張?jiān)弃Q，角攀偉，胡永金，龔加順

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

三川火腿是云南省麗江市三川壩特有傳統(tǒng)食品，主要利用自然發(fā)酵，不使用硝鹽及火硝防腐劑和添加劑，是營(yíng)養(yǎng)豐富的食品[1]。由于三川火腿是在自然條件下發(fā)酵成熟，所以發(fā)酵過(guò)程中微生物大多來(lái)源于環(huán)境中的雜菌和火腿中本身存在的優(yōu)勢(shì)菌，一些具有氨基酸脫羧酶活性的菌會(huì)使火腿中的氨基酸脫羧形成生物胺[2]。生物胺是存在于生物體內(nèi)的一類低分子含氮有機(jī)化合物的總稱[3]，它是生物體合成某些化合物的前體物質(zhì)，適量的生物胺對(duì)機(jī)體的生理代謝具有促進(jìn)作用，過(guò)量攝入會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用，攝入部分種類的生物胺也會(huì)對(duì)人體造成危害，其中組胺和酪胺對(duì)人體的危害最大[4]。

影響生物胺形成的因素主要有三方面：一是可利用的游離氨基酸，二是能促使相應(yīng)氨基酸發(fā)生脫羧作用的微生物存在，三是有利于細(xì)菌生長(zhǎng)的適宜條件[5]。假單胞菌、腸細(xì)菌、非發(fā)酵劑葡萄球菌、微球菌和乳酸菌都屬于發(fā)酵肉制品中的產(chǎn)胺菌[6]。因此，針對(duì)火腿中的產(chǎn)胺菌，了解并掌握腌制火腿中生物胺的產(chǎn)生機(jī)理及變化規(guī)律，可以有效地控制生物胺的產(chǎn)生。筆者利用從三川火腿中分離鑒定的產(chǎn)胺菌——糞腸球菌，研究環(huán)境條件對(duì)糞腸球菌產(chǎn)酪胺的影響，并通過(guò)響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化糞腸球菌培養(yǎng)條件來(lái)降低酪胺產(chǎn)量，為降低火腿中生物胺含量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糞腸球菌(Enterococcus faecalis)菌種是云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室從三川火腿樣品中分離純化后經(jīng)鑒定保存的純種菌株。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：美國(guó)Thermo Fisher 科技公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo Fisher 科技公司；低溫高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1糞腸球菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

根據(jù)菌液的OD600nm值測(cè)定菌株的生長(zhǎng)曲線[7]：配制模擬肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L，牛肉浸粉20 g/L，葡萄糖10 g/L，氯化鈉30 g/L，亞硝酸鈉0.15 g/L，色氨酸0.5 g/L，酪氨酸0.5 g/L，苯丙氨酸0.5 g/L，組氨酸0.5 g/L，賴氨酸0.5 g/L，精氨酸0.5 g/L，鳥氨酸0.5 g/L，用蒸餾水配制)。將活化好的糞腸球菌菌液按接種量1%分別接種到不同的三角瓶中，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 h 取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值，連續(xù)監(jiān)測(cè)24 h。測(cè)定菌液的OD600nm值、pH 值及酪胺產(chǎn)量。

1.3.2影響糞腸球菌生長(zhǎng)代謝及產(chǎn)酪胺能力的研究

選取溫度(10、15、20、25、30 和35 ℃)、pH (4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 和6.5)、NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、3.0%、5.0%、8.0%、10.0%、12.0%和15.0%)和供氧條件(對(duì)照、微厭氧和富氧)等4 個(gè)在發(fā)酵過(guò)程中起主要作用的因素為條件環(huán)境，通過(guò)對(duì)OD600nm值、pH 值和酪胺產(chǎn)量3 個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)，分析不同的環(huán)境條件對(duì)糞腸球菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酸和產(chǎn)酪胺能力的影響[8]。其中，供氧條件的具體設(shè)置為將接種好菌懸液的培養(yǎng)試管分為3 組：1 組使用封口膜將試管口密封，形成微厭氧的培養(yǎng)環(huán)境，30 ℃下靜置培養(yǎng)；1 組只加蓋可透氣的硅膠塞，同時(shí)置于搖床上200 r/min振蕩培養(yǎng)，使培養(yǎng)液中混入氧氣，形成有氧培養(yǎng)環(huán)境；1 組作為對(duì)照組，加蓋可透氣的硅膠塞在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3.3響應(yīng)面試驗(yàn)

