林 兵，陳藝荃，方能炎，鐘淮欽，葉秀仙，樊榮輝*

(1 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，福州 350013；2 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福州 350013)

荷蘭鳶尾(Irishollandica)為鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(Iris)秋植球根花卉。花姿優(yōu)美、如鳶似蝶、花色艷麗，主要有白色、黃色和藍紫色等色系。很多植物中，藍紫色花的形成主要由花色素苷途徑控制，如葡萄風(fēng)信子(Muscari)、睡蓮(Nymphaeaspp.)等[1-3]，藍紫色花的深淺程度主要取決于花色素苷途徑中飛燕草素(delphinidin)及其衍生物含量，紅色主要取決于矢車菊素(cyanidin)及其衍生物含量[4-5]。花青素苷合成后會進行分子修飾，這是花色素結(jié)構(gòu)多樣化和穩(wěn)定性的基礎(chǔ)，在不同的物種中呈現(xiàn)多樣性，其修飾類型包括糖基化、?；图谆；ㄇ嗨剀盏奶腔图谆诡伾t，而花青素苷的?；淖儾ㄩL吸收最大值，使顏色更藍，并且?；幕ㄇ嗨剀辗肿娱g的堆積，能使形成的藍色非常穩(wěn)定[6-8]。目前，在月季(Rosachinensis)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)和菊花(Dendranthemamorifolium)中已獲得轉(zhuǎn)基因藍紫色花[8-9]。荷蘭鳶尾花色素苷途徑大部分相關(guān)基因被研究[10-11]，其藍紫色花的深淺主要由花色素苷的種類、含量，黃酮等助色素及類胡蘿卜素的含量三者共同作用，其中花色素苷的種類和含量為主控因素[12]，這為花色研究奠定了基礎(chǔ)。然而，由于特定位點突變導(dǎo)致色素缺失，進而導(dǎo)致花色變淺或變深的可能分子機制存在廣泛性和不確定性，可能是某個基因、某個蛋白，也可能是某個轉(zhuǎn)錄因子的突變，導(dǎo)致花色變異機理的研究難以澄清，這就需要更多的數(shù)據(jù)去解釋花色變異原因。本團隊從荷蘭鳶尾藍紫色野生型‘展翅’中選育出紫色突變株‘紫韻’，本研究以‘展翅’和‘紫韻’為材料，研究花色由藍變紫的色素差異及分子機制，為荷蘭鳶尾藍紫色花中花色苷積累機制提供更全面的了解，同時為花色變異機理研究提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生型‘展翅’和突變株‘紫韻’種植于福建省農(nóng)科院花卉研究中心種質(zhì)資源圃中。野生型‘展翅’旗瓣顏色(93A, violet blue, 藍紫色)，突變株‘紫韻’旗瓣顏色(86A, dark violet, 紫色)。

分別采取‘展翅’(藍紫色)和‘紫韻’(紫色)旗瓣，液氮中速凍，-80 ℃保存，用于色素成分分析及轉(zhuǎn)錄組測序；分別取‘展翅’和‘紫韻’的花發(fā)育3個時期(花蕾前期、花蕾中期和始花期)，用于qRT-PCR，以檢測目的基因隨花發(fā)育的表達情況。

1.2 方 法

1.2.1 花色素苷的定性定量分析花色素苷的定量定性分析采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-QTOF-MS) 技術(shù)進行，每個樣品 3 個生物學(xué)重復(fù)。

花色素苷的提取: 實驗材料在凍干機中凍干后，取出100 mg左右，采用上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司型號為JX-24的全自動組織研磨儀，于40 Hz頻率研磨4 min；加入1 mL 60%乙醇溶液(含0.1%鹽酸)于恒溫水浴鍋中35 ℃下浸提2 h；在4 ℃離心機中14 000 r/min離心15 min，取上清，用溫和氮氣吹去其中的乙醇，并補充一定體積0.1%鹽酸的水溶液，用于后續(xù)分析。

