楊寧，盧勉飛，李艷嫦，蔡芷荷,3，吳清平，余錦鑾

（1.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣東廣州 510663）（2.廣東省微生物研究所，廣東廣州 510070）（3.廣東環(huán)凱生物科技有限公司，廣東肇慶 526238）

隨著無菌冷灌裝生產(chǎn)線逐漸成為中國飲料行業(yè)的主流生產(chǎn)工藝[1-9]，如何確保冷灌裝生產(chǎn)線無菌，對于飲料生產(chǎn)是一個非常重要的環(huán)節(jié)。不單是飲料還有藥品，為確保無菌生產(chǎn)工藝系統(tǒng)中無菌的可靠性和適應(yīng)性，國內(nèi)法規(guī)及指導(dǎo)文件均要求通過一定的驗證方法對其進行驗證[10-12]。多數(shù)企業(yè)采用培養(yǎng)基灌裝試驗來證明其無菌工藝的可靠性[13-16]。培養(yǎng)基灌裝又稱無菌培養(yǎng)基模擬灌裝試驗，是采用微生物培養(yǎng)基替代產(chǎn)品對無菌工藝進行評估的驗證[15,16]。GB/T 24571-2009規(guī)定了PET瓶無菌冷灌裝生產(chǎn)線驗證的培養(yǎng)基為LG培養(yǎng)基[11,16-19]。

目前，飲料企業(yè)大多數(shù)是自行購買LG培養(yǎng)基配方中的各個原材料配制LG培養(yǎng)基，用于冷灌裝生產(chǎn)線的無菌驗證。由于培養(yǎng)基原材料一般是化學(xué)和生物試劑，不同廠家的試劑質(zhì)量優(yōu)劣不齊，飲料企業(yè)對培養(yǎng)基所用的原料控制比較粗放，導(dǎo)致飲料企業(yè)采用自行配制的LG培養(yǎng)基驗證時，經(jīng)常會出現(xiàn)培養(yǎng)基混濁，顏色不一的現(xiàn)象，以致不能使用；或者出現(xiàn)LG培養(yǎng)基檢測微生物的靈敏度低，不能如實地反映生產(chǎn)線的微生物污染情況，導(dǎo)致造成很大的生產(chǎn)風(fēng)險以及由于微生物污染造成的損失。

針對這一行業(yè)共性問題，我們通過優(yōu)選LG培養(yǎng)基配方所用的原料，以及研究及優(yōu)選出合適的生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)出商品化復(fù)合型LG干粉培養(yǎng)基，解決飲料企業(yè)自行配制培養(yǎng)基存在批間差的問題。相關(guān)文獻也表明，復(fù)合型的LG培養(yǎng)基無論對細菌還是真菌，均具有較高的檢測靈敏度及較優(yōu)的促生長能力[20]。

本研究采用中國飲料罐裝生產(chǎn)線上常見的污染菌株作為試驗菌株[20,21]，以半定量的方法，以符合標準的工廠化生產(chǎn)的3批復(fù)合型LG培養(yǎng)基作為參照，比較由同一集團3個飲料分廠分別提供的各個原料在本實驗室配制的LG培養(yǎng)基，對比其在外觀、理化指標及微生物指標（靈敏度）方面的差異，得出一定的研究結(jié)論，旨在為PET瓶飲料無菌灌裝生產(chǎn)線的無菌驗證進行培養(yǎng)基選擇時提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

3批商品化復(fù)合型LG培養(yǎng)基（復(fù)合型LG：1069401、1069361、1069421）、血平板和改良馬丁瓊脂均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；3批自配LG培養(yǎng)基分別由國內(nèi)某食品集團公司的3個分廠提供，分別命名為自配G、自配T和自配H。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1360-LⅡB2生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器；PB-10 pH計，賽多利斯；HVE50滅菌鍋，日本HIRAYAMA；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的制備

