吳冬凡, 龐杜賢, 林清盛
(1. 廣東藥科大學∥廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心, 廣州 510006; 2. 國藥集團馮了性(佛山)藥業(yè)有限公司, 佛山 528000)
火龍果(Hylocereusundatus‘Foo-Lon’),仙人掌科量天尺植物的果實. 原產(chǎn)中美洲熱帶沙漠地區(qū),現(xiàn)普遍人工栽培,我國主要集中分布在海南、廣東、廣西和貴州. 已有的研究發(fā)現(xiàn),火龍果果皮中含有豐富的天然色素[1]、黃酮類化合物[2]、多糖[3]、膳食纖維[4]和果膠[5]等功能性物質(zhì). 花青素、黃酮類化合物和多糖等天然抗氧化劑在抗炎癥、抑制腫瘤、保護血管等方面發(fā)揮著重要的作用[6],有研究發(fā)現(xiàn)其果皮和果肉是能通過GABA系統(tǒng)介導的抗焦慮物質(zhì)[7]. 還有研究[8]報導使用火龍果果皮提取物作為豬肉片中天然抗氧化劑. AMID 等[9]在果皮中發(fā)現(xiàn)了一種堿性耐熱蛋白酶,其在氧化劑作用下十分穩(wěn)定,并且與抑制劑、表面活性劑、螯合劑共存時未有變化. ANAND-SWARUP等[10]研究火龍果(Hylocereusundatus)提取物對糖尿病心血管并發(fā)癥影響的結(jié)果表明,火龍果中的抗氧化性成分可顯著增強實驗動物機體的抗氧化防御能力,抑制其氧化應(yīng)激,避免由高血糖引發(fā)的主動脈損傷,并降低其僵硬程度.國外在火龍果果皮甜菜素也多有研究,SREEKANTH等[11]的研究結(jié)果表明,甜菜苷可影響人類慢性骨髓性白血病細胞系K562的細胞周期,減弱其增殖,同時促進線粒體釋放細胞色素C,使其進入細胞質(zhì)來誘導K562細胞凋亡. LUO等[12]對果皮提取液(Hylocereus.undatus、Hylocereus.polyrhizus)的研究,發(fā)現(xiàn)其對人前列腺癌細胞系(PC3)、人胃癌細胞系(MGC-803) 和人乳腺癌細胞系(Bcap-37)同樣具有抑制作用. BAI等[13]的研究結(jié)果顯示,火龍果果皮多酚類物質(zhì)對肺癌 A549細胞有顯著的抑制作用.
火龍果果皮是火龍果的外果皮,約占整個火龍果質(zhì)量的1/4. 然而,在火龍果被食用和作為食品染色劑被加工的過程中,其果皮往往作為廢物被丟棄,若能回收利用,可有效提高火龍果的經(jīng)濟附加值. 目前,對火龍果果皮中黃酮和多糖的研究主要集中于其單一成分的提取和測定,未能綜合評價火龍果果皮活性成分含量. 本文利用水浴回流的提取方法,設(shè)計不同提取條件,對火龍果果皮中的黃酮和多糖進行聯(lián)合提取,并對所提取得到的物質(zhì)進行體外抗氧化性研究,為火龍果果皮進一步加工成為天然抗氧化劑的開發(fā)提供理論依據(jù),以提高火龍果的經(jīng)濟附加價值.
實驗材料:火龍果果皮2020年11月購于中山市果蔬市場.
實驗試劑:蘆丁標準品(成都埃法生物科技有限公司,批號:153.18.4),葡萄糖標準品(成都埃法生物科技有限公司,批號:50-99-7),ATBS底物(上海伊卡生物技術(shù)有限公司,批號:30931-67-0),DPPH(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司,批號:1898-66-4),其余試劑均為分析純.
實驗儀器:721 型分光光度計(株式會社日立制作所,U-3900),電子天平 (上海恒平科學儀器有限公司,JA2003),多功能高速中藥粉碎機(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司,DFT-150).