UPLC 條件: 色譜柱為Acquity uplc beh C18(100 × 2.1 mm, 1.7 μm, Waters), 溫度為 45 ℃。流動相組：A相，水(含0.5% 甲酸溶液)；B相，乙腈(含0.5% 甲酸溶液)。洗脫條件: 2 min，1%B；1 min，5%B；6 min，20%B；3 min，50%B；3 min，100%B； 100%B保持2 min； 最后1%B平衡 3 min。流速0.4 mL·min-1， 進樣體積3 μL。

質(zhì)譜條件: LockSpray離子源在正電噴霧電離和負電噴霧電離(ESI)模式下運行。掃描模式為MSE模式，以低能掃描(CE 4eV)和高能掃描(CE傾斜20-45eV)來破碎離子，氬氣(99.999%)被用作離解氣體。掃描范圍50～1000 amu(atomic mass unit)，速度 0.2 s /掃描。毛細管電壓2 kV(正模式)，錐電壓40 V，源電壓偏移60 V。光源溫度115 ℃，脫溶劑氣溫度為450 ℃。去溶劑氣流量900 L·h-1，錐氣流量50 L·h-1，氮氣(> 99.5%)用作去溶劑和錐氣。

花色素苷含量測定采用標準曲線法，利用標準品矢車菊素3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside)作為外標對花色素苷含量進行半定量分析。標準品的濃度梯度為 500、250、100、50、10、5及1 μg· mL-1。每個樣品重復(fù)3次。采用UNIFI 1.8.1(Waters) 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序及分析通用RNA提取試劑盒(北京百泰克生物科技有限公司)提取總RNA。RNA完整性用NanoDrop 2000(Thermo Scientific，MA，USA)檢查。使用Illumina HiSeqTM4000進行文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序(北京百邁克生物技術(shù)公司)，每個樣品2個重復(fù)。

應(yīng)用Fastx-Toolkit軟件獲得原始測序數(shù)據(jù)(Raw reads)，利用FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)軟件對Raw reads過濾得到高質(zhì)量的過濾后數(shù)據(jù)(Clean reads)；Clean reads再組裝成基因轉(zhuǎn)錄本(Transcripts)和單基因簇(Unigene)。利用RSEM軟件對基因表達量進行預(yù)測，采用FPKM(fragments per kilobase million)方法對測序數(shù)據(jù)標準化處理[13]。使用DESeq軟件差異表達基因進行評估[14]。差異基因間的閾值為錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR) < 0.01且差異倍數(shù)(fold-change value) ≥ 2。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析使用ABI 7500實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)進行qRT-PCR。Primer Premier 5.0引物設(shè)計以確定基因的相對表達水平(表1)。熔解曲線分析確認PCR的特異性。每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)。β-actin為內(nèi)參。相對定量計算方法應(yīng)用2-ΔΔCt法[15]。

表1 qRT-PCR所用引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 花色素苷鑒定

應(yīng)用UHPLC-QTOF-MS技術(shù)，對野生型‘展翅’(藍紫色)和突變品種‘紫韻’(紫色)的旗瓣進行花色素苷定量定性鑒定(圖1)，共鑒定出9種花色素苷，且均為花色素的糖基化，形成花色素-葡萄糖苷?！钩帷偦ㄉ剀蘸繛?43.5 μg· g-1，‘紫韻’總花色素苷含量有所降低，為392.7 μg· g-1，其中有3種花色素苷含量顯著降低，矢車菊素-3-蕓香糖苷(矢車菊素-3-鼠李葡糖苷)含量由144.42 μg· g-1降為46.39 μg· g-1，矮牽牛素-3-(6-鼠李糖基-2-木糖基葡萄糖苷)含量由61.86 μg· g-1降為31.67 μg· g-1，矢車菊素-3-(2G-木糖基蕓香糖苷)含量由25.22 μg· g-1降為7.65 μg· g-1，1個花色素苷含量顯著升高，6-羥基矢車菊素-3-葡萄糖苷含量由5.88 μg· g-1升為10.34 μg· g-1(表2)?；ㄉ剀蘸康淖兓赡苁菍?dǎo)致花色由藍紫向紫方向轉(zhuǎn)變的原因。

