賀夢(mèng)璇，楊鈴，張俊芳，秦柏，顧宏衛(wèi)，唐秋陽(yáng)，管懷進(jìn)，石海紅

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，江蘇 南通 226001)

翼狀胬肉是常見(jiàn)的眼表疾病之一，臨床上表現(xiàn)為瞼裂區(qū)球結(jié)膜與角膜上的一種贅生組織[1]。翼狀胬肉初期通常無(wú)不適或僅有輕微的干澀感、異物感等癥狀，當(dāng)胬肉發(fā)展侵入角膜則會(huì)導(dǎo)致角膜散光[2]、視力下降，若增生組織越過(guò)瞳孔遮蓋視軸則會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。翼狀胬肉局部浸潤(rùn)發(fā)展、術(shù)后易復(fù)發(fā)的行為學(xué)特點(diǎn)，以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、雜合性丟失、p53基因突變及端粒酶表達(dá)上調(diào)等發(fā)病機(jī)制均與腫瘤相類似，故部分學(xué)者認(rèn)為其是一種腫瘤樣病變[3]。VM是Maniotis等[4]于1999年在葡萄膜黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤微循環(huán)模式，它是由高度侵襲性的腫瘤細(xì)胞通過(guò)自身變形及細(xì)胞外基質(zhì)重塑形成，管腔無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，且可與宿主血管相連通使腫瘤獲得血液供應(yīng)[5]。VM的管壁呈PAS染色陽(yáng)性，而血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31則不表達(dá)，符合其不依賴血管內(nèi)皮細(xì)胞的特性，因此CD31/PAS雙重染色常作為組織VM的檢測(cè)方法。有研究發(fā)現(xiàn)，VM也存在于翼狀胬肉組織中，參與胬肉的血液供應(yīng)[6]，且VM與進(jìn)展期翼狀胬肉呈顯著正相關(guān)[7]。但VM與翼狀胬肉復(fù)發(fā)的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道，本研究從組織水平及細(xì)胞水平對(duì)比初發(fā)型和復(fù)發(fā)型翼狀胬肉血管生成擬態(tài)的情況，以探討VM與翼狀胬肉復(fù)發(fā)的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

收集2019年6月至2020年1月于南通大學(xué)附屬醫(yī)院眼科行翼狀胬肉切除手術(shù)患者的初發(fā)型翼狀胬肉標(biāo)本105例，男35例，女70例，年齡(60.46±9.21)歲；以及2019年1月至2020年12月于本院行同一手術(shù)的復(fù)發(fā)型翼狀胬肉標(biāo)本34例，男12例，女22例，年齡(63.47±9.66)歲；另選10例于本院捐獻(xiàn)眼球的正常結(jié)膜組織作為對(duì)照，男5例，女5例，年齡(68.20±8.52)歲。所有患者胬肉位于鼻側(cè)，且排除其他眼表疾病及眼部外傷史、手術(shù)史和長(zhǎng)期用藥史，手術(shù)均由同一醫(yī)生完成，所取標(biāo)本均為完整的翼狀胬肉組織。所有對(duì)照組患者無(wú)眼表疾病、眼部外傷史、手術(shù)史和長(zhǎng)期用藥史。本研究遵循赫爾辛基宣言，通過(guò)南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與儀器

檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、PAS染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；GTVisionTMIII抗鼠/抗兔通用型免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上?；蚩萍加邢薰荆籆D31抗體、Vimentin抗體、Cytokeratin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶-EDTA、DMEM/F12培養(yǎng)基及DMSO購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BectonDickinson公司；DM3000光學(xué)顯微鏡及顯微攝像系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3 CD31/PAS 免疫組織化學(xué)雙重染色

