趙昕琪，張妍，王天琪，王成，張莉力，許云賀

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121000）

隨著消費(fèi)者健康意識(shí)的不斷提高，發(fā)酵產(chǎn)品和谷類食品消費(fèi)量漸增。作為植物基質(zhì)，谷類產(chǎn)品適合乳糖不耐癥、牛奶過敏和遵循低脂肪或素食飲食模式的人群。谷類也被認(rèn)為是新型益生菌載體和潛在的功能性食品[1]?！肮任镱愶嬃稀笔且怨任餅橹饕希?jīng)加工調(diào)配制成的飲料，可添加果蔬汁、植物提取物等食品輔料[2]。歸屬于植物類飲料。谷物飲料又根據(jù)生產(chǎn)工藝中是否有發(fā)酵過程，分為谷物發(fā)酵型飲料和谷物非發(fā)酵型飲料兩類[3]。

代謝組學(xué)（Metabonomics/Metabolomics）是一門對(duì)某一生物或生物系統(tǒng)內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定性和定量分析的科學(xué)[4]。其中非靶向代謝組學(xué)是無針對(duì)性的盡可能多的分析樣品中的代謝產(chǎn)物。大多數(shù)研究對(duì)象是相對(duì)分子量小于1000的微小代謝分子[5]。近年來，代謝組學(xué)在微生物學(xué)[6]、食品[7]等方面廣泛應(yīng)用。其中色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）以高特異性和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[8]，廣泛應(yīng)用于微生物代謝組學(xué)分析中。

市面益生菌飲料種類較多，但可直接利用生淀粉的益生菌尚未被開發(fā)。L. paracaseiL1和L. caseiYQ336是分別從自然發(fā)酵的甘薯酸漿和豆腐酸漿中篩選得到的兩株益生菌[9,10]，不但可以改善腸道菌群，而且可以直接利用生淀粉進(jìn)行代謝。同時(shí)以L1和YQ336為發(fā)酵菌種的谷物飲料，發(fā)酵后有機(jī)酸，黃酮等活性物質(zhì)顯著提高。無論是從兩株益生菌還是二者產(chǎn)生的次級(jí)代謝物都可以起到有利于身體健康的作用。因此本研究選用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的非靶向代謝組學(xué)，結(jié)合主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別（Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLS-DA）等方法，檢測了以L1和YQ336為發(fā)酵菌種的小米谷物飲料中小分子物質(zhì)含量的變化。為利用乳酸菌發(fā)酵植物基質(zhì)食品及其對(duì)植物基質(zhì)的代謝機(jī)理研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

以小米、糯米、大棗、枸杞、山藥、梔子和桂花為原料。以L. paracaseiL1和L. caseiYQ336為發(fā)酵劑，錦州醫(yī)科大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

加工工藝：

浸泡24 h→煮制1 h→打漿（中檔30 s）→過濾（八層紗布）→殺菌（95 ℃，15 min）→接菌（L. paracaseiL1和L. caseiYQ336）→發(fā)酵（35 ℃，24 h）

試劑：乙腈、乙酸銨、甲醇、氨水，均為色譜純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀，AB SCIEX；安捷倫1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀。

色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

本研究使用的樣本為發(fā)酵24 h后的谷物飲料A組和殺菌處理后的谷物飲料B組。每組6個(gè)生物學(xué)重復(fù)組。將樣品儲(chǔ)存在-80 ℃的冰箱中，直至提取代謝物。

1.2.2 樣本的代謝物提取

代謝物的提取按照楊秀娟的方法[11]進(jìn)行了一些修改。將樣品冷卻干燥后加入甲醇與乙腈1:1混合的溶液，混合均勻，-20 ℃下沉降蛋白。16000 g 4 ℃離心20 min后在高速真空濃縮離心機(jī)揮干。在4 ℃下將樣品用1:1的乙腈-水溶液復(fù)溶，離心后取上清進(jìn)行分析。

