周玲芳， 尚驍堯， 張鐵軍， 晁躍輝

(北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院， 北京 100083)

衰老是一個細胞程序性死亡過程，受遺傳因素和外界環(huán)境因子的調(diào)節(jié)。在植物葉片衰老過程中，葉肉細胞被解離和降解，營養(yǎng)物質(zhì)被分解并運輸?shù)狡渌鞴?，并伴隨生理生化指標、激素水平以及基因調(diào)控等方面發(fā)生一系列變化，以保證植物能完成正常的新陳代謝。葉綠素流失是衰老的特征之一，隨著葉綠體分解，葉色褪綠變黃，并伴隨總RNA[1]和蛋白質(zhì)水平的下降。葉片衰老的過程非常復(fù)雜，涉及至少數(shù)千個基因的調(diào)控以及許多代謝和信號通路的改變。Lohman等[2]人將在衰老過程中表達上調(diào)的基因確定為衰老相關(guān)基因(Senescence associated genes,SAGs)，這些基因通常編碼實現(xiàn)細胞死亡的蛋白質(zhì)[3]，在植物衰老過程中起著重要的調(diào)控作用[4]。在分子遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，植物葉片衰老相關(guān)基因主要包括光信號、激素轉(zhuǎn)導(dǎo)和葉綠素代謝途徑[5-6]。目前，人們已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大麥(HordeumvulgareL.)、番茄(Lycopersiconesculentum)、煙草(NicotianatabacumL.)等植物中發(fā)現(xiàn)了許多與衰老相關(guān)的基因[7]。Bayanati等[8]發(fā)現(xiàn)在玫瑰(Rosahybrida)衰老過程中，衰老相關(guān)因子可以調(diào)控衰老相關(guān)基因RhAA和RhCG的表達，與衰老的降解和再動員過程有關(guān)。在葡萄(VitisviniferaL.)[9]和擬南芥[10]的衰老過程中，SAG12轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，表達上調(diào)。SAG113定位于高爾基體，編碼一種屬于PP2C家族的蛋白磷酸酶。在衰老的葉片中，ABA會誘導(dǎo)SAG113基因表達，從而抑制氣孔關(guān)閉，導(dǎo)致水分流失，加速衰老進程[11]。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors，TFs)通過與靶標基因啟動子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合并作用，調(diào)控靶基因的表達，在植物生長發(fā)育、激素信號傳導(dǎo)和新陳代謝等多方面中發(fā)揮重要作用[12]。目前，人們在高等植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多類型的轉(zhuǎn)錄因子，共同作用調(diào)節(jié)葉片衰老過程中的基因表達。如NAP是近來年發(fā)現(xiàn)的植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，屬于NAC家族。李鈺卓等[13]從菜薹(Brassicarapavar.parachinensis)中分離BrNAP1基因并分析其功能，發(fā)現(xiàn)BrNAP1是菜薹采后葉片衰老的正調(diào)控因子，受ABA誘導(dǎo)表達上調(diào)，且能夠激活BrSAG113表達。在矮牽牛花(Petuniahybrida)的花冠和雌蕊中對ERF基因進行了表達分析，這些基因在花衰老過程中表現(xiàn)出不同的表達模式和水平，并且都能被外源乙烯加速轉(zhuǎn)錄，表明PhERF參與了牽?；ㄋダ系霓D(zhuǎn)錄調(diào)控過程[14]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠特異性識別W-box結(jié)合元件并產(chǎn)生相互作用，進而參與植物生長發(fā)育調(diào)控衰老[15]。在擬南芥等模式植物中已經(jīng)證實WRKY轉(zhuǎn)錄因子具調(diào)控葉片衰老作用，GhWRKY33轉(zhuǎn)基因的擬南芥與野生型相比，衰老延緩，并且衰老相關(guān)基因AtSAG12、AtSAG13的表達下調(diào)，表明GhWRKY33是調(diào)控擬南芥衰老的負調(diào)控因子[16]。

轉(zhuǎn)錄組測序稱RNA-Seq，利用高通量測序技術(shù)進行分析，可全面快速地獲得植物特定細胞或組織在某個狀態(tài)下幾乎所有的轉(zhuǎn)錄本及基因序列，在新基因的發(fā)現(xiàn)和基因表達分析方面發(fā)揮了重要作用[17]。近年來，Illumina測序廣泛應(yīng)用于研究植物的生長發(fā)育、抗逆境生理機制以及挖掘基因功能等[18-20]。目前，有許多植物物種通過測序技術(shù)開展了葉片衰老的分析，如煙草[21]、葡萄[22]和高羊茅(Festucaarundinacea)[23]等。然而，在蒺藜苜蓿中有關(guān)葉片衰老的研究還較少，轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制尚不明確。

蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)是一種重要的豆科牧草植物，由于其生長周期短、倍性小(2n=16)、基因組小和自花授粉等優(yōu)點成為了研究豆科植物的模式植物[24]。R108品種由于其較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率，被廣泛應(yīng)用于蒺藜苜蓿的分子生物學(xué)與遺傳學(xué)研究[25]。目前蒺藜苜蓿已完成全基因組測序，為有效地研究基因調(diào)控、深度挖掘其潛藏的遺傳信息提供了一定依據(jù)。葉片衰老是植物健康生長、繁育后代的關(guān)鍵指標之一，對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有很大影響。因此，深入研究葉片衰老的機理，人為調(diào)控葉片衰老過程對培育優(yōu)良品系及提高作物產(chǎn)量具有重要的理論意義和實踐價值。

本研究以蒺藜苜蓿健康、成熟及3個不同衰老階段葉片為材料，利用RNA-Seq手段進行轉(zhuǎn)錄組分析，探究葉片衰老的分子調(diào)控機制，篩選差異表達基因(Differentially expressed genes，DEGs)并進行功能注釋，初步鑒定SAGs和TFs，為進一步研究葉片衰老相關(guān)基因的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及RNA提取

試驗材料為蒺藜苜蓿R108品種，由北京林業(yè)大學(xué)草坪科學(xué)與管理實驗室保存。將蒺藜苜蓿種子用75%乙醇滅菌10分鐘后，置于濕潤濾紙上，等2～3周長出幼苗后轉(zhuǎn)移至含草炭土、蛭石、珍珠巖(1:1:1)的營養(yǎng)土中，放置于氣候培養(yǎng)箱中，25℃光照16 h/22℃黑暗8 h。選取長勢健康良好的蒺藜苜蓿植株，采集其成熟葉片以及衰老初、中、末期葉片，在液氮中速凍后置于-80℃冰箱中保存以備后續(xù)實驗。

利用Plant RNA Kit試劑盒(OMEGA公司)提取上述樣本葉片的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的降解程度和污染情況，并結(jié)合超微量紫外分光光度計(OD260/280)檢測其純度和濃度，然后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 葉綠素含量的測定

葉片衰老顯著的形態(tài)特征是葉片顏色的變化，而葉片變黃是鑒定葉片衰老開始和發(fā)展的可見依據(jù)，根據(jù)蒺藜苜蓿葉片的黃化程度，將衰老過程分為3個階段，分別是衰老初期、衰老中期和衰老后期[26]。在本研究中，葉片完全展開并且沒有變黃的跡象被定義為成熟階段，并對每個階段的葉片進行葉綠素含量的測定。取新鮮成熟和衰老初、中、末期葉片樣品各0.5 g，分別加入95%乙醇25 mL，在黑暗條件下室溫提取24～36 h后，使用紫外可見分光光度計測量665 nm，649 nm處的吸光度，并通過公式計算葉綠素含量。

1.3 文庫構(gòu)建及測序質(zhì)量分析

通過Qubit對RNA濃度進行精確定量，Agilent 2100 Bioanalyzer精確檢測RNA完整性后，經(jīng)北京諾禾致源科技公司進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。樣品檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠，通過A-T互補配對與mRNA的ployA尾結(jié)合的方式富集真核生物的mRNA，最后進行PCR富集得到最終的cDNA文庫。

文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫至1 ng·μL-1，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段長度(Insert size)進行檢測，Insert size符合預(yù)期后，使用q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2 nM)，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后在Illumina HiSeq平臺上進行測序。

為了保證信息分析質(zhì)量，對得到的原始序列數(shù)據(jù)(Raw reads)進行過濾，去除里面含有帶接頭的(Adapter)、N比例大于10%以及低質(zhì)量的reads，得到過濾后序列數(shù)據(jù)(Clean reads)。利用Bowtie (2.2.3)[27]建立參照基因組索引，使用TopHat(2.0.12)[28]將Clean reads與參考基因組進行比對。采用HTSeq(0.61)軟件計算每個基因的讀取數(shù)[29]，然后根據(jù)基因的長度計算每個基因的FPKM(Expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced，每百萬fragments中來自比對到某一基因每千堿基長度的fragments數(shù)目)，并將讀取計數(shù)映射到該基因上。

