黃秀， 柯甫志， 孫立方， 王平， 聶振朋， 徐建國(guó)， 孫建華

(浙江省柑橘研究所 國(guó)家柑橘品種改良浙江分中心，浙江 臺(tái)州 318026)

柑橘是世界上栽培面積最大、產(chǎn)量最高的水果，也是我國(guó)第一大水果作物[1]。柑橘以其濃郁的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及國(guó)民消費(fèi)水平的提高，對(duì)柑橘的品質(zhì)及品種多樣性提出了更高的要求，柑橘品種的更新顯得尤為重要。溫州蜜柑是浙江省主栽的柑橘品種之一，改良溫州蜜柑現(xiàn)有品種，選育出更早熟、含糖量高的溫州蜜柑新品系一直是浙江柑橘育種的主要目標(biāo)。通過(guò)珠心苗選育新品種是溫州蜜柑育種的重要途徑，但溫州蜜柑類因雄性不育一般表現(xiàn)無(wú)核，自然狀態(tài)很難形成種子[2]，給新品種選育工作增加了難度。為培育溫州蜜柑珠心苗，本實(shí)驗(yàn)選用溫州蜜柑品系由良(CitrusunshiuYura)為母本，由良屬于早熟溫州蜜柑類，由宮川芽變選育而來(lái)[3-4]，是近幾年浙江省主要推廣的品種之一，具有高糖、化渣、易剝皮、成熟期早等特性。采用有性雜交的方法，利用不同品種的花粉對(duì)由良進(jìn)行授粉，培育一批由良溫州蜜柑的珠心苗和雜交后代群體，并對(duì)不同授粉組合的果實(shí)坐果率、結(jié)籽率、種子發(fā)育等情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究不同品種花粉授粉對(duì)溫州蜜柑結(jié)籽的影響，進(jìn)而篩選出一種獲取溫州蜜柑后代群體的有效方法，加快溫州蜜柑育種進(jìn)程，培育出更多符合市場(chǎng)需求的新品種。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)在浙江省柑橘研究所試驗(yàn)站種植園進(jìn)行，以樹(shù)齡4 a的由良溫州蜜柑為母本，父本為雞尾葡萄柚(CitrusparadisiMacf)、四季柚(Citrusgrandis(Linn) Osbeck)、日本夏橙(2倍體)(CitrusnatsudaidaiHayata)和4倍體日本夏橙(CitrusnatsudaidaiHayata)。父本花粉取自浙江省柑橘研究所種質(zhì)資源圃，用4種花粉分別對(duì)由良母本進(jìn)行授粉。授粉組合為：由良×雞尾葡萄柚；由良×四季柚；由良×日本夏橙；由良×4倍體日本夏橙；以花朵自然開(kāi)放未處理的母本樹(shù)為對(duì)照組，簡(jiǎn)稱為CK。

1.2 雜交授粉

于2020年4月8日采集4種父本花粉。選擇即將要開(kāi)放的花苞帶回實(shí)驗(yàn)室，用鑷子將雄蕊取出放在培養(yǎng)皿中，置于25～28 ℃的環(huán)境下烘干，然后貯存在2 mL離心管中備用。4月10日在母本盛花期進(jìn)行授粉，選大小、花量、長(zhǎng)勢(shì)相似的15棵由良母本樹(shù)，每棵樹(shù)授粉200～300朵花，每棵樹(shù)為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)雜交組合設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。選擇花苞大但未開(kāi)放的花朵，用棉簽蘸取準(zhǔn)備好的花粉輕輕涂抹在柱頭上進(jìn)行授粉，將雜交枝條上已經(jīng)開(kāi)放和未授粉的花朵摘除，統(tǒng)計(jì)授粉花朵數(shù)。授粉當(dāng)天噴施50 mg·kg-1赤霉素?；?，并套好玻璃紙袋，1周后將玻璃紙袋去掉。在第1次生理落果之前再次噴施50 mg·kg-1赤霉素保果，之后田間管理同日常。