1.2.1 火龍果果皮的預(yù)處理 火龍果皮洗凈熱水殺酶,瀝干水分后于烘箱中60 ℃烘干,粉碎過0.25 mm(60目)篩備用.
1.2.2 供試品的制備 稱取2.00 g火龍果果皮粉末置于圓底燒瓶中,料液比(料、液的單位分別是g、mL,下同)為1∶30、乙醇體積分數(shù)70%、提取溫度70 ℃水浴回流提取3 h,抽濾得到抽濾液,定容至100 mL,得到總黃酮樣品待測液. 從中取出5 mL再定容至100 mL,即得多糖樣品待測液.
1.2.3 對照品的制備 精密稱取10 mg的蘆丁對照品,70%乙醇溶解并定容至50 mL,即得蘆丁對照品溶液. 精密稱取10 mg葡萄糖對照品,蒸餾水溶解后定容至100 mL,即得葡萄糖對照品溶液.
1.2.4 黃酮標準曲線制備及質(zhì)量分數(shù)測定 借鑒王曉波[2]等方法,總黃酮測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法. 分別移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁對照品溶液于25 mL的容量瓶中,加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液,搖勻后靜置6 min;接著加入1 mL 10%硝酸鋁溶液,搖勻后放置6 min;最后加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液,隨后加入70%乙醇定容,放置15 min顯色,以試劑空白管調(diào)零,510 nm處測定吸光值. 以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,擬得蘆丁標準曲線方程為y=0.014x+0.001,R2=0.999 8. 在測定的質(zhì)量濃度范圍8~40 μg/mL之內(nèi),線性關(guān)系良好. 按上述方法測定待測樣品.
式中,C為待測液的質(zhì)量濃度,K為稀釋倍數(shù),V為樣品溶液體積,M為稱取火龍果果皮粉末的質(zhì)量.
1.2.5 多糖標準曲線制備及質(zhì)量分數(shù)測定 參考但德苗[14]等方法,采用苯酚-硫酸比色法進行測定. 取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的標準液定容至10 mL. 分別移取2 mL稀釋后的標準液至帶刻度試管,加入1 mL 5%的苯酚溶液,搖勻,快速垂直注入濃硫酸5 mL,搖勻后置沸水水浴20 min后取出冷卻,以試劑空白管調(diào)零, 490 nm處測定吸光值. 以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,得到多糖的標準曲線方程為y=0.018 6x+0.001 2,R2=0.999 3. 在測定的質(zhì)量濃度10~50 μg/mL之內(nèi),線性關(guān)系良好,按上述方法測定待測樣品.
式中,C為待測液的質(zhì)量濃度,K為稀釋倍數(shù),V為樣品溶液體積,M為稱取火龍果果皮粉末的質(zhì)量.
1.2.6 單因素實驗
(1)提取時間對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響. 分別稱取2.00 g的火龍果果皮粉末,設(shè)計不同梯度提取時間(1、2、3、4、5 h),其他3個因子分別為:料液為1∶30、提取溫度60 ℃、乙醇體積分數(shù)60%,水浴回流提取,每組平行提取3次,測定總黃酮和多糖的質(zhì)量分數(shù).
(2)料液比對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響. 分別稱取2.00 g的火龍果果皮粉末,設(shè)計不同梯度料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60),其他3個因子分別為:提取時間1 h、提取溫度60 ℃、乙醇體積分數(shù)60%,水浴回流提取,每組平行提取3次,測定總黃酮和多糖的質(zhì)量分數(shù).
(3)乙醇體積分數(shù)對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響. 分別稱取2.00 g的火龍果果皮粉末,設(shè)計不同體積分數(shù)(40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇為提取溶劑,其他3個因子分別為:料液比為1∶30、提取時間1 h、溫度60 ℃,水浴回流提取,每組平行提取3次,測定總黃酮和多糖的質(zhì)量分數(shù).