1.4 差異表達基因功能注釋

利用DEseq軟件(1.18.0)[30]對成熟和衰老葉片樣本進行基因差異表達分析，然后根據(jù)模型進行假設(shè)檢驗概率(Pvalue)的計算進行多重假設(shè)檢驗校正，控制錯誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate，F(xiàn)DR)。差異表達基因以|log2(Fold Change)|>1且FDR<0.05作為篩選標準。

通過NCBI Blastx比對獲得差異表達基因的Nr信息，得到最高序列相似性的蛋白，從而得到基因的Nr注釋；利用GOseq R包(Release 2.12)[31]對差異表達基因進行GO富集分析；利用KOBAS軟件(2.0)[31]檢測KEGG通路中DEGs的數(shù)據(jù)富集情況。

1.5 轉(zhuǎn)錄因子分析和衰老相關(guān)基因篩選

從PlnTFDB(http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/)下載植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫，利用Blastx將所得到的差異表達基因序列與植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫的序列進行比對。

通過使用Blastx將差異表達基因和葉片衰老數(shù)據(jù)庫(Leaf senescence database，LSD)中的基因序列進行比較，分析獲得蒺藜苜蓿與其他植物之間具有較高同源性的衰老相關(guān)基因。

1.6 qRT-PCR驗證

為了驗證差異表達基因的結(jié)果，隨機選擇8個差異表達基因，通過qRT-PCR進行測量。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1)。根據(jù)TB GreenPremixExTaqTMⅡ試劑盒(Takara公司)說明書進行操作。20 μL反應(yīng)體系為TB GreenPremixExTaqII 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，RNase Free H2O 7 μL。使用2-△△Ct法[33]計算基因相對表達量，所有基因的表達分析均設(shè)置了3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 List of primers used for qRT-PCR

2 結(jié)果分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

如圖1所示，衰老初期、中期和末期葉片的葉綠素含量分別下降到成熟葉片的20.72%，15.49%和8.0%。表明樣品可以反映葉片衰老的進程，可用于衰老相關(guān)基因的鑒定。

圖1 葉綠素含量Fig.1 Chlorophyll content in leaf samples注：M：成熟葉片；O1：衰老初期葉片；O2：衰老中期葉片；O3：衰老末期葉片；**表示0.01水平下有顯著性差異Notes:M:Mature leaf；O1:Early senescent leaf;O2:Medium senescent leaf;O3:Late senescent leaf;** indicate significantly different at the 0.01 probability levels,respectively

本研究以蒺藜苜蓿成熟葉片和衰老初、中、末期葉片為樣品進行建庫和轉(zhuǎn)錄組測序，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況如表2所示。原始序列(BioProject號：PRJNA754763)過濾掉低質(zhì)量的reads后，共計獲得82.81 Gb的Clean reads，且每個文庫的Clean reads均在41萬條以上，其中Q20均大于 97%和Q30(FDR≤0.1%)均大于93%，GC含量為41.44%～42.68%，表明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較好，可以進行下一步分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析Table 2 Quality analysis of transcriptome sequencing data

2.2 差異表達基因鑒定

在4個發(fā)育階段的葉片中共鑒定出64 324個基因。通過DEGs分析，以成熟葉片樣品為對照，衰老初期的樣品中，有6 746個基因上調(diào)表達，6 555個基因下調(diào)表達；衰老中期的樣品中，有7 853個基因上調(diào)表達，7 546個基因下調(diào)表達；衰老末期樣品中，有7 544個基因上調(diào)表達，7 304個基因下調(diào)表達(圖2)。為了進一步分析在衰老過程中的調(diào)控基因，篩選3個衰老階段均差異表達的基因，共鑒定出2 990個差異表達基因，其中上調(diào)基因1 362個，下調(diào)基因1 628個。對這2 990個差異表達基因進行長度分析，結(jié)果顯示其中2 393個基因長度大于500 bp，占80.03%(圖3)。

圖2 差異表達基因火山圖Fig.2 Volcano plot of differentially expressed genes注：A：衰老初期葉片vs成熟葉片；B：衰老中期葉片vs成熟葉片；C：衰老末期葉片vs成熟葉片Notes:A:Early senescent leaf vs Mature leaf;B:Medium senescent leaf vs Mature leaf;C:Late senescent leaf vs Mature leaf

圖3 差異表達基因長度分布Fig.3 Length distribution of differentially expressed genes

2.3 差異表達基因功能注釋

為了探究差異表達基因的功能信息，通過BLAST軟件將篩選出來的2 990條差異表達基因與COG，GO，KEGG，KOG，Pfam，Swissport以及Nr數(shù)據(jù)庫進行比對，能夠得到注釋信息的差異表達基因一共有2 684條。其中，注釋到Nr數(shù)據(jù)庫的數(shù)量最多，有2 376條占所有差異表達基因的79.46%。注釋到COG數(shù)據(jù)庫的數(shù)量最少，僅有724條，占所有差異表達基因的24.21%。(表3)

