宋占騰，肖志明，樊霞，李陽，索德成

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline，SQX）是具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類廣譜型抗菌藥物，該藥物性質(zhì)穩(wěn)定、促進生長、抗菌活性顯著，同時在飼料中添加作為促生長劑使用，被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域[1-3]。二甲氧芐啶俗稱敵菌凈（Diaveridine，DVD），為動物專用抗菌增效劑，是含有5-取代芐基-2,4-二氨基嘧啶的化合物，能夠作為二氫葉酸還原酶可逆性抑制劑，阻礙二氫葉酸還原為四氫葉酸，影響輔酶的形成，從而影響微生物DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成，抑制了其生長繁殖。與磺胺喹噁啉聯(lián)用時，可產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，使細菌體內(nèi)葉酸代謝受到雙重阻斷，抗菌作用增強數(shù)倍至數(shù)十倍[4]。隨著家禽養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)代化、規(guī)?；⒓s化的發(fā)展，磺胺與磺胺增效劑聯(lián)合被大量應(yīng)用于家禽養(yǎng)殖過程。然而，磺胺與磺胺增效劑在體內(nèi)的代謝緩慢[5,6]，存在于機體時間較長、大多不能被完全吸收，并通過食物鏈最終對人體健康產(chǎn)生危害[7-9]。過量的SQX添加后容易在雞蛋中殘留，循環(huán)至人體蓄積后損傷肝臟、腎臟等，且具有潛在的致癌性[10-14]。各國均制定了休藥期來控制動物性食品中的磺胺藥物殘留。歐盟、加拿大、美國規(guī)定了動物組織中磺胺類藥物最大殘留量總量為100 μg/kg，日本為20 μg/kg，我國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定了組織中磺胺類藥物最大殘留量總量為100 μg/kg，農(nóng)業(yè)部163號公告規(guī)定蛋雞產(chǎn)蛋期均禁止使用磺胺類藥物[15,16]。

目前對于雞蛋中SQX與DVD的檢測方法主要有高效液相色譜法[17,18]、氣相色譜法[19]、液質(zhì)聯(lián)用[20,21]、免疫測定法[22]等，樣品提取凈化的方法主要有液液萃取法[23]、固相萃取法[24]和QuEChERS法[25]，本研究建立了一種多重機制雜質(zhì)吸附凈化，將提取液高速離心后轉(zhuǎn)移上清液，加入多重機制吸附凈化材料，同時使用高效液相色譜串聯(lián)四極桿/靜電場軌道離子阱高分辨率質(zhì)譜（Q Exactive HF，HRMS）檢測，以期為雞蛋產(chǎn)品的磺胺藥物及增效劑的殘留監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗儀器

Q Exactive HF，HRMS軌道離子阱高分辨質(zhì)譜儀[帶有熱電噴霧離子源（HESI源）]，美國Thermo Fisher公司；Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），美國Waters公司；Oasis HLB固相萃取小柱、OasisMAX固相萃取小柱（3 cc，60 mg），美國Waters公司；超聲波清洗器，F(xiàn)ungilab公司；高速臺式離心機，Sigma公司；QL-901Vortex自動渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）濾膜，購于上海安譜實驗科技股份有限公司；超純水器，美國MILLIPORE公司；L18-Y88勻漿機，濟南九陽股份有限公司。

1.1.2 實驗材料

前處理吸附材料Cleanert S C18：粒徑50 μm ；Cleanert S SLE（硅藻土）：粒徑150 μm；Cleanert S中性氧化鋁（Alumina-N）：粒徑150 μm；Cleanert S活性碳（Carb）：粒徑120～400 mesh；Cleanert S Nano Carb：粒徑10～20 nm，購置于Agela Technologies公司。吸附材料BONDESIL-SAX：粒徑40 μm；BONDESIL-SCX：粒徑40 μm；BONDESIL-PSA：粒徑40 μm；BONDESIL-FL：粒徑200 μm，購置于Agilent Technologies公司。羥基化多壁碳納米管（HMCN），購置于先豐納米材料科技有限公司。多重機制吸附填料：稱取6g BONDESIL-SAX、3g Cleanert S C18于50 mL三角瓶中，混合均勻，備用。