1.3 I2-KI溶液染色法檢測(cè)花粉活力

I2-KI溶液的配制：稱取2 g KI溶于10 mL超純水中，加入1 g I2，攪拌至完全溶解后定容至300 mL，存貯在棕色瓶中備用。

花粉活力測(cè)定：取1粒雜交授粉所用花粉的花藥置于載玻片上，加1滴超純水，用鑷子將花藥搗碎釋放出花粉粒，再加2滴I2-KI溶液，小心蓋上蓋玻片，在電子顯微鏡下觀察。同一視野下統(tǒng)計(jì)出藍(lán)色和黃褐色的花粉粒數(shù)，1張片子查看5個(gè)不同視野，每個(gè)品種查看4張玻片，凡是被I2-KI溶液染成藍(lán)色的為含有淀粉、活力較強(qiáng)的花粉粒，染成黃褐色的為發(fā)育不良的花粉粒。

1.4 雜交果實(shí)的處理

在2020年9月27日果實(shí)成熟時(shí)將雜交果實(shí)采摘帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，統(tǒng)計(jì)每個(gè)雜交組合所獲得的雜交果數(shù)。每個(gè)生物學(xué)重復(fù)隨機(jī)選取30個(gè)果實(shí)，記錄每個(gè)果實(shí)的單果重、可食率、縱徑、橫徑、種子數(shù)，觀察種子發(fā)育情況。單果種子數(shù)=種子總數(shù)/果實(shí)總數(shù)，果形指數(shù)=縱徑/橫徑。種子發(fā)育情況分為3類：1) 飽滿：種子發(fā)育完全，胚乳飽滿；2) 干癟：種子發(fā)育一般，胚乳半飽滿；3) 退化：種皮存在，胚乳基本敗育或完全消失，具體情況如圖1所示。

圖1 種子發(fā)育的情況分類

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和整理，采用Sigmplot軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)分析方法選用新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種的花粉活力

由表1可知，不同品種花粉活力不同，4倍體日本夏橙花粉活力最強(qiáng)，為72.68%；其次是日本夏橙、四季柚和雞尾葡萄柚，分別為67.15%、61.47%和61.31%。分析得出，4倍體日本夏橙與日本夏橙相比花粉活力差異不顯著，與雞尾葡萄柚和四季柚差異達(dá)到顯著水平；日本夏橙、雞尾葡萄柚和四季柚的花粉活力差異未達(dá)到顯著性水平。雞尾葡萄柚和日本夏橙標(biāo)準(zhǔn)誤較大，分別為5.57和3.48，說(shuō)明其花粉個(gè)體間活力差異較大。

表1 不同品種花粉的活力差異

2.2 不同花粉授粉對(duì)由良果實(shí)坐果率的影響

不同品種花粉對(duì)由良授粉，果實(shí)坐果率差異明顯(表2)。自然狀態(tài)下對(duì)照組由良果實(shí)坐果率為23.37%；其余4個(gè)處理組，由良×雞尾葡萄柚組合的坐果率較高，達(dá)到38.17%，與對(duì)照比較達(dá)到極顯著差異；其次是由良×日本夏橙和由良×四季柚，坐果率分別為36.78%和33.40%，均極顯著高于對(duì)照；由良×4倍體日本夏橙組合的坐果率最低，僅有24.52%，與對(duì)照差異不顯著。總體來(lái)說(shuō)，雞尾葡萄柚、日本夏橙和四季柚花粉對(duì)由良授粉均能極顯著提高果實(shí)坐果率，雞尾葡萄柚授粉果實(shí)坐果率提升效果最好，4倍體日本夏橙授粉對(duì)由良果實(shí)坐果率影響不顯著。