表3 差異表達基因注釋統(tǒng)計Table 3 DEGs annotation statistics

2.4 差異表達基因功能富集分析

將所有差異基因同Nr數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果顯示數(shù)量分布最多的前5物種分別為：蒺藜苜蓿Medicagotruncatula(2 233個)，鷹嘴豆Cicerarietinum(37個)，葡萄Vitisvinifera(12個)，野大豆Glycinesoja(11個)，大豆Glycinemax(10個)。

通過GO數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行功能注釋以及富集分析顯示，有938條差異表達基因被注釋，基因功能主要分為3個方面：細胞組分、分子功能以及生物過程(圖5)。其中，注釋到生物過程方面的差異表達基因最多，共有1 530個分布在17個亞類中，主要富集于代謝過程、細胞過程和單一生物過程；其次是注釋到分子功能方面共11個亞類的基因有1 461個，主要集中于催化活性、結(jié)合和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；注釋到細胞組分方面共12個亞類的基因有457個，主要富集于細胞、細胞組分、膜和細胞器等。

圖4 Nr同源物種分布Fig.4 Nr Homologous Species Distribution

圖5 差異表達基因GO功能分類Fig.5 Gene ontology function classification of Differentially expressed genes

通過COG數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行比對，發(fā)現(xiàn)有724條基因得到注釋，分配至26類功能中，且基因在不同的功能分類中存在明顯的差異。其中，糖運輸和新陳代謝功能類別注釋的基因最多，其次是一般功能預(yù)測類和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，之后是翻譯后修飾、蛋白折疊和分子伴侶。

圖6 COG功能分類統(tǒng)計Fig.6 COG function classification statistics

將篩選出來的差異基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對以分析代謝途徑，結(jié)果顯示共有353個差異基因成功富集于83個代謝途徑通路，注釋率為11.8%(表4)。集中在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)和苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)的差異表達基因數(shù)量較多，分別有24個和16個，其次是淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)有13個。表明蒺藜苜蓿葉片在衰老過程中，多種植物激素含量、生物合成途徑以及代謝途徑均發(fā)生變化，參與這些途徑的差異基因發(fā)揮了重要作用。

表4 差異表達基因的部分KEGG通路Table 4 Partial KEGG analysis of Differentially expressed genes

2.5 基因轉(zhuǎn)錄因子分析

通過與植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定出145個轉(zhuǎn)錄本，分布在33個轉(zhuǎn)錄因子家族中，占主體的6個家族是ERF(20個)、WRKY(18個)、bHLH(16個)、MYB(12個)、NAC(9個)和bZIP(7個)，其中63個轉(zhuǎn)錄因子在衰老葉片中顯著上調(diào)(圖7)。

圖7 轉(zhuǎn)錄因子家族分布Fig.7 Transcription family distribution

2.6 衰老相關(guān)基因分析

LSD是一個綜合性資源包括衰老相關(guān)基因及其突變體。將篩選出來的差異表達基因與LSD中的序列進行比對，分析蒺藜苜蓿與其他植物之間衰老相關(guān)基因序列的保守性。2 990個差異表達基因中，有837個在LSD中具有其他植物的同源基因，其中393個基因表達上調(diào)，444個基因表達下調(diào)，主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、激素反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)或碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)降解或修改，營養(yǎng)循環(huán)和其他(表5)。

表5 蒺藜苜蓿與其它物種葉片衰老的部分同源物Table 5 Partial list of leaf senescence orthologs between Medicago truncatula and other species

2.7 qRT-PCR驗證

為驗證蒺藜苜蓿衰老葉片轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，隨機選擇8個差異基因并設(shè)計引物，其中4個上調(diào)基因為g55467,g15780,g16441和Novel03106，4個下調(diào)基因為Novel00091,g13193,Novel02956和Novel02059，進行實時熒光定量表達分析。結(jié)果表明這8個差異基因在qRT-PCR與轉(zhuǎn)錄組測序中顯示出相似的表達模式(圖8)

圖8 差異表達基因qRT-PCR驗證Fig.8 qRT-PCR verification for differentially expressed genes注：M：成熟葉片；O1：衰老初期葉片；O2：衰老中期葉片；O3：衰老末期葉片；*與**分別表示在 0.05和0.01水平下有顯著性差異Notes:M:Mature leaf；O1:Early senescent leaf;O2：Medium senescent leaf;O3：Late senescent leaf;* and ** indicate significantly different at the 0.05 and 0.01 probability levels,respectively