(4)提取溫度對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響. 分別稱取2.00 g的火龍果果皮粉末,設(shè)計不同梯度溫度(50、60、70、80、90 ℃),其他3個因子分別為:提取時間1 h、料液比1∶30、乙醇體積分數(shù)60%,水浴回流提取,每組平行提取3次,測定總黃酮和多糖的質(zhì)量分數(shù).
1.2.7 正交實驗設(shè)計 綜合單因素實驗結(jié)果,提取時間選擇1、2、3 h,料液比選擇1∶30、1∶40、1∶50,乙醇體積分數(shù)選擇50%、60%、70%,提取溫度選擇60、70、80 ℃,設(shè)計四因素三水平的正交實驗,考察4個因子對總黃酮和多糖得率的影響. 正交表設(shè)計見表1.
表1 正交設(shè)計表Table 1 The orthogonal table
1.2.8 抗氧化研究
(1)不同質(zhì)量濃度樣品溶液和對照品溶液的制備. 稱取20.00 g火龍果果皮粉按1.2.2的方法提取得到抽濾液,濃縮至25 mL,移取1 mL定容至100 mL,從中取5 mL定容到50 mL多糖待測液,測得多糖的質(zhì)量濃度為62.24 mg/mL(因為測得多糖的質(zhì)量分數(shù)是總黃酮的15倍,所以抗氧化實驗選取多糖為指標). 從多糖待測液取1 mL定容至100 mL,再從中分別取2.5、5.0、10、15、20、25、30 mL定容到50 mL,得到不同質(zhì)量濃度的樣品溶液(31.12、62.24、124.48、186.72、248.96、311.20、373.44 μg/mL).
精密稱取62.24 mg的抗壞血酸定容到100 mL,分別取2.5、5.0、10、15、20、25、30 mL定容到50 mL,得到抗壞血酸不同質(zhì)量濃度的對照品溶液(31.12、62.24、124.48、186.72、248.96、311.20、373.44 μg/mL).
(2) DPPH·清除能力的測定. 精密稱取5 mg的DPPH,加入無水乙醇溶解并定容至100 mL,置暗處儲存?zhèn)溆? 取7支刻度試管進行編號后,分別加入2 mL DPPH乙醇溶液,再分別加入2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液,放置暗處反應(yīng)30 min. 以無水乙醇調(diào)零,517 nm處測得的吸光值記為A1,另取7支刻度試管編號,以無水乙醇替代DPPH乙醇溶液,測得的吸光值記為A2;另取一支刻度管,加入 2 mL DPPH乙醇溶液和2 mL無水乙醇溶液,測定的吸光值記為A0. 以抗壞血酸作陽性對照. 計算公式如下:
(3)ABTS自由基清除能力的測定.
配制濃度7.0 mmol/L的ABTS儲備液及2.5 mmol/L的過硫酸鉀儲備液,然后按比例1∶1混合均勻,放置12~16 h. ABTS工作液的制備:用無水乙醇稀釋,于734 nm處測得吸光值為0.70±0.02.
取7支刻度管編號且移取4 mL的ABTS工作液,分別加入0.4 mL不同濃度的樣品溶液,搖勻,暗處反應(yīng)6 min,隨后以無水乙醇調(diào)零,在734 nm處測定吸光值,記為A1;另取7支刻度管編號,無水乙醇替代ABTS工作液,測定的吸光值記為A2;另取一支刻度試管,加入4 mL的ABTS工作液和0.4 mL的無水乙醇溶液,測定吸光值并記為A0. 以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作陽性對照[15]. 計算公式如下:
(4)羥基自由基清除能力的測定. 取7支刻度管編號,準確移取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于刻度管中,然后分別加入1 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液和 1 mL 7.5 mmol/L H2O2溶液,震蕩搖勻,反應(yīng) 10 min 后,加入1 mL 7.5 mmol/L 水楊酸-無水乙醇溶液啟動反應(yīng),37 ℃水浴30 min后取出,蒸餾水調(diào)零,510 nm處測定吸光值,記為A1. 另取7支刻度試管,用蒸餾水替代 H2O2作為實驗對照組,測定的吸光值并記為A2. 另取一支刻度試管,以蒸餾水代替樣品溶液,測定的吸光值并記為A0. 以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作陽性對照[16]. 計算公式如下:
2.1.1 提取時間對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響 從表2看出,在提取時間1~5 h內(nèi),總黃酮的質(zhì)量分數(shù)隨著提取時間增加而降低,而多糖的質(zhì)量分數(shù)恰恰相反,其出現(xiàn)的可能原因是受熱時間越長,黃酮類化合物本身是抗氧化劑,容易被氧化. 加熱條件下,隨著時間延長,其含量減少的原因,可能是火龍果果皮中黃酮物質(zhì)被破壞[17]. 綜合總黃酮和多糖的質(zhì)量分數(shù)兩者因素來考量,在提取時間為3 h,多糖的質(zhì)量分數(shù)基本不再增加,而總黃酮的質(zhì)量分數(shù)相對較大,故而從時間、經(jīng)濟等成本來說,提取時間為3 h較適宜.