表2 荷蘭鳶尾花中花色素苷的鑒定

圖1 荷蘭鳶尾野生型‘展翅’及突變品種‘紫韻’Fig.1 The parent ‘Zhanchi’ and mutant variety ‘Ziyun’ of Iris hollandica

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

為了進一步探索‘紫韻’突變?yōu)樽仙脑颍瑢ⅰ钩帷汀享崱钠彀赀M行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得26.61 Gb Clean reads(表3), 通過組裝獲得46 530個Unigenes，平均長度為1 081 bp。其中128 90個Unigene長于1 000 bp，占總數(shù)的27.70%。與‘展翅’相比，有43個基因上調(diào)表達，有73個基因下調(diào)表達，轉(zhuǎn)錄本豐度通過層次聚類分析法進行聚類(圖2)?；ㄉ剀胀緩焦舶l(fā)現(xiàn)2個差異表達基因，1個查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)基因和1個UFGT基因均下調(diào)表達。

圖2 荷蘭鳶尾2個品種的表達譜分析Fig.2 Expression profiles analysis of unigenes in two varieties of Iris hollandica

表3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)

2.3 花色變異相關(guān)基因分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共發(fā)現(xiàn)14個CHS基因，2個在‘展翅’和‘紫韻’花中均高表達，表達量達到上千，1個(IhCHS1, BMK_Unigene_25661)在‘展翅’花中表達量偏高，而在‘紫韻’花中較低(圖3)，其余11個在2個品種表達量均偏低。IhCHS1在偏紫色‘紫韻’中的下調(diào)表達，一定程度上可能會限制花色素苷代謝流，但筆者認為這不是導(dǎo)致花色變紫的主要原因，因為有2個CHS在‘紫韻’花中高表達。共發(fā)現(xiàn)5個UFGT基因，1個基因(IhUFGT1, BMK_Unigene_00148)在‘展翅’花中高表達，在‘紫韻’花中表達量相對較低，其余4個基因在2個品種表達量均很低，推測IhUFGT1在‘紫韻’花中的較低表達，導(dǎo)致某些花色素葡萄糖苷合成降低，使顏色由藍紫轉(zhuǎn)為紫色。

P1. 花蕾前期；P2. 花蕾中期；P3. 始花期圖3 CHS和UFGT基因表達分析P1. Early bud period； P2. Mid-bud period；P3. Early flowering periodFig.3 Expression analysis of CHS and UFGT genes

IhUFGT1的開放閱讀框(ORF)為1 383 bp, 編碼461個氨基酸。聚類分析表明，IhUFGT1與已知鳶尾UFGT親緣關(guān)系最近，其次與同為鳶尾屬的小蒼蘭(Freesiahybrid)聚為一類(圖4)。對‘展翅’和‘紫韻’的3個花發(fā)育時期進行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示，IhCHS1和IhUFGT1 在‘展翅’和‘紫韻’中隨著花的發(fā)育表達量逐漸上升，到始花期達到最高。在始花期，IhCHS1和IhUFGT1 在‘展翅’中的表達高于‘紫韻’(圖3)。 qRT-PCR進一步證實IhUFGT1在‘紫韻’中的相對低表達。UFGT催化花色素形成花色素-葡萄糖苷，IhUFGT1的相對低表達，導(dǎo)致花色素-葡萄糖苷含量變化。

圖4 荷蘭鳶尾UFGT進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of UFGT of I. hollandica