1.2.3 代謝組學(xué)分析

采用超高壓液相色譜法（UHPLC）進(jìn)行色譜評(píng)價(jià)，樣品在Waters公司的ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱上進(jìn)行色譜分離，使用二元流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，其中流動(dòng)相A為水+25 mmol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水，B為乙腈。柱溫：25 ℃。洗脫程序：0～0.5 min，5% A；0.5～7 min，A從5%線性變化至35%；7～9 min，A從35%線性變化至60%；9～10 min，A維持在60%；10～11.1 min，A從60%線性變化至5%；11.1～16 min，A維持在5%。流速：0.3 mL/min。為平衡色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)及儀器穩(wěn)定性的測試，本實(shí)驗(yàn)將質(zhì)量控制（Quality control，QC）樣本插入樣品隊(duì)列，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。質(zhì)譜（MS）是使用Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀（AB SCIEX）進(jìn)行的，該系統(tǒng)配備有電噴霧電離（Electrospray Ionization，ESI）源，在正離子（ESI+）和負(fù)離子（ESI-）模式下工作。ESI源條件如下：離子源氣體1，60 psi；離子源氣體2，60 psi；Curtain gas（CUR），30 psi；源溫度600 ℃；TOF MS掃描m/z范圍：60～1200 u；產(chǎn)物離子掃描m/z范圍：25～1000 u；TOF MS掃描累積時(shí)間0.15 s/光譜；產(chǎn)物離子掃描累積時(shí)間0.03 s/光譜。二級(jí)質(zhì)譜采用 information dependent acquisition（IDA）獲得，并且采用high sensitivity模式，Declustering potential（DP）：±60 V（正負(fù)兩種模式），Collision Energy：30 eV，IDA設(shè)置如下Exclude isotopes within 4 u，Candidate ions to monitor per cycle:6[12]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

將通過色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析得到的原始數(shù)據(jù)采用MSDIAL軟件進(jìn)行處理。檢索HMDB、MassBank等公共數(shù)據(jù)庫。對(duì)提取得到的數(shù)據(jù)，刪除組內(nèi)缺失值>50%的離子峰[13]，整合正負(fù)離子峰并應(yīng)用軟件SIMCA-P 14.1（Umetrics，Umea，Sweden）進(jìn)行模式識(shí)別。數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto scaling預(yù)處理后，進(jìn)行多變量數(shù)據(jù)分析[14]，包括主成成分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。使用變量權(quán)重值（Variable Importance for the Projection，VIP）[15]和p值來篩選發(fā)酵前后飲料之間存在的顯著差異的代謝物。對(duì)顯著差異代謝物進(jìn)行KEGG ID Mapping，并提交至KEGG網(wǎng)站進(jìn)行相關(guān)途徑分析[16]。將比較組得到的顯著性差異代謝物進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)由上海拜譜公司進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本分析

采用QC樣本的質(zhì)譜TIC圖比較和總樣本的PCA統(tǒng)計(jì)分析兩種策略，對(duì)本項(xiàng)目的系統(tǒng)穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)和分析。圖1結(jié)果表明各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊。同時(shí)圖2的研究結(jié)果顯示QC樣本相對(duì)于實(shí)驗(yàn)樣本聚集，且QC誤差小于2倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差以內(nèi)，說明本實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差在可控范圍內(nèi)。

圖1 QC樣品總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of QC sample

圖2 樣本的PCA得分圖Fig.2 PCA score chart of samples

2.2 飲料發(fā)酵前后代謝物主成分分析

采用PCA的方法，觀察所有樣本之間的總體分布趨勢。兩組飲料分別在t[1]、t[2]表現(xiàn)出組內(nèi)聚集趨勢，整體上表明這兩種飲料的代謝物間有顯著差異。