取復(fù)合型LG培養(yǎng)基3批（批號：1069401，1069361，1069421）與3個自行配制的LG培養(yǎng)基分別按LG培養(yǎng)基配方配制量稱取于不同的2 L三角瓶中，各加1000 mL的純化水，充分溶解后，煮沸，冷卻至45 ℃，測定各瓶培養(yǎng)基的初始pH值，然后用堿調(diào)節(jié)至相同的pH，分裝試管，每管10 mL。上述培養(yǎng)基121 ℃高壓滅菌15 min后備用。

LG配方[17]：葡萄糖20 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母提取物3.5 g/L，硫酸銨2 g/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，pH值6.5±0.2。

1.4 試驗菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella. peneumoniae）CMCC(B) 46117、枯草芽孢桿菌黑色變種（Bacillus subtilis var. niger）ATCC 9372、銅綠假單胞菌（Pseudomonas. aeruginosa）ATCC 27853、洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）ATCC 25416、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）CMCC(B)63303、黑 曲 霉（Aspergillus niger）ATCC 16404、白色念珠菌（canidia albicans）ATCC 10231，由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.5 試驗用菌懸液的制備

1.5.1 細菌試驗用菌懸液的制備

將試驗菌株接種于血平板上，置36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，以無菌生理鹽水懸浮培養(yǎng)物，制備成約含活菌數(shù)100～1000 CFU/mL的菌懸液，再以無菌生理鹽水10倍稀釋成分別制成約含活菌數(shù)10～100 CFU/mL和1～10 CFU/mL的菌懸液，備用。

1.5.2 霉菌試驗用菌懸液的制備

將試驗菌株接種于改良馬丁瓊脂斜面上，置25 ℃±1 ℃培養(yǎng)7 d，加入3～5 mL含0.05%（V/V）聚山梨酯80的無菌生理鹽水，輕輕洗脫孢子。并以無菌生理鹽水稀釋制備成約含活菌數(shù)100～1000 CFU/mL、10～100 CFU/mL和1～10 CFU/mL的菌懸液，備用。

上述試驗菌株的培養(yǎng)物均使用新鮮培養(yǎng)物，傳代次數(shù)不超過5代。

1.6 試驗方法

分別取上述2個不同劑量（10～100 CFU/mL、1～10 CFU/mL）的試驗菌株的菌懸液1 mL種接于LG 6個檢樣的培養(yǎng)基管中。于30 ℃±1 ℃中培養(yǎng)18 h～24 h后，輕輕振搖試管，同時與無生長管（陰性對照管）比較，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的混濁時計為生長管（陽性管）。逐日觀察結(jié)果，直到各個菌在各自配培養(yǎng)基上均出現(xiàn)相同的生長速度。分別記錄不同接種量的受試培養(yǎng)基的混濁程度。每種受試培養(yǎng)基每稀釋度分別接種3管培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與討論

2.1 感觀及理化試驗

不同LG培養(yǎng)基感觀及理化結(jié)果如表1所示。

表1 LG培養(yǎng)基3批及3個自配的感觀及理化結(jié)果Table 1 The results of sensory and physicochemical of LG media form four manufactor

在感觀方面，復(fù)合型LG 3批與自配G的相當(dāng)，均為澄清無沉淀，淺黃色，符合LG培養(yǎng)基的標準；優(yōu)于自配T和自配H，其培養(yǎng)基底部有黑色雜質(zhì)，其中自配T輕微混濁，有白色絮狀沉淀，且為黃色，色澤最深，這兩個自配LG培養(yǎng)基感官均不合格。由此可見，飲料企業(yè)自行采用不同原料配制的培養(yǎng)基其外觀存在較大差異，黑色雜質(zhì)、白色絮狀沉淀及色澤過深均會影響結(jié)果的觀察及判斷。而3批復(fù)合型LG培養(yǎng)基的感官一致，沒有批間差異。

在理化方面，自配G、自配T和自配H，初始pH值均較低，滅菌前需調(diào)節(jié)pH值到合適的范圍，滅菌后才能達到要求的pH值；而復(fù)合型LG滅菌前無需調(diào)整pH，滅菌后3批均在標準要求范圍（6.5±0.2）內(nèi)，可以直接使用。