3 討 論

花色素苷是植物重要的次生代謝物之一，通常以糖基化的形式存在。糖基化可增加花色素在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性、溶解性并加強其轉(zhuǎn)運特性[16-17]。本研究通過UHPLC-QTOF-MS分析，共鑒定出9種花色素苷，均為糖基化花色素苷，在花色偏紫的‘紫韻’中，4種花色素苷含量與親本‘展翅’有顯著差異，推測是花色由藍變紫的主要原因。研究表明，荷蘭鳶尾藍紫色花的深淺主要由花色素苷的種類和含量，黃酮助色素的輔助著色及類胡蘿卜素的含量三者共同作用，其中花色素苷的種類和含量為主控因素[12]。本研究中，未發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素途徑相關(guān)基因及黃酮形成關(guān)鍵基因的差異表達。另外，金屬離子協(xié)同作用和液泡pH值也是影響其顏色的因素[18-21]。在紫色郁金香(Tulipagesnerianacv. Murasakizuisho)中，花瓣紫色部分和花被藍色部分含有相同的飛燕草色素苷和黃酮醇，而藍色花被中，金屬離子Fe3+的濃度是紫色部分的25倍[22]。紫花牽牛(Ipomoeatricolor)中，紫紅色的花蕾在開放后變成藍色，花冠表皮細胞的pH值從6.6上升到7.7[23]?！享崱ㄉ母淖?，除與花色素苷含量有關(guān)外，是否存在其他影響因素，還需進一步驗證。

藍紫色花的形成受到花青素途徑的多個基因控制，如F3′5′H和DFR對藍紫色花的形成起重要作用，其中F3′5′H被稱為‘藍色基因’。菊花中過表達風(fēng)鈴草F3′5′H基因，使菊花變?yōu)樗{紫色[24]。月季中轉(zhuǎn)入堇菜(Violaspp.)F3′5′H基因和鳶尾(Iris×hollandica)DFR基因，花色由淺紫紅色變成了藍紫色[25]。本研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，F(xiàn)3′5′H和DFR基因均未發(fā)現(xiàn)有差異表達，導(dǎo)致荷蘭鳶尾花色由藍紫色變?yōu)樯钭仙闹骺鼗蚩赡苁腔ㄉ剀招揎椈颉?/p>

UFGT是花色素苷途徑的最后一個基因[26]。UFGT作為產(chǎn)生花色素苷的主要控制點，將葡萄糖轉(zhuǎn)移至花色素的C-3羥基上，生成花色素3-O-葡萄糖苷[27]。這是使花色素具有穩(wěn)定性和植物水溶性的關(guān)鍵一步[11]。UFGT的表達與花色素苷的積累相一致,UFGT的表達改變會導(dǎo)致花色素苷含量發(fā)生相應(yīng)變化，UFGT的過低表達甚至?xí)?dǎo)致花色素苷缺失或花色素苷含量顯著降低[28-30]。轉(zhuǎn)基因煙草中，NtUFGT基因的過低表達，使花色素苷含量顯著降低，花色接近白色[31]。本研究中，IhUFGT1在偏紫色突變體‘紫韻’中表達量有所下降，導(dǎo)致花色素苷含量改變，使花色由藍紫變?yōu)樽仙?。花色素的修飾是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，目前，對花色素修飾機理的研究還不夠透徹，需要大量數(shù)據(jù)去解析和闡述，這一研究結(jié)果為花色素修飾提供一定參考，也為藍紫色花色改良提供理論基礎(chǔ)。后續(xù)構(gòu)建該基因的過表達載體，遺傳轉(zhuǎn)化‘紫韻’，進行進一步驗證。

紫色花中4種花色素苷含量有顯著變化，可能是導(dǎo)致花色由野生型‘展翅’藍紫色向突變株‘紫韻’紫色方向轉(zhuǎn)變的主要原因。IhUFGT1在紫色‘紫韻’花中表達量相對較低，致使花色素苷含量變化，最終導(dǎo)致花色由藍紫轉(zhuǎn)為紫色。