用GFP-Trap篩選到了大量與擬南芥Hippo(Hpo)的同功能基因SIK1可能互作的蛋白,為SIK1的功能研究提供了線索。Guillaume等[12]研究結(jié)果表明GFP-Trap技術(shù)可以更全面的篩選到與誘餌蛋白互作的靶標(biāo)。而Ulrich等人的研究結(jié)果表明GFP-Trap結(jié)合GFP抗體的時(shí)間比普通抗體結(jié)合的時(shí)間快5~30 min[13]。

目前除了使用GFP-Trap技術(shù)獲得互作蛋白以外,GST-Pull down與酵母雙雜交技術(shù)也是常用的篩選互作蛋白的方法。其中酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用更為廣泛,即使蛋白瞬時(shí)表達(dá)或者表達(dá)微弱也能使用該技術(shù)進(jìn)行互作蛋白的篩選[14]。鄒禹等[15]使用酵母雙雜交技術(shù),挖掘水稻OsRPK1胞內(nèi)互作蛋白,闡明了OsRPK1參與高鹽脅迫的分子機(jī)制。Qi等[16]以PstGSRE1為誘餌,以小麥條銹菌感染的小麥葉片為材料構(gòu)建酵母雙雜交文庫,從中篩選出了命名為TaLOL的參與ROX過程的基因,解析了該基因通過破壞TaLOL的定位來阻止其發(fā)揮功能。本課題組前期已克隆到TaPR1基因并將其連接到pGBKT7載體上,通過酵母雙雜交篩庫篩選到了寄主中的一些蛋白,也篩選到了菌中具有致病功能的蛋白。酵母雙雜交篩選過程中會出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象,影響互作蛋白的篩選[14]。

綜合上述,本研究嘗試同時(shí)利用2種方法篩選更具有說服力,通過細(xì)胞外GFP-Trap篩選和細(xì)胞內(nèi)酵母雙雜交篩選共同篩選到了寄主中的谷氨酰氨合成酶(Glutamine synthetase)、細(xì)胞色素b6(Cytochrome b6)、應(yīng)激蛋白(Stress protein),三類蛋白均具有抗脅迫或抗病相關(guān)功能。水稻中谷氨酰半胱氨酸合成酶可以減少由于代謝產(chǎn)物脅迫和環(huán)境而引發(fā)的氧自由基的積累,從而消除氧自由基對植物機(jī)體本身的傷害作用[17]。王嘉文等[18]發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺合成酶在氮同化過程中起到了重要作用,是氮素由無機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)氮的關(guān)鍵催化酶,而氮素是植物生長發(fā)育過程中不可或缺的元素。Bao等[19]研究結(jié)果表明過表達(dá)谷氨酰胺合成酶可以提高水稻抗鹽脅能力。細(xì)胞色素復(fù)合物可以通過調(diào)節(jié)光系統(tǒng)Ⅱ過程中相關(guān)蛋白磷酸化間接參與植物的抗逆境生理過程[20]。細(xì)胞色素b6f復(fù)合體還原型鐵硫蛋白前體是由核中的PetC基因編碼的,甘蔗中的該基因可以響應(yīng)強(qiáng)光[21]、干旱脅迫等非生物脅迫,同時(shí)也有報(bào)道稱PetC基因受到了小麥白粉菌的誘導(dǎo)表達(dá)[22]。應(yīng)激蛋白是一類廣泛存在的與抗逆相關(guān)的蛋白,響應(yīng)干旱脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫等。張宇萍等[23]研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫可以激活玉米中鈣依賴型蛋白激(CDPKs),而CDPKs在植物適應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。干旱脅迫蛋白參與代謝物和能量前體合成、核酸代謝、氧化還原輔酶代謝過程、蛋白翻譯調(diào)控、細(xì)胞蛋白質(zhì)及氨基酸代謝過程的調(diào)控、半胱氨酸的生物合成及代謝過程和光合作用等[24]。

TaPR1蛋白可能與上述3種蛋白存在互作關(guān)系,課題組后續(xù)將對這3種蛋白是否與TaPR1互作進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,使用酵母雙雜交一對一回復(fù)驗(yàn)證、雙分子熒光互補(bǔ)以及免疫共沉淀等技術(shù)進(jìn)行互作的真實(shí)性驗(yàn)證,明確互作的意義,探索TaPR1所參與的信號通路以及抗病相關(guān)的互作機(jī)制??傊?,本研究使用2種方法進(jìn)行TaPR1互作蛋白的篩選,既減少了酵母雙雜交篩庫假陽性的數(shù)量,又彌補(bǔ)了GFPTrap技術(shù)無法篩選菌中靶標(biāo)的劣勢,巧妙地將2種技術(shù)結(jié)合篩選寄主以及菌中靶標(biāo),為篩選互作靶標(biāo)提供了新思路,為明確TaPR1參與小麥抗葉銹病防御機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

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