表2 提取時間對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響
2.1.2 料液比對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響 隨著料液比增大(表3),總黃酮和多糖的質(zhì)量分數(shù)均表現(xiàn)出先快速增加,后趨于平緩再下降的趨勢;當料液比增大至1∶40時達到最大值,繼續(xù)增大料液比則總黃酮質(zhì)量分數(shù)會降低;多糖的質(zhì)量分數(shù)則在料液比為1∶50達到最大值,但此時的值與料液比為1∶40時差異不大,故可認為在料液比為1∶40時總黃酮和多糖已經(jīng)基本完全提取,因而選取料液比為1∶40為其最佳料液比.
表3 料液比對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響
2.1.3 乙醇體積分數(shù)對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響 乙醇體積分數(shù)對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響較大(表4),當乙醇體積分數(shù)增加時,多糖的質(zhì)量分數(shù)先增加后降低,出現(xiàn)的可能原因為:乙醇體積分數(shù)為40%時,提取過程出現(xiàn)較多的凝膠狀物質(zhì),粘附在濾渣上,導致抽濾過程收集得到的濾液不完全,故而總黃酮和多糖的質(zhì)量分數(shù)會偏低;當乙醇體積分數(shù)>60%時,多糖質(zhì)量分數(shù)也較低. 其出現(xiàn)的原因是總黃酮和多糖的極性相差較大,多糖多為水溶性物質(zhì),乙醇體積分數(shù)的增加,多糖提取量自然降低. 對于黃酮類成分而言,在乙醇體積分數(shù)為60%時有最大提取量,而隨著乙醇體積分數(shù)的繼續(xù)增加,黃酮類成分的提取不再增加,此時提取得到的物質(zhì)多為有機酸、樹脂、葉綠素等物質(zhì). 因此,同時考慮總黃酮和多糖的極性差異,選取乙醇體積分數(shù)為60%比較適宜.
表4 乙醇體積分數(shù)對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響
2.1.4 提取溫度對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響 在提取溫度<70 ℃時(表5),總黃酮的提取率隨溫度的升高而增大,之后隨著溫度的升高而減小,在一定溫度范圍內(nèi),溫度的增加有利于黃酮的溶出,但超過一定范圍之后,溫度繼續(xù)升高的情況下,容易導致黃酮被破壞[18];多糖質(zhì)量分數(shù)則無此現(xiàn)象,溫度越高,多糖質(zhì)量分數(shù)越高. 其出現(xiàn)的可能原因是隨著溫度的增加,當提取溫度為70 ℃時,此時總黃酮質(zhì)量分數(shù)有最大值,多糖質(zhì)量分數(shù)雖未達到最大值,但綜合能源損耗、總黃酮質(zhì)量分數(shù)等因素影響,選取提取溫度70 ℃較為適宜.