復(fù)合型LG培養(yǎng)基的準確性和穩(wěn)定性均優(yōu)于其它三個自配的LG培養(yǎng)基。

2.2 金黃色葡萄球菌的生物學(xué)結(jié)果

生長速度結(jié)果如圖1所示。第1 d時，金黃色葡萄球菌在3批復(fù)合型LG上均生長有輕微混濁，而在自配G、自配H和自配T3個自配的培養(yǎng)基上均未見生長；第2 d時，金黃色葡萄球菌在復(fù)合型LG 3批和自配T上均達到生長良好的狀態(tài)，而在自配H上可見輕微混濁，自配G仍未見生長；第3 d時，金黃色葡萄球菌在復(fù)合型LG 3批、自配H和自配T上均達到生長極好的狀態(tài)，而在自配G上才可見輕微混濁。直到第5 d，自配G才達到生長極好的狀態(tài)。5 d后金黃色葡萄球菌在6個樣品上的生長無明顯差別。

圖1 金黃色葡萄球菌（6 CFU）在不同廠家LG培養(yǎng)基上的生長情況Fig.1 Growth of Staphylococcus aureus (6 CFU) on LG medium from different manufacturers

2.3 肺炎克雷伯氏菌的生物學(xué)結(jié)果

生長速度結(jié)果如圖2所示。第1 d時，肺炎克雷伯氏菌在復(fù)合型LG 3批上均生長有輕微混濁，而在自配G、自配H和自配T3個自配的培養(yǎng)基上均未見生長；第2 d時，肺炎克雷伯氏菌在復(fù)合型LG 3批上均達到生長良好的狀態(tài)，而在自配G、自配H和自配T上可見輕微混濁；第3 d時，肺炎克雷伯氏菌在復(fù)合型LG 3批及自配T上均達到生長極好的狀態(tài)，而在自配G和自配H上分別為生長良好和輕微混濁。直到第4 d，自配G和自配H才達到生長極好的狀態(tài)。4 d后肺炎克雷伯氏菌在6個樣品上的生長無明顯差別。

圖2 肺炎克雷伯氏菌（7 CFU）在不同廠家LG培養(yǎng)基上的生長情況Fig.2 Growth of Klebsiella pneumoniae (7 CFU) on LG medium from different manufacturers

2.4 枯草芽孢桿菌黑色變種的生物學(xué)結(jié)果

生長速度結(jié)果如圖3所示。第1 d時，枯草芽孢桿菌黑色變種在復(fù)合型LG 3批上均生長有輕微混濁，而在自配G、自配H和自配T3個自配的培養(yǎng)基上均未見生長；第2 d時，枯草芽孢桿菌黑色變種在復(fù)合型LG 3批上均達到生長極好的狀態(tài)，而在自配T上生長良好，在自配G和自配H可見輕微混濁；第3 d時，除在自配H上為生長良好外，枯草芽孢桿菌黑色變種在其余樣品上均達到生長極好的狀態(tài)；而在自配G和自配H上分別為生長良好和輕微混濁。直到第4 d，自配H才達到生長極好的狀態(tài)。4 d后枯草芽孢桿菌黑色變種在6個樣品上的生長無明顯差別。

圖3 枯草芽孢桿菌黑色變種（8 CFU）在不同廠家LG培養(yǎng)基上的生長情況Fig.3 Growth of Bacillus subtilis var. Niger (8 CFU) on LG medium from different manufacturer

2.5 銅綠假單胞菌的生物學(xué)結(jié)果

生長速度結(jié)果如圖4所示。第1 d時，銅綠假單胞菌在復(fù)合型LG 3批和自配G上均生長有輕微混濁，而在自配T和自配H2個自配的培養(yǎng)基上均未見生長；第2 d時，銅綠假單胞菌在復(fù)合型LG 3批上均達到生長良好的狀態(tài)，而在自配G、自配H和自配T上仍為可見輕微混濁；第3 d時，銅綠假單胞菌在復(fù)合型LG 3批上均達到生長極好的狀態(tài)，而在自配G、自配H和自配T上均為生長良好。直到第4 d，自配G、自配H和自配T才達到生長極好的狀態(tài)。4 d后銅綠假單胞菌在6個樣品上的生長無明顯差別。