將術(shù)中取下的正常結(jié)膜及翼狀胬肉組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，以組織長(zhǎng)軸連續(xù)縱切，制成厚度約為4 μm的切片，脫蠟至水，65 ℃烘箱中干燥40 min，PBST(含0.05%Triton-100的PBS溶液)漂洗3次，每次5 min，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)15～20 min，PBST漂洗5 min×3次，3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性20 min(避光)，PBST漂洗3次，每次5 min，10%山羊血清封閉40 min，不洗，加入CD31(1:50)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。復(fù)溫，PBST漂洗3次，每次5 min，滴加抗鼠/抗兔通用型二抗 37 ℃孵育30 min，PBST漂洗3次，每次5 min，DAB顯色，蒸餾水浸洗，高碘酸氧化5 min，蒸餾水浸洗，Schiff氏液避光染色10 min，蒸餾水浸洗，蘇木精染核5 min，稀鹽酸乙醇分化2～5 s，自來(lái)水漂洗，蒸餾水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，自然干燥后中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定

將手術(shù)切除的新鮮翼狀胬肉組織用含1%青霉素-鏈霉素的PBS緩沖液漂洗3次，洗凈血液，去除上皮，剪碎，加入0.08%胰蛋白酶-EDTA，室溫消化8 min后終止，1 500 r/min離心5 min棄上清，利用牙科探針將組織小塊均勻接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入少許完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶底朝上置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，24 h后待組織小塊貼壁，加入適量完全培養(yǎng)基，緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)，每3 d換液一次。

取傳至第二代的細(xì)胞接種爬片，4%多聚甲醛固定1 h，PBS漂洗3次，每次5 min，0.2%Triton-100通透20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、封閉同1.3，加入Vimentin(1:500)、Cytokeratin(1:50)及PBS(陰性對(duì)照)，4 ℃孵育過(guò)夜。復(fù)溫，PBS漂洗3次，每次5 min，二抗37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min，DAB顯色，染核，分化，返藍(lán)，脫水，透明，封片，觀察同1.3。

1.5 細(xì)胞三維培養(yǎng)及PAS 染色

取出Matrigel膠，4 ℃解凍過(guò)夜。將Matrigel膠以50 μL的體積緩慢加至96孔板，不可產(chǎn)生氣泡。為避免Matrigel膠受熱凝固，所有操作必須在冰上進(jìn)行，且所用的槍頭及96孔板均需預(yù)冷。將鋪好膠的96孔板置于37 ℃孵箱內(nèi)30 min使其固化。將初發(fā)型HPFs及復(fù)發(fā)型HPFs分別以1×105個(gè)/孔的數(shù)量接種于Matrigel膠上，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)排列及成管的完整程度，隨機(jī)取3個(gè)不同視野(×100)計(jì)數(shù)成管的數(shù)量，計(jì)算平均值。觀察完成后，將上述培養(yǎng)5 h后的細(xì)胞行PAS染色。染色步驟為高碘酸氧化5 min，蒸餾水稍洗，Schiff氏液避光染色10 min，稀鹽酸酒精分化2～5 s，水洗2次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用Pearson Chi-Square檢驗(yàn)，雙變量相關(guān)性分析采用Spearman’s相關(guān)性分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VM 在翼狀胬肉中的表達(dá)

CD31/PAS免疫組織化學(xué)雙重染色結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31染色陽(yáng)性呈棕黃色，管壁PAS染色陽(yáng)性呈紫紅色，為具有內(nèi)皮細(xì)胞的正常血管；CD31染色陰性，PAS染色陽(yáng)性的管道狀結(jié)構(gòu)，是VM的特有形態(tài)。本研究統(tǒng)計(jì)得出，10例正常結(jié)膜均未見(jiàn)VM結(jié)構(gòu)，初發(fā)型翼狀胬肉VM陽(yáng)性率43.81%(46/105)，復(fù)發(fā)型翼狀胬肉VM陽(yáng)性率82.35%(28/34)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。Spearman’s相關(guān)性分析顯示VM與復(fù)發(fā)型翼狀胬肉(r=0.332，P<0.001)呈顯著正相關(guān)。

表1 翼狀胬肉中VM的表達(dá)Table 1 Expression of VM in pterygium

圖1 翼狀胬肉中VM的表達(dá)(×400)Figure 1 Expression of VM in pterygium (×400)