圖3 A vs B的PCA得分圖Fig.3 PCA score of A vs B

2.3 飲料發(fā)酵前后代謝物的OPLS-DA分析

為了篩選出組間不同的代謝物，對(duì)A組和B組的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到OPLS-DA評(píng)分圖4。如圖所示，OPLS-DA模型能明顯區(qū)分兩組樣本，表明各個(gè)成員組之間存在顯著性差異，全部的樣品成員組都是位于置信時(shí)間內(nèi)，同時(shí)參數(shù)R2Y(cum)=1，Q2(cum)=0.958，R2Y和Q2均大于0.5并且接近于1，說明該模型的穩(wěn)定性比較好，且數(shù)據(jù)可靠。OPLS-DA模型可以明顯區(qū)分兩組樣本。驗(yàn)證了A組與B組之間的代謝物存在顯著差異。結(jié)果顯示，截距Q2=-0.237<0，表明OPLS-DA模型不存在過擬合。

圖4 A組和B組OPLS-DA模型得分圖（a）和A vs B的OPLS-DA置換檢驗(yàn)圖（b）Fig.4 Scores of OPLS-DA model in group A and group B (a) and OPLS-DA permutation test of A vs B (b)

2.4 飲料發(fā)酵前后的差異代謝物篩選及分析

本實(shí)驗(yàn)以VIP>1且p<0.05為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)發(fā)酵前后的飲料進(jìn)行比較，共檢測出顯著差異代謝物25類145種。主要包括有機(jī)酸及其衍生物、黃酮類化合物、糖類及其衍生物、生物堿、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍6個(gè)類別（見表1），占比分別為23.45%、14.48%、13.79%、11.03%、6.90%和6.90%。根據(jù)OPLS-DA分析，以FC>2或FC<0.5，p<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)發(fā)酵前后顯著差異代謝物進(jìn)行篩選。其中顯著上調(diào)的代謝物有63種，顯著下調(diào)的代謝物有36種。

表1 A、B組差異代謝物種類與變化情況Table 1 Types and changes of different metabolites in group A and B

2.5 主要差異代謝成分分析

以FC>100和FC<0.01為指標(biāo)，進(jìn)一步比較發(fā)酵飲料前后樣品中變化大的代謝成分，共篩選出變化顯著的代謝物14種。其中提高的代謝物有11種，主要包括有機(jī)酸4種、黃酮類化合物4種、生物堿1種、氨基酸1種及萘酚類1種。降低的有3種，主要包括氟磺酸1種、核苷酸1種和一種α氨基酸酯。如表2所示，增加的物質(zhì)主要包括：增加36668倍的1-羥基-2-萘甲酸、增加1000倍的二氫白藜蘆醇、增加800倍的2-羥基戊酸、增加517倍的大豆苷、增加488倍的牡荊素、增加238倍的芹菜素、增加148倍的異芥酸、增加130倍的染料木素。1-羥基-2-萘甲酸是萘酚類，根據(jù)張俊艷等[17]文獻(xiàn)可知萘酚類化合物主要有抗炎活性。根據(jù)Okada[18]的文獻(xiàn)可知口服DHNA（1,4-二羥基-萘甲酸）能改善葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。二氫白藜蘆醇是一種天然的非黃酮類多酚化合物，根據(jù)卞兆祥等人[19]的研究可知二氫白藜蘆醇可用于治療急性胰腺炎和相關(guān)肺損傷。大豆苷是一種大豆黃酮類有機(jī)化合物[20]，具有有效減少其對(duì)高血壓的不良影響，改善收縮人體的大腦血液循環(huán)，擴(kuò)張收縮人體心臟冠脈，改善人體心肌活性和消炎抗菌功能[21]。牡荊素是一種黃酮類化合物，具有抑制人體癌細(xì)胞的生長，保護(hù)心血管疾病肺損傷等功能[22,23]。芹菜素是一種黃酮類化合物，具有抗腫瘤，對(duì)糖尿病心肌病的保護(hù)作用[24]。染料木素具有抗氧化作用，抑制結(jié)腸癌的作用[25,26]。減少的物質(zhì)主要包括：減少135倍的甘氨酸甲酯，減少294倍的全氟戊烷磺胺，減少322倍的腺嘌呤。甘氨酸甲酯是甘氨酸與甲醇反應(yīng)生成的氨基酸酯類化合物。腺嘌呤是一個(gè)核堿基（嘌呤衍生物），一定濃度的腺嘌呤可以對(duì)腎功能造成損傷[27]。