為獲得糞腸球菌產(chǎn)生物胺的最低水平條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Design-Expert V8.0.6.1 軟件，根據(jù)Box-behnken的中心組合試驗(yàn)原理，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)[9]，以酪胺含量為響應(yīng)值，選取溫度、初始pH 和NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為單因素，進(jìn)行3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將得到的最優(yōu)水平組合條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.3.4菌液酪胺含量測(cè)定

菌液中生物胺含量的測(cè)定采用高效液相色譜法，用丹磺酰氯柱前衍生法對(duì)待測(cè)菌液進(jìn)行處理和衍生[10]。在2 mL的樣品保存管中加1 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液，用移液槍吸取1 mL 離心好的上清液與之混勻；取混勻后的溶液1 mL，依次加入200 μL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液、300 μL飽和碳酸氫鈉溶液和2 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯丙酮溶液，60 ℃水浴15 min，期間注意避光。加熱完成后，取出冷卻至室溫，加入100 μL氨水避光處理30 min，結(jié)束后加入乙腈定容至5 mL，使用一次性注射器吸取處理液，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中進(jìn)行分析檢測(cè)。色譜條件：色譜柱Thermo-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A 為水，流動(dòng)相B 為乙腈，梯度洗脫程序?yàn)椋?0 min 內(nèi)乙腈由60%升到100%，保持4 min，5 min 內(nèi)乙腈由100%降到60%，保持6 min，整個(gè)程序運(yùn)行35 min；流速1.0 mL/min；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)的基本統(tǒng)計(jì)用Excel 2010 軟件進(jìn)行，采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1 軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和結(jié)果優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞腸球菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

如圖1 所示：糞腸球菌在0～2 h 時(shí)OD600nm值增長(zhǎng)緩慢，表明該時(shí)期糞腸球菌處于延滯期；接種2 h 后其菌液的OD600nm值開始迅速上升，持續(xù)到14 h 時(shí)增長(zhǎng)減慢，表明糞腸球菌在2～14 h間處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；14～18 h 期間增長(zhǎng)緩慢，基本維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，說(shuō)明糞腸球菌在該時(shí)段處于穩(wěn)定期；18 h 以后曲線呈下降趨勢(shì)，出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，說(shuō)明糞腸球菌的生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。24 h 內(nèi)菌液中的pH 值呈現(xiàn)先下降后趨于平緩的趨勢(shì)，14 h 后pH 值穩(wěn)定在4 左右。糞腸球菌在24 h 內(nèi)酪胺含量變化顯示：4 h 內(nèi)酪胺含量快速增長(zhǎng)，4～10 h 酪胺的含量增長(zhǎng)緩慢，10 h 后由于前期酪胺的積累，酪胺含量有降低趨勢(shì)。

圖1 24 h 內(nèi)糞腸球菌生長(zhǎng)、pH 和酪胺含量變化Fig.1 Changes of the growth,pH and tyramine content of Enterococcus faecalis within 24 hours

2.2 溫度對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)代謝的影響

由圖2 可知：在25 ℃以下，隨著溫度的升高，菌液的OD600nm值逐漸增加，當(dāng)溫度超過(guò)25 ℃以后，菌液的OD600nm值開始緩慢降低，說(shuō)明適合糞腸球菌生長(zhǎng)的最適溫度約為25 ℃，溫度過(guò)高或者過(guò)低均不利于糞腸球菌的生長(zhǎng)繁殖。在一定范圍內(nèi)，溫度與糞腸球菌發(fā)酵液的pH 值呈負(fù)相關(guān)，隨著溫度的升高，培養(yǎng)菌液的pH 值呈依次遞減，說(shuō)明糞腸球菌在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)代謝積累酸性物質(zhì)，使得菌液的pH 值降低，且溫度與糞腸球菌的產(chǎn)酸能力存在正相關(guān)的關(guān)系，溫度越高，產(chǎn)酸越多。溫度升高，菌液的酪胺含量曲線大致呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，溫度對(duì)糞腸球菌產(chǎn)酪胺能力的影響較明顯。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)：溫度對(duì)糞腸球菌產(chǎn)酪胺能力的影響主要表現(xiàn)為對(duì)糞腸球菌的代謝活性和對(duì)培養(yǎng)體系中氨基酸脫羧酶活性的影響，低溫條件會(huì)抑制菌株的代謝水平和氨基酸脫羧酶的活性，高溫則可以殺死培養(yǎng)液中的微生物個(gè)體并使酶失活。