磺胺喹噁啉（SQX）和二甲氧芐啶（DVD）分別購置于Dr. Ehrenstorfer (Augsberg，Germany)，Aladdin（上海晶純生化科技股份有限公司）；甲酸（色譜純），Sigma公司；乙腈和甲醇（色譜純），F(xiàn)isher ChenAlert Guide公司；其他試劑均為分析純試劑，實驗用水為Mili-Q純化后的超純水（>18 MΩ）。

1.1.3 試驗樣品

雞蛋樣品來源：選取不同地規(guī)?；B(yǎng)殖場及商場與超市，隨機購買采集40份雞蛋樣品；陽性雞蛋樣品通過動物實驗獲得，依據(jù)飼料藥物添加劑使用規(guī)范[16]，常溫下混飼給予100 mg/kg的二甲氧芐啶和50 mg/kg的磺胺喹噁啉藥物，連續(xù)給藥5 d，分別于不同停藥期采集雞蛋樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的制備

取SQX與DVD對照品各適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成500 μg/mL的標準儲備液，于20 ℃冷藏保存，有效期6個月；精密量取SQX與DVD儲備液各適量，置于同一量瓶中，經(jīng)甲醇稀釋，制得磺胺類藥物500 ng/mL的混合標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 溶液配制

精密量取1 mL甲酸，用水稀釋至1000 mL，制得0.1%甲酸水溶液。精密量取100 mL乙腈，用0.1%甲酸水溶液定容至1000 mL，制得含0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液。精密量取1 mL甲酸，用乙腈稀釋至100 mL，制得1%甲酸乙腈溶液。

1.2.3 樣品前處理

取數(shù)枚新鮮雞蛋，清洗干凈去殼后，置于勻漿機充分攪拌均勻，稱取此雞蛋樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL 1%甲酸乙腈溶液，渦旋混合5 min，靜置30 min；置于搖床125 r/min，40 ℃恒溫下振搖1 h，超聲提取40 min，9000 r/min離心5 min；移取上清液5 mL于干凈的10 mL離心管，加入50 mg多重機制吸附填料，渦旋混合后超聲15 min，9000 r/min離心5 min，移取全部上清液40 ℃下氮氣吹干，加入0.5 mL 0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液，渦旋振蕩30 s，經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）濾膜過濾后，用Q Exactive HF，HRMS測定。若樣品中含量超出線性范圍，用樣品稀釋液稀釋至線性范圍內(nèi)上樣。

1.2.4 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；流動相：A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸甲醇。流量、流動相和梯度洗脫見表1。

質(zhì)譜采用熱電噴霧離子源（HESI），正離子模式（positive），平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）；鞘氣流速：40；輔助氣流速10；噴霧電壓3.0 kV；毛細管溫度：320 ℃；S-lens電壓：55；輔助氣加熱溫度：300 ℃；AGC target（Orbitrap容納的離子數(shù)量）：2e4；分辨率（Resolution）：120000；隔離窗口（Isolation window）：2.0 u；歸一化碰撞能（NCE/steppednce）：20、40、60。脫溶劑氣和錐孔氣均為氮氣；使用前調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求。質(zhì)譜掃描參數(shù)及各藥物質(zhì)譜條件見表2。

表2 SQX和DVD的質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectroscopic conditions of SQX and DVD

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

將系列標準溶液、樣品溶液按上述儀器方法上機進行測定，采用MassLynx軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

文獻報道中選用了多種流動相來達到各類化合物較好的分離效果，本文選擇甲醇為流動相的有機相是因為為甲醇與乙腈相比極性較強，當(dāng)流動相梯度條件相同時，反相色譜中洗脫能力較乙腈弱，分析物保留時間更長。甲醇可使DVD的保留時間相對推后，同時甲醇會提高離子化程度，峰面積比以乙腈為流動相時大。磺胺類藥物在酸性溶液中能以分子狀態(tài)存在，很好地與固定相作用而被保留和分離，且電離時能較好地生成[M+H]+而被檢測。在水相和有機相中同時加入0.1%甲酸，能夠促進電離，有效提高了靈敏度。通過流動相梯度洗脫，能在10 min內(nèi)有效的分離兩種化合物，縮短了保留時間，且所有同分異構(gòu)體均能分離完全，并能夠獲得較好的峰形，滿足確證與準確定量的要求。同時在很大程度上節(jié)省了溶劑消耗，降低了分析成本和廢液產(chǎn)生。兩種化合物離子流色譜圖見圖1。