3 討論

近年來，高通量測序技術(shù)在植物的研究上應(yīng)用日益廣泛，受到眾多研究者的青睞。2014年R108蒺藜苜蓿被測序成功，為研究蒺藜苜蓿在不同發(fā)育時期基因表達提供了重要參考。本研究為獲得更多的轉(zhuǎn)錄組測序信息，將葉片衰老分為3個階段，以蒺藜苜蓿成熟葉片和衰老初、中、末期葉片為材料，采用Illumina HiSeq技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序并進行相關(guān)分析，共計獲得82.81 Gb的Clean reads且Q20和Q30均大于90%，說明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可用于進一步研究。

通過轉(zhuǎn)錄組鑒定發(fā)現(xiàn)在葉片衰老的過程中共有2990個基因差異表達，其中表達下調(diào)基因較多，結(jié)果與以前的報告一致，用衰老葉片組織構(gòu)建的cDNA文庫進行篩查，在上、下調(diào)2種特異表達的基因中，多數(shù)基因為下調(diào)表達[34]。目前利用轉(zhuǎn)錄組分析，也篩選出很多其他植物在衰老過程中的差異表達基因。如Lu等對毛果楊(Populustrichocarpa)在季節(jié)性衰老過程中的轉(zhuǎn)錄組變化進行分析，共鑒定出17 974個差異表達基因[35]；Chao等利用高通量Illumina測序進行分析，得出紅三葉(TrifoliumpratenseL.)衰老和非衰老葉片之間有481個基因差異表達[36]。

基于Blast分析，2 684條差異表達基因通過Nr、KEGG、GO等七個數(shù)據(jù)庫比對被成功注釋，仍有306個基因未被注釋，推測是存在新基因，或者是由于其他的污染，如實驗采樣過程中樣品被未知微生物污染。在GO分類結(jié)果表明，這些差異表達基因在葉片衰老過程中，主要集中在生物過程的代謝過程、細胞過程和單一生物過程。此外，基于KEGG富集分析，我們發(fā)現(xiàn)差異基因在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷類生物合成顯著富集，以前的研究也表明在油茶(CamelliaoleiferaAbel.)葉片衰老過程中，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷類生物合成表現(xiàn)出最多的差異表達基因[37]。

葉片衰老的過程受到基因的調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了重要作用，因此我們對轉(zhuǎn)錄因子進行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)差異表達的轉(zhuǎn)錄因子主要分布在ERF、WRKY、bHLH、MYB、NAC等家族中。目前很多研究鑒定出擬南芥中有大量的WRKY轉(zhuǎn)錄因子與葉片衰老密切相關(guān)，除AtWRKY6 在擬南芥葉片衰老期間的表達量快速上調(diào)外[38]，擬南芥WRKY53作為葉片衰老的核心轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)其表達也可以加速葉片衰老[39]。本研究中，發(fā)現(xiàn)18個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因與葉片衰老有關(guān)，其中有14個基因在衰老過程中表達上調(diào)，這與前人的研究結(jié)果一致。此外，我們發(fā)現(xiàn)有6個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達，參與調(diào)控蒺藜苜蓿葉片衰老過程。有研究表明，與調(diào)控衰老有關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子大多是以正調(diào)控的方式在葉片衰老過程中發(fā)揮重要作用[40-41]。 Zhang等[42]通過研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子AtNAP在衰老的擬南芥中表達，并且在衰老葉片中NAP轉(zhuǎn)錄因子通過ABA-AtNAP-SAG113 PP2C調(diào)節(jié)鏈，控制葉片氣孔運動從而促進衰老；而OsNAP作為AtNAP在水稻(OryzasativaL.)中的同源基因，降低OsNAP基因表達可顯著延緩水稻葉片衰老[43]，以上證實了一些NAC轉(zhuǎn)錄因子可以直接或間接的加速葉片衰老。

4 結(jié)論

本研究基于蒺藜苜蓿成熟葉片與衰老初期、中期、末期葉片的轉(zhuǎn)錄組測序獲得的大量數(shù)據(jù)，共篩選出2 990個差異表達基因，其中1 362個基因顯著上調(diào)，1 628個基因顯著下調(diào)。通過后續(xù)對差異表達基因進行功能注釋以及分析轉(zhuǎn)錄因子等初步探索了蒺藜苜蓿葉片衰老的分子調(diào)控機制，為今后進一步挖掘豆科植物葉片發(fā)育和衰老的調(diào)控機制提供參考。