圖2 溫度對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)、pH 和酪胺含量影響Fig.2 Effect of temperature on the growth,pH and tyramine content of E.faecalis

2.3 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)代謝的影響

由圖3 可知：糞腸球菌的生長(zhǎng)量與培養(yǎng)體系初始pH 呈正相關(guān)，培養(yǎng)液的初始pH 值越高，糞腸球菌培養(yǎng)液的OD600nm值也越高，說(shuō)明糞腸球菌在強(qiáng)酸性的環(huán)境條件下生長(zhǎng)受到抑制，提高培養(yǎng)環(huán)境的酸堿度可以促進(jìn)糞腸球菌的生長(zhǎng)和增殖。隨著初始pH的增高，培養(yǎng)液的pH 變化不大，基本維持在4.3 左右，說(shuō)明培養(yǎng)液的初始pH 對(duì)于糞腸球菌培養(yǎng)液的pH 值影響不明顯。糞腸球菌具有自我調(diào)節(jié)能力，能夠通過(guò)自身發(fā)酵產(chǎn)酸來(lái)調(diào)節(jié)外部環(huán)境以滿足自身生長(zhǎng)的需求。pH 值為5.0的糞腸球菌培養(yǎng)液中的酪胺含量最高。超過(guò)5.0 后，菌液中的酪胺產(chǎn)量急劇下降，說(shuō)明低酸環(huán)境有利于糞腸球菌發(fā)酵產(chǎn)酪胺，pH 是影響氨基酸脫羧酶的關(guān)鍵因素。

圖3 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)、pH 和酪胺含量的影響Fig.3 Effect of initial pH of medium on the growth,pH and tyramine content of E.faecalis

2.4 NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)代謝的影響

由圖4 可知：NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)與糞腸球菌的生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)性，隨著NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，糞腸球菌培養(yǎng)液的OD600nm值一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于5.0%時(shí)，菌液的OD600nm值下降平緩，說(shuō)明低鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，糞腸球菌的生長(zhǎng)雖然受到影響，但是作用不明顯；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于5.0%時(shí)，菌液的OD600nm值急劇下降，說(shuō)明糞腸球菌對(duì)NaCl的耐受度為5.0%左右，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于5.0%時(shí)，大部分菌株不能存活；當(dāng)NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于8.0%時(shí)，菌液的OD600nm值下降趨于平緩，且數(shù)值幾乎趨近于0，說(shuō)明在高鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，糞腸球菌難以存活。在0～3.0%的NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，部分糞腸球菌可以正常代謝產(chǎn)酸，使得菌液的pH 值略有下降，隨著NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，糞腸球菌的生長(zhǎng)受限甚至脫水死亡，不再有酸產(chǎn)生，同時(shí)由于中性鈉鹽的加入，培養(yǎng)液的pH 值逐漸上升，接近中性。在0～3.0%的NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，酪胺的產(chǎn)量有上升的趨勢(shì)，說(shuō)明在低鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，部分糞腸球菌可以正常代謝產(chǎn)生酪胺。隨著NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酪胺的產(chǎn)量逐漸下降，說(shuō)明體系中糞腸球菌的數(shù)量在減少，且鈉鹽的加入使得培養(yǎng)體系中的氨基酸脫羧酶失活，酪胺產(chǎn)量銳減。高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl 會(huì)在發(fā)酵體系中形成高滲透壓，抑制微生物的生長(zhǎng)和降低產(chǎn)生生物胺菌株的氨基酸脫羧酶的活性[11]。

