邵 波，黨雯迪，閆麗君，孫云秀，施 璠，黃玉豪，王曉峰，孫 偉*

（1.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，?？谑泄δ懿牧吓c光電化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158；2.清華大學(xué) 精密儀器系，北京 100084）

辣根過氧化物酶（HRP）是一種重要的工具酶，被廣泛用于開發(fā)基于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)[1]、酶聯(lián)適配體檢測實(shí)驗(yàn)[2]、抗原和抗體的生物標(biāo)記物[3]以及其他基于酶催化反應(yīng)[4]的生化檢測方法。開發(fā)檢測HRP的方法具有非常重要的意義，目前HRP檢測方法主要基于光學(xué)檢測和電化學(xué)檢測[5]等方法，建立一種快速、準(zhǔn)確、便捷和低成本的測試方法極其重要。

電化學(xué)分析中傳統(tǒng)的三電極體系不能滿足體積小、易攜帶以及快速檢測等需求，因此，在基底上集成芯片三電極系統(tǒng)更加受到研究者的關(guān)注[6]，相比較傳統(tǒng)電極，其具有極高的穩(wěn)態(tài)電流密度、極短的響應(yīng)時(shí)間和很小的IR降[7]。芯片電化學(xué)傳感器可以實(shí)現(xiàn)小型化、智能化和無線傳輸，使得集成三電極體系在小空間的檢測領(lǐng)域更加重要。Zhu等人采用二維層狀納米材料修飾芯片電極，結(jié)合智能手機(jī)和無線傳輸，實(shí)現(xiàn)了對植物生長調(diào)節(jié)劑萘乙酸的快速檢測[8]。Zhang等人通過乙酰膽堿酯酶修飾石墨烯手性芯片電極制備了一種高靈敏度的芯片傳感器，結(jié)合無線傳輸技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對甲胺磷的實(shí)時(shí)快速檢測[9]。

本文設(shè)計(jì)了一種芯片三電極系統(tǒng)，以金盤電極為工作電極，金片電極為輔助電極，銀/氯化銀（Ag/AgCl）電極為參比電極，具有樣品用量少、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，以鄰聯(lián)茴香胺（ODA）和鄰苯二胺（OPD）作為底物體系建立了檢測辣根過氧化物酶（HRP）的方法。圖1為芯片三電極系統(tǒng)示意圖。

圖1芯片三電極系統(tǒng)(A)和芯片電極的使用示意圖（B）Figure 1 Schematic diagram of chip three-electrode system (A)and using chip electrodes(B)

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CHI 660E型電化學(xué)工作站，上海辰華儀器公司；金基底芯片三電極和Ag/AgCl漿料由清華大學(xué)精密儀器系提供。

1.0×10-3g/mL HRP 溶液，上海雪滿生物科技有限公司，＞250 U/mg，4 ℃冰箱保存，使用時(shí)用水逐級(jí)稀釋；2.0×10-2mol/L ODA溶液，山東西亞化學(xué)科技有限公司；5.0×10-2mol/L OPD溶液，天津市大茂化學(xué)試劑廠；1.2×10-2mol/L H2O2溶液；0.1 mol/L KHPO4-Na2HPO4緩沖溶液；0.2 mol/L Britton-Robinson（B-R）緩沖溶液；0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液。所用試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芯片三電極系統(tǒng)的構(gòu)建

先將芯片的三電極依次用硝酸（1+1）、乙醇（1+1）和蒸餾水超聲清洗（5～8 min/次），得到一個(gè)潔凈的電極表面，待電極表面干燥后，在作為參比電極的金片基底上，每平方毫米完全涂覆0.5±0.1 mg的Ag/AgCl漿料，得到Ag/AgCl參比電極，并與金盤電極（工作電極）、金片電極（輔助電極）構(gòu)成芯片三電極系統(tǒng)。

1.2.2 ODA-H2O2-HRP體系的電化學(xué)檢測

于10 mL比色管中依次加入2.0×10-2mol/L ODA 溶液3.0 mL、1.2×10-2mol/L H2O2溶液1.0 mL、0.1 mol/L pH為5.8 KHPO4-Na2HPO4溶液1.0 mL、不同濃度的HRP溶液100 μL、無水乙醇4 mL，用超純水稀釋至刻度后搖勻，于37 ℃水浴中反應(yīng)15 min后取出。移取此反應(yīng)液2.0 mL 于另一支5 mL 比色管中，加入1.0 mL pH 2.0 B-R 緩沖溶液，用超純水稀釋至5.0 mL，搖勻，將此溶液取出10 μL 移至芯片三電極電解池中，于CHI 660E型電化學(xué)工作站上記錄酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的伏安曲線。差分脈沖伏安法（DPV）采用的起始電位為-0.05 V，終止電位為-0.25 V，電位增量為0.004 V，靜止時(shí)間為2 s。CV法采用的起始電位為0 V，終止電位為-0.55 V，掃速為0.1 V/s。