圖1 Q Exactive HF，HRMS掃描TIC圖Fig.1 Q Exactive HF, HRMS scanning TIC diagram

Q Exactive HF，HRMS軌道離子阱高分辨質(zhì)譜儀平行反應(yīng)監(jiān)測（Parallel Reaction Monitoring，PRM）是一種基于高分辨、高精度質(zhì)譜的離子監(jiān)視技術(shù)，能對目標分析物進行選擇性檢測，從而實現(xiàn)對目標物進行絕對定量。利用四級桿質(zhì)量分析器的選擇能力，用Q1選擇目標物的母離子；最后利用精度分析器在二級質(zhì)譜中檢測所選的母離子窗口內(nèi)的所有碎片的信息。相比于傳統(tǒng)SRM/MRM只檢測目標離子對的模式，平行反應(yīng)監(jiān)測PRM相對定量技術(shù)不僅具有SRM/MRM的靶向定量分析能力，還同時具備了定性能力。

將2種待測目標化合物標準溶液以5 μL/min注入電噴霧離子源，各物質(zhì)在正離子模式下可得到準分子離子峰[M+H]+。將其作為前體離子，再進行子離子掃描二級質(zhì)譜分析，選擇豐度較大的兩個碎片離子，其中豐度較高的一個碎片離子作為定量離子，其余碎片離子作為輔助定性離子，分別對噴霧電壓、毛細管溫度、鞘氣流速等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化。2種磺胺類化合物的增強子離子掃描質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 增強子離子掃描質(zhì)譜圖Fig.2 Scanning mass spectrum of enhancer ion

通過精確的質(zhì)量分析，多級質(zhì)譜碎片離子信息，相對豐度及相關(guān)文獻報道，對比發(fā)現(xiàn)SQX在一定碰撞能量下，得到m/z為（156.0762±0.0001）的碎片離子，以及m/z為（108.0442±0.0001）的碎片離子，初步推測與磺胺類化合物結(jié)構(gòu)中的苯磺酰胺（C6H7NO2S）結(jié)構(gòu)相符。DVD有特征為（123.0662±0.0001）的碎片離子，初步推斷分子式與6-甲基-2,4-嘧啶二胺（C5H8N4）結(jié)構(gòu)相符。

2.2 提取條件選擇

磺胺與增效劑在結(jié)構(gòu)與性質(zhì)上較為接近，本實驗在參考大量文獻的基礎(chǔ)上[26-29]，考察了乙腈、乙酸乙酯、水/乙腈（20:80，V/V）對各類磺胺藥物及增效劑的提取效率，結(jié)果表明，乙酸乙酯提取后基質(zhì)影響較大，乙腈類溶液提取效率要好于乙酸乙酯，這是由于磺胺及增效劑結(jié)構(gòu)中含有多個氨基，呈強極性，難溶于非極性溶劑，易溶于極性有機溶劑，同時充分利用了乙腈能使蛋白質(zhì)變性沉淀的作用，使得分析目標物能夠較好的溶解。此外，由于磺胺類藥物具有弱堿性，易溶于酸性溶液，采用甲酸－乙腈混合溶劑的提取效率要高于乙腈。同時實驗對甲酸的用量進行優(yōu)化，隨著甲酸濃度增加，大部分磺胺的回收率下降，因此采用甲酸－乙腈（1:99，V/V）混合溶液作為提取溶劑。

2.3 凈化方式選擇

雞蛋中富含脂肪、蛋白質(zhì)、磷脂等基質(zhì)，存在雜質(zhì)多、基質(zhì)干擾嚴重、回收率偏低等問題，有效去除干擾因素是獸藥殘留檢測的重要節(jié)點，混合模式吸附劑凈化是一種基于介質(zhì)分散固相萃取的方法，此方法主要通過多種不同粒徑功能化吸附材料，將樣品中的主要干擾雜質(zhì)吸附，有效地去除基體中可能存在的磷脂、脂肪和部分蛋白質(zhì)等，同時將被測物質(zhì)留在樣品溶液中，而達到凈化和富集的目的。該方法快速、簡單，可大大節(jié)省樣品前處理的時間。樣品提取液經(jīng)過離心后移取上清液5 mL，通過加入不同種吸附材料凈化，其10種吸附材料名稱類型見表3，對SQX和DVD的回收率見圖3。