圖4 銅綠假單胞菌（8 CFU）在不同廠家LG培養(yǎng)基上的生長情況Fig.4 Growth of Pseudomonas aeruginosa (8 CFU) on different LG media from different manufacturer

2.6 洋蔥假單胞菌的生物學(xué)結(jié)果

生長速度結(jié)果如圖5所示。第1 d時，洋蔥假單胞菌在6個樣品上均未見生長；第2 d時，洋蔥假單胞菌在復(fù)合型LG 3批和自配G上均有輕微混濁，而在自配H和自配T2個自配的培養(yǎng)基上均未見生長；第3 d時，洋蔥假單胞菌在復(fù)合型LG 3批上均達到生長極好的狀態(tài)，而在自配G和自配T上分別為生長良好和輕微混濁，在自配H上仍為未見生長。直到第4 d，自配G和自配T才達到生長極好的狀態(tài)，而自配H一直未見生長。4 d后，除自配H外，洋蔥假單胞菌在其余5個樣品上的生長無明顯差別，7 d內(nèi)均未觀察到自配H有生長。

圖5 洋蔥假單胞菌（8 CFU）在不同廠家LG培養(yǎng)基上的生長情況Fig.5 Growth of Pseudomonas cepacia (8 CFU) on LG medium from different manufacturers

2.7 蠟樣芽孢桿菌的生物學(xué)結(jié)果

生長速度結(jié)果如圖6所示。第1 d時，蠟樣芽孢桿菌在6個LG培養(yǎng)基樣品上均生長有輕微混濁；第2 d時，蠟樣芽孢桿菌在復(fù)合型LG 3批上均達到生長良好的狀態(tài)，而在自配G、自配H和自配T廠上仍為可見輕微混濁；第3 d時，蠟樣芽孢桿菌在復(fù)合型LG 3批和自配H廠上均達到生長極好的狀態(tài)，而在自配G和自配T上均為生長良好。直到第4 d，自配G和自配T才達到生長極好的狀態(tài)。4 d后蠟樣芽孢桿菌在6個樣品上的生長無明顯差別。

圖6 蠟樣芽孢桿菌（4 CFU）在不同廠家LG培養(yǎng)基上的生長情況Fig.6 Growth of Bacillus cereus (4 CFU) on LG medium from different manufacturers

2.8 黑曲霉的生物學(xué)結(jié)果

生長速度結(jié)果如圖7所示。第1、2 d時，黑曲霉在6個樣品上均未見生長；第3 d時，黑曲霉在復(fù)合型LG 3批上均有輕微混濁，而在自配G、自配H和自配T3個自配的培養(yǎng)基上均未見生長；第4 d時，黑曲霉在復(fù)合型LG 3批上均達到生長良好的狀態(tài)，而在自配H和自配T上均為輕微混濁，在自配G上仍為未見生長。第5 d時，黑曲霉在復(fù)合型LG 3批上均達到生長極好的狀態(tài)，自配H才達到生長良好的狀態(tài)，自配T未見有進一步的生長，自配G仍為未見生長；第6 d時，自配H也達到了生長極好的狀態(tài)，而自配T為生長良好，自配G仍為未見生長；第7 d時，除自配G仍為未見生長外，黑曲霉在其余5個樣品上的生長無明顯差別，均達到生長極好的狀態(tài)。

圖7 黑曲霉（8 CFU）在不同廠家LG培養(yǎng)基上的生長情況Fig.7 Growth of Aspergillus niger (8 CFU) on LG medium from different manufacturers

2.9 白色念珠菌的生物學(xué)結(jié)果

生長速度結(jié)果如圖8所示。第1 d時，白色念珠菌在6個樣品上均未見生長；第2 d時，白色念珠菌在復(fù)合型LG 3批上均有輕微混濁，而在自配G、自配H和自配T3個自配的培養(yǎng)基上均未見生長；第3 d時，白色念珠菌在復(fù)合型LG 3批上均達到生長良好的狀態(tài)，而在自配G和自配T上均為輕微混濁，在自配H上仍為未見生長。第4 d時，白色念珠菌在復(fù)合型LG 3批上均達到生長極好的狀態(tài)，自配G和自配T上均為生長良好的狀態(tài)，而自配H為輕微混濁；第5 d時，白色念珠菌在復(fù)合型LG 3批和自配G上均達到生長極好的狀態(tài)，自配H和自配T上均為生長良好；第6 d時，自配H和自配T才達到生長極好的狀態(tài)。6 d后白色念珠菌在6個樣品上的生長無明顯差別。