表5 提取溫度對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響
從表6可以看出,無論以總黃酮質(zhì)量分數(shù)還是多糖質(zhì)量分數(shù)為指標,4個因子對總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的影響由大到小的排序均為C、D、B、A,從單一指標來考量:若以總黃酮質(zhì)量分數(shù)為指標,得到的最優(yōu)條件應(yīng)為A3B1C3D3,即:提取時間3 h,料液比1∶30,乙醇體積分數(shù)70%,提取溫度80 ℃;若以多糖質(zhì)量分數(shù)為指標,得到的最優(yōu)條件應(yīng)為A3B1C3D2,而本次研究需同時考察2個指標,對總黃酮和多糖同時進行考量,以尋求兩者的質(zhì)量分數(shù)達到最大化.
表6 L9(34)正交實驗結(jié)果Table 6 The L9 (34) orthogonal experimental results
從方差分析表(表7、8)可見:不管是總黃酮還是多糖,乙醇體積分數(shù)的影響都是最大的,尤其是對于多糖的影響更大. 當同時考量總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)時,提取時間在3 h時,多糖質(zhì)量分數(shù)最大,而黃酮的質(zhì)量分數(shù)與提取時間為2 h的質(zhì)量分數(shù)差異不大,故而選取3 h作為其最佳提取時間;料液比為1∶30時兩者的質(zhì)量分數(shù)均有最大值,故選取料液比1∶30較適合;當提取溫度為70 ℃的時候,多糖質(zhì)量分數(shù)有最大值,而總黃酮質(zhì)量分數(shù)則在80 ℃最大,但此時的質(zhì)量分數(shù)與70 ℃時相差不大,故綜合考慮后選取提取溫度70 ℃作為其最佳提取溫度;乙醇體積分數(shù)對總黃酮質(zhì)量分數(shù)的影響顯著,而對多糖質(zhì)量分數(shù)的影響不顯著. 但乙醇體積分數(shù)在60%和70%時,多糖的質(zhì)量分數(shù)極差也較大,無法直觀判斷哪個條件更為適合,因而進行2組實驗驗證,選取最佳的提取條件. 即分別以乙醇體積分數(shù)為60%和70%,其他3個因子保持一致(提取時間3 h、料液比1∶30、提取溫度70 ℃),分別進行3次的平行實驗進行驗證. 即選取工藝組合為A3B1C2D2和A3B1C3D2進行結(jié)果驗證.
表7 總黃酮方差分析表Table 7 The variance analysis of total flavonoids
按照上述所示條件分別進行驗證實驗,結(jié)果如下:在提取條件為A3B1C2D2時,總黃酮平均質(zhì)量分數(shù)為7.06 mg/g,RSD為7.43%,多糖的平均質(zhì)量分數(shù)122.75 mg/g,RSD為6.71%. 若在提取條件為A3B1C3D2時,總黃酮平均質(zhì)量分數(shù)為7.87 mg/g,RSD為4.53%,多糖的平均質(zhì)量分數(shù)為114.05 mg/g,RSD為4.54%. 后者相比較于前者,其RSD值更小,即表明其提取總黃酮和多糖的質(zhì)量分數(shù)誤差范圍更小、穩(wěn)定性更好. 綜上所述,本次實驗研究最終確定的火龍果果皮總黃酮和多糖最佳提取條件為:A3B1C3D2,即提取時間3 h,料液比1∶30,乙醇體積分數(shù)70%,提取溫度70 ℃.
表8 多糖方差分析表Table 8 The variance analysis of polysaccharide
2.3.1 不同質(zhì)量濃度樣品對DPPH·的清除效果 抗壞血酸和多糖質(zhì)量濃度在31.12~373.44 μg/mL時(圖1),抗壞血酸和火龍果果皮提取物均對DPPH·表現(xiàn)很強的清除效果. 兩者對DPPH· 清除能力均隨著質(zhì)量濃度的增加而增強,當火龍果果皮提取物中多糖的質(zhì)量濃度增大到373.44 μg/mL時,清除率達到88.64%,此時清除能力與抗壞血酸最大清除率接近.