表3 吸附材料名稱與類型Table 3 Names and types of adsorbent materials

圖3 不同吸附材料對SQX和DVD回收Fig.3 Recovery efficiency of SQX and DVD with different adsorbent materials

由圖3得知，提取液經(jīng)FL、ALMN、SLE、NONO凈化吸附時，SQX和DVD基質(zhì)干擾明顯，回收率偏低；SCX和PSA對兩種化合物有一定回收效果，但同批次內(nèi)偏差較大。兩種化合物經(jīng)過SAX和C18分別吸附凈化時，樣品溶液顏色有較明顯的吸附凈化效果，C18固體吸附劑有效防止了非極性化合物進入色譜柱，對五種原藥回收率達到較好的效果。因此將SAX和C18通過不同配比混合來進行吸附凈化，進一步提高回收效率。經(jīng)過不同比例以及不同添加量對樣品吸附效率的考察，最終確定SAX與C18比例為2:1，添加量達到50 mg時，吸附效率達到最優(yōu)。SAX和C18對提取液吸附凈化效果如圖4所示。不同比例添加下對各化合物回收效率見圖5。同時考察了吸附材料的使用量，比較了5、10、20、50、80、100 mg不同固體吸附劑加入量對5 mL樣品提取液中雜質(zhì)凈化效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)固體吸附材料加入量達50 mg時，繼續(xù)加大吸附劑的用量對樣品雜質(zhì)的凈化效果和回收率無明顯改善。因此將吸附材料加入量設(shè)定為50 mg。當(dāng)加入吸附劑吸附凈化后，可以有效地除去基質(zhì)中的干擾物對待測物色譜峰的影響，同時減少雜質(zhì)對儀器和色譜柱的損害。

圖4 SAX和C18吸附凈化效果比較Fig.4 Comparison of SAX and C18 adsorption purification effects

圖5 不同比例吸附材料對各化合物的回收率Fig.5 Recovery of each compound by different ratios of adsorbent materials

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

SQX和DVD以基質(zhì)匹配外標法定量，以自身峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。結(jié)果顯示，在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，2種化合物均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。在空白樣品中添加不同濃度的待測組分，前處理后按濃度由高至低檢測，以信噪比≥3，確定方法的檢出限為0.1～0.2 μg/kg；以信噪比≥10確定方法的定量限為0.3～0.6 μg/kg；2種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限如表4所示。

表4 2種化合物的線性范圍、線性方程、檢出限及定量限Table 4 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients, limits of detection (lods) and limits of quantitation (loqs) of 2 kinds of compounds

2.5 回收率和精密度

精確稱取空白雞蛋樣品2 g，加入10、50、200 μg/g的混合標準溶液，將樣品在避光條件下靜止2 h，使其標準溶液被樣品充分吸收，每個添加濃度平行測定6次，按上述優(yōu)化后的提取方法和儀器條件處理測定。計算SQX和DVD的添加回收率和相對標準偏差。結(jié)果表明，該方法在低、中、高3個添加水平下的回收率達到96.4%～106.8%之間（見表5），相對標準偏差為0.5%～7.1%。

表5 雞蛋樣品中SQX與DVD添加回收率及相對標準偏差Table 5 The recovery rate and relative standard deviation of SQX and DVD in egg samples

2.6 樣品測定

采用本研究方法分析了不同地規(guī)?；B(yǎng)殖場、商場及超市，隨機購買采集40份雞蛋樣品；和通過動物實驗獲得的20份雞蛋樣品，結(jié)果表明，隨機采集的樣品中均未檢出SQX與DVD殘留，動物實驗樣品中，8份雞蛋樣品檢出SQX為0.7～15.42 mg/kg，DVD為0.23～8.87 mg/kg。函待進一步探究SQX與DVD在雞蛋中的殘留代謝規(guī)律。

3 結(jié)論

本方法采用酸化乙腈提取后，混合模式吸附劑凈化，建立了雞蛋產(chǎn)品中SQX和DVD的高效液相色譜串聯(lián)四極桿/靜電場軌道離子阱高分辨率質(zhì)譜（Q Exactive HF，HRMS）方法，結(jié)果表明方法具有較高的靈敏度，檢出限定量限穩(wěn)定，并有良好的回收效率，分析方法操作簡便、高效、經(jīng)濟、靈敏度和準確度高，并易于普及。