圖4 NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)、pH 和酪胺含量影響Fig.4 Effect of NaCl mass fraction on the growth,pH and tyramine content of E.faecalis

2.5 氧含量對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)代謝的影響

由圖5 可知：在富氧條件下和厭氧條件下培養(yǎng)的糞腸球菌與正常條件下培養(yǎng)的糞腸球菌的菌液的OD600nm值差異對(duì)照明顯，糞腸球菌是一種兼性厭氧性乳酸菌，在富氧和厭氧條件下均可正常生長(zhǎng)。在厭氧條件下培養(yǎng)的糞腸球菌菌液的pH 值稍微低于富氧條件和正常對(duì)照條件下培養(yǎng)的。糞腸球菌在富氧和正常對(duì)照條件下，以分裂增殖為主，發(fā)酵產(chǎn)酸量少；在厭氧條件下，部分菌株發(fā)酵產(chǎn)酸，所以pH 值偏低。在正常和封閉厭氧條件下，培養(yǎng)液中酪胺的產(chǎn)量較高，幾乎是富氧條件下的1 倍，說(shuō)明糞腸球菌在氧氣供應(yīng)充足的情況下酪胺的產(chǎn)量較低，增加氧氣和改善通氣狀況可以降低糞腸球菌發(fā)酵產(chǎn)酪胺能力。

圖5 氧含量對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)、pH 和酪胺含量的影響Fig.5 Effect of oxygen content on the growth,pH and tyramine content of E.faecalis

2.6 響應(yīng)曲面法優(yōu)化控制糞腸球菌產(chǎn)生物胺條件

2.6.1響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合實(shí)際發(fā)酵工藝條件，選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵液初始pH 和NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 個(gè)因素，以酪胺含量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 中心組進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方案，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表Tab.1 Variables and levels in response surface design

運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合得回歸模型方程為：

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

Y=2.99+0.02A+0.16B-0.15C-0.22AB+0.01AC+0.05BC+0.60A2+0.33B2+0.32C2。

2.6.2響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果分析

由表3 可知：該模型的P值=0.002 0＜0.01，表明該模型極顯著，而失擬項(xiàng)P值=0.535 6＞0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該二次回歸模型具有較好的擬合度，可以用來(lái)預(yù)測(cè)分析。對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：初始pH 和NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響顯著，溫度影響不顯著，平方項(xiàng)均極顯著，因此各因素對(duì)糞腸球菌酪胺的產(chǎn)生影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。根據(jù)F值可知在所取因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)糞腸球菌產(chǎn)酪胺能力影響的順序?yàn)槌跏紁H＞NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞溫度。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of response surface regression model

2.6.3各因素間的交互作用影響分析

由圖6 可知：交互項(xiàng)AB顯著(P＜0.05)，AC和BC不顯著(P＞0.05)。AB之間交互作用的變化曲面較陡峭，說(shuō)明它們之間交互作用對(duì)酪胺含量影響均較大，與方差分析結(jié)果相符。各因素間交互作用對(duì)糞腸球菌產(chǎn)酪胺影響大小為AB＞BC＞AC。

圖6 兩因素交互作用對(duì)酪胺含量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot showing the effects of two factors interaction to the tyramine content

2.6.4最佳發(fā)酵條件組合的確定

通過(guò)Design-Expert V8.0.6.1 軟件分析可以得出最優(yōu)的發(fā)酵條件為：溫度29.68 ℃，發(fā)酵液初始pH 5.22，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.49%。在這一條件下酪胺的理論產(chǎn)量為2.941 mg/mL。

以確定的最優(yōu)組合條件，同時(shí)考慮實(shí)際情況，選擇發(fā)酵溫度30 ℃，初始pH 5.5，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%的條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，做3 組平行，所得生物胺含量為(3.030±0.079) mg/mL，與預(yù)測(cè)值接近。說(shuō)明該模型與實(shí)際情況符合較好，表明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)可靠，能夠通過(guò)優(yōu)化糞腸球菌發(fā)酵工藝條件來(lái)控制培養(yǎng)體系中酪胺的產(chǎn)量。