圖1 不同質(zhì)量濃度樣品對DPPH·的清除效果
2.3.2 不同質(zhì)量濃度樣品對ABTS自由基的清除效果 多糖質(zhì)量濃度為31.12~373.44 μg/mL時(圖2),火龍果果皮提取物表現(xiàn)較強清除能力. 當樣品溶液中多糖為62.24 μg/mL時,清除率僅為16.12%,隨著樣品溶液中多糖質(zhì)量濃度的增加,清除率逐漸增強,增加至373.44 μg/mL,最大清除率可達61.77%,清除效果也不錯.
圖2 不同質(zhì)量濃度樣品對ABTS自由基的清除效果
2.3.3 不同質(zhì)量濃度樣品對·OH的清除效果 在質(zhì)量濃度31.12~373.44 μg/mL之內(nèi)(圖3),抗壞血酸和火龍果果皮提取物均對·OH表現(xiàn)有較強的清除效果,兩者清除率與質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系. 當質(zhì)量濃度增大至373.44 μg/mL時,抗壞血酸對羥基的清除率可達89.99%;而樣品對羥基的清除率為60.84%,達到了抗壞血酸的三分之二,由此可見,火龍果果皮提取物對·OH也有較好的清除效果.
圖3 不同質(zhì)量濃度樣品對·OH的清除效果
本實驗所選用的材料為火龍果果皮,果皮中含有較多的果膠酶,在多糖的提取過程中會分解一定量的果膠,造成提取得到的多糖質(zhì)量分數(shù)減少,故將原材料鮮皮先進行沸水殺酶,沸水殺酶階段也可溶出一部分的色素,降低樣品自身溶液對顯色結(jié)果的影響. 此次研究的提取方法選用水浴回流的方法,而不選用超聲提取,是考慮到目前超聲提取局限于實驗室規(guī)模,主要針對某些具體提取對象進行簡單的工藝條件篩選,推廣應(yīng)用有一定的限制;水浴回流提取則設(shè)備簡單、操作方便、更適合工業(yè)生產(chǎn). 單因素各設(shè)計的5個水平進行實驗,以確定較適合的每個水平,并在此基礎(chǔ)上進行正交實驗確定最佳工藝. 從正交實驗結(jié)果可以看到,乙醇體積分數(shù)和提取溫度是影響總黃酮和多糖質(zhì)量分數(shù)的主要因素,提取溫度越高,多糖質(zhì)量分數(shù)就越高,總黃酮質(zhì)量分數(shù)則降低,因此需把控好提取溫度;此外,在對乙醇體積分數(shù)的驗證實驗時,乙醇體積分數(shù)為70%的時候,總黃酮的平均質(zhì)量分數(shù)會比乙醇體積分數(shù)60%時高,多糖的質(zhì)量分數(shù)則相對低一些,可能是由于兩者的極性引起的,根據(jù)相似相容的原則,總黃酮在70%的乙醇條件下可溶出更多,多糖則在60%乙醇條件下溶出更多. 在兩者多次實驗后,發(fā)現(xiàn)在70%乙醇時RSD值更小,每次提取得到的總黃酮和多糖的質(zhì)量分數(shù)值誤差相對較低,故而選取該條件.
本次研究通過正交實驗篩選得到的火龍果果皮總黃酮和多糖的最佳提取工藝是:提取時間3 h,料液比為1∶30,乙醇體積分數(shù)70%,提取溫度70 ℃. 此條件下提取到的火龍果果皮總黃酮和多糖的平均質(zhì)量分數(shù)分別為7.87 mg/g和114.05 mg/g. 此外,對火龍果果皮的提取物進行一系列的體外抗氧化結(jié)果顯示:火龍果果皮提取物對DPPH·有明顯的清除效果,最大清除率達到88.64% ;對·OH及ABTS自由基有良好的清除效果,最大清除率分別達到60.84%和61.77%. 本研究優(yōu)化了火龍果果皮總黃酮和多糖的提取工藝,探討了火龍果果皮提取物的體外抗氧化活性能力,對后續(xù)火龍果果皮資源的利用具有參考價值.