2.2 VM 在翼狀胬肉中的表達(dá)與患者一般資料的關(guān)系

根據(jù)患者的性別、年齡及病程，分別觀察VM在不同指標(biāo)分組中的表達(dá)情況。Pearson Chi-Square檢驗(yàn)結(jié)果提示，不同性別、年齡及病程的翼狀胬肉患者VM的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，表2)。

表2 翼狀胬肉VM與患者一般資料的關(guān)系Table 2 Correlation between the VM and the general information of pterygium patients

2.3 HPFs 原代培養(yǎng)及鑒定

翼狀胬肉組織塊接種后10 d，初發(fā)組可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊向周?chē)l(fā)散爬出，數(shù)量較少，分布較為零星(圖2A)。復(fù)發(fā)組爬出的細(xì)胞較初發(fā)組多，且相互連接，細(xì)胞形態(tài)多為長(zhǎng)梭形、三角形，逐漸向四周延伸(圖2B)。由于成纖維細(xì)胞對(duì)胰酶的耐受性較差，故當(dāng)細(xì)胞傳至第2代時(shí)已基本純化，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，長(zhǎng)滿后呈旋渦狀(圖2C)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示PBS空白對(duì)照組及Cytokeratin染色均為陰性(圖3A，3B)，Vimentin染色陽(yáng)性，表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色(圖3C)，符合成纖維細(xì)胞特性。

圖2 HPFs原代培養(yǎng)(×100)Figure 2 Primary culture of HPFs (×100)

圖3 HPFs鑒定(×200)Figure 3 Identification of HPFs (×200)

2.4 不同類型HPFs 構(gòu)建VM 的差異

細(xì)胞三維培養(yǎng)結(jié)果顯示：HPFs能夠黏附于Matrigel膠表面，通過(guò)細(xì)胞自身變形、彼此相連形成大小不等的網(wǎng)格樣、環(huán)狀管腔結(jié)構(gòu)，且PAS染色呈陽(yáng)性，提示管腔樣結(jié)構(gòu)是由HPFs構(gòu)成，即VM結(jié)構(gòu)(圖4A)。圖4B可見(jiàn)復(fù)發(fā)型HPFs所構(gòu)成的VM管腔較初發(fā)型大，且數(shù)量較初發(fā)型多。初發(fā)型和復(fù)發(fā)型HPFs形成VM的個(gè)數(shù)分別為21.00±2.65、30.33±1.53，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=?5.292，P=0.006；圖4C)。

圖4 HPFs構(gòu)建體外VM模型(×100)Figure 4 VM model was constructed by HPFs in vitro (×100)

3 討論

翼狀胬肉是全球范圍內(nèi)較為多發(fā)的眼科疾病[8]。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，中國(guó)40歲及以上人群翼狀胬肉患病率為13.4%[9]，處于較高水平，且隨著年齡的增長(zhǎng)而不斷升高，好發(fā)于長(zhǎng)期紫外線暴露的人群，日光、粉塵等的慢性刺激[10]可能是其主要誘因。翼狀胬肉類腫瘤樣特性為其表達(dá)VM奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

VM是最新發(fā)現(xiàn)的腫瘤微循環(huán)模式，其主要特點(diǎn)如下[11-12]：1)管道由腫瘤細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成；2)管腔內(nèi)壁沒(méi)有血管內(nèi)皮細(xì)胞襯里；3)腫瘤細(xì)胞變形成條索狀并模仿正常血管結(jié)構(gòu)圍成管腔，可輸送血液；4)腫瘤細(xì)胞在管壁成分外表面排列；5)管道周?chē)鸁o(wú)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，VM表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤存在更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的能力[13-14]。目前，在乳腺癌[15]、卵巢癌[16]、肺癌[17]、前列腺癌[18]、肝癌[19]等許多惡性腫瘤中均檢測(cè)到VM結(jié)構(gòu)。VM的管壁呈PAS染色陽(yáng)性，而血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31則不表達(dá)，符合其不依賴血管內(nèi)皮細(xì)胞的特性，因此CD31/PAS雙重染色常作為組織VM的檢測(cè)方法。