1.2.3 OPD-H2O2-HRP體系的電化學(xué)檢測

于10 mL 比色管中依次加入5.0×10-2mol/L OPD 溶液1.0 mL、4.0×10-3mol/L H2O2溶液2.0 mL、0.1 mol/L pH為4.8的HAc-NaAc溶液2.0 mL，不同濃度的HRP溶液200 μL、無水乙醇4 mL，用水稀釋至刻度后搖勻，于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min后取出。移取此反應(yīng)液3.0 mL于另一支10 mL比色管中，加入2.0 mL pH 2.0 B-R緩沖溶液，搖勻，將此溶液取出10 μL移至芯片三電極電解池中，于CHI 660E型電化學(xué)工作站上記錄酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的伏安曲線。CV法采用的起始電位為0 V，終止電位為-0.80 V，掃速為0.1 V/s。

2 結(jié)果與討論

2.1 芯片電極系統(tǒng)的電化學(xué)表征

以金盤電極（Φ=2 mm）為工作電極，金片電極為輔助電極，Ag/AgCl電極為參比電極構(gòu)建了芯片三電極系統(tǒng)，與常規(guī)三電極系統(tǒng)（金盤電極為工作電極和對電極，直徑Φ=2 mm）在鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描并進(jìn)行對比，結(jié)果如圖2所示，CV圖相差不大，且Ipa/Ipc ≈1，所構(gòu)建的芯片三電極系統(tǒng)具有良好的電化學(xué)行為。

圖2 常規(guī)金三電極系統(tǒng)（a）和金芯片三電極系統(tǒng)（b）在0.01 mol/L K3[Fe(CN)4]溶液中的循環(huán)伏安曲線（掃描速度0.1 V/s）Figure 2 The CV curves of traditional gold three-electrode system (a)and gold chip three-electrode system(b)in 0.01 mol/L K3[Fe(CN)6]solution at scan rate of 0.1 V/s

2.2 酶催化反應(yīng)體系的電化學(xué)行為

最佳條件下ODA-H2O2-HRP反應(yīng)體系典型的CV曲線如圖3（A）所示，在ODA-H2O2溶液中CV掃描無明顯氧化還原峰，在ODA-H2O2-HRP溶液的CV掃描中位于-0.20 V處出現(xiàn)一個(gè)峰，為酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的還原峰，但反掃時(shí)無氧化峰出現(xiàn)，表明產(chǎn)物在金電極上發(fā)生不可逆還原反應(yīng)，這是HRP催化H2O2氧化ODA生成的雙偶氮聯(lián)苯物質(zhì)[10]在金圓盤電極上的還原所致。

最佳條件下OPD-H2O2-HRP反應(yīng)體系典型的CV曲線如圖3（B）所示，在OPD-H2O2溶液中CV掃描無明顯氧化還原峰，在OPD-H2O2-HRP溶液的CV掃描中位于-0.50 V和-0.42 V處出現(xiàn)一對峰，為反應(yīng)產(chǎn)物的氧化還原峰，它是酶催化OPD生成的2，3-二氨基吩嗪電活性物質(zhì)[11]在金圓盤電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)所致。

圖3 ODA-H2O2-HRP反應(yīng)體系（A）和OPD-H2O2-HRP反應(yīng)體系（B）在0.2 mol/L pH 2.0 B-R溶液中的CV圖（掃速為0.1 V/s）Figure 3 CV curves of ODA-H2O2-HRP（A）and OPD-H2O2-HRP（B）reaction system in 0.2 mol/L pH 2.0 B-R at scan rate of 0.1 V/s

2.3 酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)行為

考察了B-R緩沖液的pH值（1.5～4.0）對HRP催化H2O2氧化ODA反應(yīng)產(chǎn)物在芯片電極上的電化學(xué)行為的影響，循環(huán)伏安結(jié)果如圖4（A）所示。隨著溶液pH值的增大，還原峰發(fā)生了負(fù)移且逐漸消失，在pH=2.0時(shí)獲得最大電流，因此，選取pH值為2.0的B-R作為電解質(zhì)溶液進(jìn)行電化學(xué)研究測試。