表2 A、B組顯著差異代謝物Table 2 Differential metabolites of group A and B

2.6 代謝通路分析

圖6 為A、B兩組顯著差異代謝物KEGG富集圖。圖中每一個(gè)圖形都是一個(gè)KEGG路徑?？v坐標(biāo)表示路徑的名稱，橫坐標(biāo)表示為富集率。圖形的越小，表示富集到的物質(zhì)越少。通路富集分析可獲得52種差異代謝通路，其中19個(gè)通路存在顯著差異（p<0.05）。其中乙醛酸和二羧酸代謝、檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）等排在前10的代謝通路（見圖6）。雙組分體系[28]，是指存在于細(xì)菌內(nèi)的一種信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，細(xì)菌通過感受外界環(huán)境變化、調(diào)控生存、毒力因子表達(dá)來維持自身生存，是細(xì)菌適應(yīng)選擇壓力的一種機(jī)制。乙醛酸循環(huán)主要出現(xiàn)在植物和微生物，與脂肪轉(zhuǎn)化為糖密切相關(guān)的反應(yīng)過程。三羧酸循環(huán)是糖、脂和蛋白質(zhì)三大類物質(zhì)代謝與轉(zhuǎn)化的樞紐[29]。嘌呤代謝指核酸堿基腺嘌呤及鳥嘌呤等的嘌呤衍生物的合成及分解[30]。升高219.65倍的己二酸α氨基酯主要是由氨基酸代謝產(chǎn)生的。升高36668.85倍的1-羥基-2-萘甲酸主要是由微生物代謝及芳香化合物降解，通過1-羥基-2-萘甲醛與煙酰胺腺嘌呤雙核苷酸和水反應(yīng)生成的。減少322倍的腺嘌呤通過嘌呤代謝分解為次黃嘌呤。

圖6 顯著差異代謝物KEGG富集圖（Top10）Fig.6 Significant difference metabolite KEGG Enrichment map(Top 10)

微生物代謝通路主要包括：碳水化合物代謝、能量代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素的代謝、外源生物降解5種代謝。富集到的差異代謝物（見表3）共有16種，包括苯甲醇、1-羥基-2-萘甲酸、咖啡因、異檸檬酸、反式肉桂酸、芒柄花甙、L-谷氨酸、4-氨基苯酚、檸檬酸、1,3,7-三甲尿酸、順烏頭酸、2-氨基苯酚、丁二酸、乙醇酸、戊二酸和蘋果酸。

表3 微生物代謝通路富集到的差異代謝物Table 3 Differential metabolites enriched by microbial metabolic pathways

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用非靶向代謝組學(xué)方法對(duì)由L.paracaseiL1和L. caseiYQ336為發(fā)酵菌種的谷物飲料的小分子物質(zhì)進(jìn)行差異性分析。檢測出25類145種顯著性差異代謝產(chǎn)物，主要包括34種有機(jī)酸及其衍生物、21種黃酮類化合物、20種糖類及其衍生物等。以FC>100和FC<0.01為指標(biāo)，共篩選出變化顯著的代謝物14種。發(fā)酵后含量顯著提高的生物活性物質(zhì)包括：萘酸類物質(zhì)、黃酮類化合物和有機(jī)酸。經(jīng)過發(fā)酵，谷物飲料的感官和營養(yǎng)都有顯著提高。通過KEGG代謝通路分析表明，差異顯著的代謝通路有19條，推測谷物基質(zhì)可能對(duì)L. paracaseiL1和L. caseiYQ336次級(jí)代謝的合成和積累具有一定影響，本研究將為利用乳酸菌發(fā)酵植物基質(zhì)食品及其對(duì)植物基質(zhì)的代謝機(jī)理研究奠定理論基礎(chǔ)。