本研究采用CD31/PAS雙重染色檢測(cè)翼狀胬肉中的VM結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：翼狀胬肉中存在VM結(jié)構(gòu)，而正常結(jié)膜中未見(jiàn)，且復(fù)發(fā)型翼狀胬肉VM陽(yáng)性率大于初發(fā)型，VM與復(fù)發(fā)型翼狀胬肉呈顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果與李永平等[6]的結(jié)論共同支持了“VM結(jié)構(gòu)不是腫瘤組織所獨(dú)有的血供模式”這一觀點(diǎn)。推測(cè)VM是由于機(jī)體局部組織由于某些原因需要大量的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，但自身血管不能滿足其需要而形成的一種供給方式。復(fù)發(fā)型翼狀胬肉組織中細(xì)胞增殖水平較初發(fā)型翼狀胬肉顯著升高[20]，即復(fù)發(fā)型胬肉進(jìn)展速度快、時(shí)間短，需要較多的血液供應(yīng)，故VM形成率較高。同時(shí)，VM結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，使胬肉獲得充分的血液供應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)了翼狀胬肉的進(jìn)展。一般資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果得出，不同性別、年齡及病程的翼狀胬肉患者VM的表達(dá)無(wú)顯著差異。這些結(jié)果與腫瘤組織中VM陽(yáng)性者具有更強(qiáng)的侵襲及復(fù)發(fā)的能力，VM陽(yáng)性率與腫瘤患者一般資料無(wú)顯著相關(guān)性相對(duì)應(yīng)。

李永平等[6]指出，翼狀胬肉VM主要表現(xiàn)為PAS陽(yáng)性的細(xì)胞外基質(zhì)包繞在成纖維細(xì)胞伸出的突起表面形成的管道狀結(jié)構(gòu)，即成纖維細(xì)胞是構(gòu)成翼狀胬肉VM的主要成分，因此本研究使用原代培養(yǎng)的HPFs構(gòu)建體外VM。對(duì)于體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞而言，其可與Matrigel基質(zhì)膠或鼠尾I型膠原蛋白等模擬的細(xì)胞外基質(zhì)成分一起構(gòu)建體外細(xì)胞培養(yǎng)的三維模型，如果腫瘤細(xì)胞可以在Matrigel基質(zhì)膠或鼠尾I型膠原蛋白中通過(guò)自身變形、彼此相互連接而圍成環(huán)狀、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且可被PAS染成紫紅色，則可將其認(rèn)定為VM結(jié)構(gòu)，這種方法常被用來(lái)作為體外VM的檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)：在翼狀胬肉中，具有侵襲性的HPFs也能夠黏附于Matrigel基質(zhì)膠表面，通過(guò)細(xì)胞自身變形、彼此相連形成大小不等的網(wǎng)格樣、環(huán)狀管腔結(jié)構(gòu)，且PAS染色呈陽(yáng)性，提示HPFs具有在體外形成VM結(jié)構(gòu)的能力，進(jìn)一步驗(yàn)證了李永平等[6]的觀點(diǎn)。經(jīng)過(guò)對(duì)初發(fā)型及復(fù)發(fā)型HPFs構(gòu)成VM管腔數(shù)量的統(tǒng)計(jì)得出，復(fù)發(fā)型HPFs構(gòu)成的VM管腔數(shù)量明顯較初發(fā)型多?？赡茉蚴菑?fù)發(fā)型翼狀胬肉向角膜及深層浸潤(rùn)發(fā)展迅速[21]，其成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲及遷移能力，故可形成較多的VM結(jié)構(gòu)。

綜上所述，翼狀胬肉組織中存在VM結(jié)構(gòu)，可作為其血供途徑之一，且復(fù)發(fā)型翼狀胬肉VM陽(yáng)性率及復(fù)發(fā)型HPFs構(gòu)建VM的數(shù)量均高于初發(fā)型，即VM與翼狀胬肉的復(fù)發(fā)密切相關(guān)。因此，進(jìn)一步研究針對(duì)VM的靶向藥物，可能對(duì)預(yù)防翼狀胬肉復(fù)發(fā)具有重大意義。

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