3 討論

糞腸球菌(E.faecalis)為革蘭氏陽(yáng)性菌，是一種兼性厭氧型乳酸菌，也是人和動(dòng)物消化道黏膜的主要菌群之一，具有維持消化道微生態(tài)平衡和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的作用，可產(chǎn)生天然抗生素，作為一種益生菌被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥學(xué)、農(nóng)業(yè)畜牧飼料和食品領(lǐng)域[12]，同時(shí)也是發(fā)酵香腸、火腿和臘肉等發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢(shì)菌[13]。鑒于生物胺對(duì)人體的危害和可能引起的食品安全問(wèn)題，迫切需要尋找去除或控制發(fā)酵食品中生物胺的方法。溫度主要對(duì)細(xì)菌內(nèi)的脫羧酶活性有影響，溫度過(guò)高或過(guò)低對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖及代謝作用都將產(chǎn)生不利影響[14]。溫度不僅能影響菌體密度、蛋白水解性和酶活性；還能抑制微生物的產(chǎn)胺量。乳酸菌在發(fā)酵溫度較高環(huán)境中，能促使產(chǎn)生物胺菌快速生長(zhǎng)繁殖從而增加生物胺的產(chǎn)生[15]。pH 值是影響生物胺含量的關(guān)鍵因素。細(xì)菌的脫羧酶在酸性環(huán)境中具有較高的活性，因此，較低pH 值能夠提高細(xì)菌產(chǎn)生物胺的能力，但是，生物胺的積累更取決于具有脫羧酶活性的細(xì)菌的生長(zhǎng)，迅速降低pH 值可以抑制氨基酸脫羧酶細(xì)菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而有效抑制發(fā)酵肉中生物胺的積累[16]。MARCOBAL 等[17]將糞腸球菌編碼酪氨酸脫羧酶的基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，得到的酶不僅可以作用于酪氨酸生成酪胺，還可以催化苯丙氨酸脫羧生成苯乙胺，這與本試驗(yàn)的檢測(cè)有差別，在本試驗(yàn)中僅檢測(cè)到糞腸球菌產(chǎn)酪胺。徐維艷[18]研究了鹽水鴨貯藏期間的1 株糞腸球菌在不同貯藏條件下的生長(zhǎng)特性及產(chǎn)胺情況，其結(jié)果表明糞腸球菌可以產(chǎn)生酪氨酸脫羧酶，并且確定了氨基酸脫羧酶與特定生物胺積累之間的關(guān)系；徐文娟[19]對(duì)屎腸球菌和糞腸球菌酪氨酸脫羧酶基因以及酶活性的影響因素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：底物為酪氨酸時(shí)，最適溫度為25 ℃，最適pH 為6.0，NaCl濃度對(duì)酶催化酪氨酸的活性影響不大；GARDINI等[20]研究了意大利發(fā)酵香腸中糞腸球菌菌株的氨基酸脫羧酶活性，探討了溫度、氯化鈉濃度和糖的添加量對(duì)糞腸球菌的生長(zhǎng)以及對(duì)酪胺和苯乙胺積累量的影響關(guān)系，結(jié)果表明：當(dāng)氯化鈉濃度增加和發(fā)酵溫度降低時(shí)，酪氨酸脫羧酶基因表達(dá)降低，產(chǎn)生酪胺含量下降，這與本試驗(yàn)結(jié)果相同；ALIAKBARLU 等[21]通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了降低伊朗白色鹵水奶酪中生物胺含量的工藝。

4 結(jié)論

低溫可以有效抑制糞腸球菌的生長(zhǎng)代謝和降低糞腸球菌產(chǎn)酪胺能力；降低環(huán)境體系的pH 可以抑制糞腸球菌的生長(zhǎng)，較高的pH 環(huán)境可以降低糞腸球菌酪胺的產(chǎn)量；適當(dāng)?shù)柠}質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以有效抑制糞腸球菌的生長(zhǎng)繁殖和體系中酪胺的產(chǎn)生；改善培養(yǎng)體系的通氣狀況可以降低酪胺的生成量。確定的控制糞腸球菌產(chǎn)酪胺量最低的發(fā)酵條件為：溫度30 ℃，發(fā)酵液初始pH 為5.5，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%，在該條件下酪胺產(chǎn)量為(3.030±0.079) mg/mL。