圖8 白色念珠菌（6 CFU）在不同廠家LG培養(yǎng)基上的生長情況Fig.8 Growth of Candida albicans (6 CFU) on LG medium from different manufacturers

3 討論

3.1 無菌培養(yǎng)基模擬灌裝試驗，無論采用TSB或LG培養(yǎng)基，在上線驗證前均需對培養(yǎng)基進行性能測試[10,12,17]，如果培養(yǎng)基靈敏度不夠，會導(dǎo)致試驗結(jié)果無法真實的反映灌裝工藝的無菌保證水平，所以在試驗前對培養(yǎng)基進行靈敏度試驗，確保培養(yǎng)基的靈敏度及促生長實驗符合要求[20,22]。

3.2 在本研究中，微生物促生長方面，3批次復(fù)合型LG效果相當(dāng)，微生物促生長效果均優(yōu)于3個自配LG，而且3個自行配制的LG培養(yǎng)基的促生長能力差異較大，穩(wěn)定性不好。第7 d時，8個測試菌在3批次復(fù)合型LG上生長均已達最大值，而自配G和自配H分別接種黑曲霉和洋蔥假單胞菌的3個平行管依然未見生長。可見，自配G和自配H LG培養(yǎng)基的促生長能力不穩(wěn)定，存在漏檢的風(fēng)險。促生長能力越強、越穩(wěn)定，微生物生長速度越快，越能準確、快速地發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)線的染菌情況，從而可以及早作出處理，避免了在時間上的浪費以及出現(xiàn)微生物漏檢的風(fēng)險。

3.3 出現(xiàn)上述差異的原因，主要是飲料企業(yè)自行配置的LG培養(yǎng)基，是自行購買培養(yǎng)基原材料配制的，由于培養(yǎng)基原材料中的酵母浸粉、蛋白胨是生物試劑，質(zhì)量批間差較大，受專業(yè)程度和保存菌株多樣性的限制，飲料企業(yè)很難對培養(yǎng)基原材料像專業(yè)培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家那樣進行全面的微生物生長指標測試，所以不同的企業(yè)配置出來的培養(yǎng)基質(zhì)量有很大的差異；加上LG培養(yǎng)基配方中含鹽較多，在自行配制過程中需按一定的投料順序一項一項進行，須等前一組完全溶解后才能加入下一組成分，否則容易出現(xiàn)混濁或沉淀，其實是LG培養(yǎng)基組分在配制過程中的性能已發(fā)生了改變，不同程度上也會影響檢測微生物的靈敏度；另外，配制過程中pH的調(diào)試也容易出現(xiàn)不穩(wěn)定性，這些因素導(dǎo)致即使是同一個飲料企業(yè)配制出來的培養(yǎng)基批間差也較大。而商品化復(fù)合型LG培養(yǎng)基是由專業(yè)培養(yǎng)基生產(chǎn)商研發(fā)生產(chǎn)的，所用的每批原材料均進行嚴格篩選，確保原材料批間質(zhì)量的穩(wěn)定性，同時通過專業(yè)的、標準化的生產(chǎn)工藝控制，確保每批復(fù)合型LG培養(yǎng)基批間的感官、理化及靈敏度的穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

PET瓶飲料無菌灌裝生產(chǎn)線的無菌驗證所用的LG培養(yǎng)基建議選用商品化復(fù)合型LG，盡量避免自行購買原材料配制LG培養(yǎng)基，以降低由于原料的質(zhì)量不穩(wěn)定以及配制的復(fù)雜過程導(dǎo)致培養(yǎng)基質(zhì)量無法控制的風(fēng)險。