考察了B-R緩沖液的pH值（2.0～5.0）對HRP催化氧化OPD反應(yīng)產(chǎn)物在微電極上的電化學(xué)行為的影響，循環(huán)伏安結(jié)果如圖4（B）所示。隨著溶液pH值的增大，氧化還原峰發(fā)生了負(fù)移且逐漸消失，在pH=2.0時(shí)獲得最大電流，因此，選取pH值為2.0的B-R作為電解質(zhì)溶液進(jìn)行電化學(xué)研究測試。

圖4 ODA氧化產(chǎn)物（A）和OPD氧化產(chǎn)物（B）在芯片電極上的0.2 mol/L 不同pHB-R溶液中的循環(huán)伏安圖（掃速為0.1 V/s）Figure 4 CV curves of ODA oxidation products(A)and OPD oxidation products(B)in 0.2 mol/L B-R solution with different pH on the chip electrode at scan rate of 0.1 V/s

研究了掃描速度對ODA氧化產(chǎn)物在金電極上電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)的影響，結(jié)果如圖5（A）所示?？梢杂^察到隨著掃描速度的增加，還原峰的峰電位發(fā)生負(fù)移。在掃描速度為50～800 mV/s的范圍內(nèi)，還原峰電流（Ip）和掃描速度（υ）呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Ipc（μA）=8.718υ+1.336（γ=0.992），證明電極界面上發(fā)生的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)是一個(gè)動(dòng)力學(xué)控制響應(yīng)過程。峰電位與掃描速度的對數(shù)（lnυ）之間具有線性關(guān)系，其線性方程為Ep（V）=-0.046 lnυ-0.290（γ=0.980）。

研究了掃描速度對OPD氧化產(chǎn)物在金盤電極上電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)的影響，結(jié)果如圖5（B）所示?？梢杂^察到隨著掃描速度的增加，峰電流增加但峰電位基本不變。在掃描速度為100～1000 mV/s的范圍內(nèi)，氧化還原峰電流（Ip）和掃描速度（υ）呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Ipc（μA）=18.719υ+6.838（γ=0.997）和Ipa（μA）=-13.214υ+0.845（γ=0.999），證明電極界面上發(fā)生的是吸附控制過程。

圖5 不同掃速下ODA氧化產(chǎn)物（A）和OPD氧化產(chǎn)物（B）在圓盤電極上的循環(huán)伏安曲線Figure 5 CV curves of ODA oxidation products(A)and OPD oxidation products(B)on the disk electrode at different scan rates

2.4 測定HRP的工作曲線

采用DPV 考察了芯片三電極系統(tǒng)對酶催化ODA 和OPD 與H2O2反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)還原行為。圖6（A）為ODA產(chǎn)物的DPV曲線，當(dāng)HRP的濃度在5.0×10-7～1.0×10-5g/mL范圍內(nèi)，峰電流和酶濃度具有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為I（A）=0.106C（g/mL）-4.013×10-8（γ=0.993），檢測下限為1.0×10-7g/mL。圖6（B）為OPD產(chǎn)物的DPV曲線，當(dāng)HRP的濃度在1.0×10-8～10×10-4g/mL范圍內(nèi)，還原峰電流和酶濃度的對數(shù)值具有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為I（μA）=0.897 lnC（g/mL）+16.64（γ=0.991），檢測下限為1.0×10-9g/mL，以上結(jié)果表明，芯片電極用于檢測HRP 具有低的檢測限和較寬的檢測范圍，呈現(xiàn)出良好的靈敏度。

圖6 芯片電極在不同酶濃度下催化ODA（A）或OPD（B）和H2O2反應(yīng)后反應(yīng)產(chǎn)物的差分脈沖伏安圖，插圖是峰電流與酶濃度之間的線性關(guān)系圖Figure 6 DPV curves of the reaction products of ODA(A)and OPD(B)at different concen?trations of enzyme，inset is relationship between the peak current and enzyme concentration

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)了一種集工作電極（金盤電極）、輔助電極（金片電極）和參比電極（Ag/AgCl）于同一芯片上的三電極系統(tǒng)，其不僅保持了傳統(tǒng)電極優(yōu)良的導(dǎo)電性能，更表現(xiàn)出體積小、便攜等優(yōu)點(diǎn)。利用該芯片電極構(gòu)建了一種微型電化學(xué)傳感器，成功實(shí)現(xiàn)了對HRP催化H2O2氧化ODA和OPD產(chǎn)物的檢測，從而間接測得HRP的濃度，檢測結(jié)果較好。