表2 不同花粉授粉對(duì)果實(shí)坐果率的影響

2.3 不同花粉授粉對(duì)由良種子形成的影響

不同花粉授粉對(duì)由良果實(shí)結(jié)籽情況影響不同(表3)。在5個(gè)組合中，由良×雞尾葡萄柚組合獲得的種子數(shù)最多，達(dá)到149粒；其次是由良×日本夏橙組合，101粒；再次是由良×四季柚組合，64粒；由良×4倍體日本夏橙組合的果實(shí)結(jié)籽較少，為32粒；對(duì)照組未得到種子。單果種子數(shù)從高至低依次為：由良×雞尾葡萄柚組合、由良×日本夏橙組合、由良×四季柚組合、由良×4倍體日本夏橙組合、對(duì)照組。由良×雞尾葡萄柚組合的單果種子數(shù)與由良×四季柚組合、由良×4倍體日本夏橙組合以及對(duì)照組相比，差異達(dá)到極顯著水平；由良×日本夏橙和由良×四季柚組合單果種子數(shù)顯著高于對(duì)照；由良×4倍體日本夏橙組合與對(duì)照差異不顯著。所有組合種子胚性均為多胚?？偟膩?lái)說(shuō)，由良在常規(guī)自然雜交條件下基本無(wú)種子形成，采用雞尾葡萄柚花粉對(duì)由良授粉所得種子數(shù)最多，單果種子數(shù)最高。

表3 不同花粉授粉對(duì)由良種子形成的影響

2.4 不同花粉授粉對(duì)種子發(fā)育情況的影響

從表4和圖2可知，不同雜交組合對(duì)種子發(fā)育情況影響不同。對(duì)照組沒(méi)有得到種子，在其余4組中，由良×四季柚組合所得種子的飽滿率最高，為63.49%；其次是由良×日本夏橙組合和由良×雞尾葡萄柚組合，分別為61.56%和51.74%；由良×4倍體日本夏橙組合的種子飽滿率最低，為6.67%。分析得出，由良×四季柚組合、由良×日本夏橙組合以及由良×雞尾葡萄柚組的種子飽滿率極顯著高于對(duì)照組和由良×4倍體日本夏橙組合；由良×四季柚組合、由良×日本夏橙組合以及由良×雞尾葡萄柚組合之間差異不顯著性；對(duì)照組與由良×4倍體日本夏橙組合相比差異未達(dá)到顯著水平。不同授粉組合對(duì)種子干癟率的影響不同，由良×4倍體日本夏橙組合和由良×四季柚組合種子干癟率最低，分別為2.78%和9.79%，兩者相比差異不顯著；由良×日本夏橙組合種子的干癟率為20.19%，由良×雞尾葡萄柚組合的種子干癟率最高，為36.65%；雞尾葡萄柚組合和夏橙組合種子干癟率較高，可能與花粉個(gè)體間活力差異較大有關(guān)。

表4 不同花粉授粉對(duì)種子發(fā)育的影響

圖2 不同花粉授粉所得的種子

不同授粉組合種子退化率，由低到高依次為：對(duì)照<由良×雞尾葡萄柚<由良×日本夏橙<由良×四季柚<由良×4倍體日本夏橙。由良×4倍體日本夏橙組合種子退化率極顯著高于其他3個(gè)組合，這可能與2倍體由良與4倍體花粉雜交產(chǎn)生3倍體種子，而3倍體種子多敗育有關(guān)，由良×4倍體日本夏橙組中有極少數(shù)飽滿種子，這部分種子可能是由良珠心細(xì)胞受4倍體日本夏橙花粉刺激產(chǎn)生的珠心胚；由良×雞尾葡萄柚與由良×四季柚組合種子退化率差異顯著；由良×雞尾葡萄柚與由良×日本夏橙以及由良×四季柚與由良×日本夏橙間差異均未達(dá)到顯著水平?？偟膩?lái)說(shuō)，用雞尾葡萄柚、日本夏橙和四季柚花粉對(duì)由良進(jìn)行授粉獲得的種子發(fā)育情況較好，4倍體日本夏橙花粉對(duì)由良授粉種子多退化敗育。

2.5 不同花粉授粉對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響

表5所示，由良×4倍體日本夏橙組合果實(shí)的單果重、果皮重、果皮厚在5組組合中均最高，其余組合從高至低依次為由良×日本夏橙、由良×四季柚、對(duì)照、由良×雞尾葡萄柚。雖然各組合果實(shí)可食率略有差異，但差異未達(dá)到顯著性水平。果形指數(shù)從高到低依次為：由良×雞尾葡萄柚、由良×4倍體日本夏橙、由良×日本夏橙、由良×四季柚、對(duì)照?？傮w來(lái)說(shuō)，授粉種子數(shù)多的組合，單果重和果皮重下降、果皮變薄，果形指數(shù)上升，可能因?yàn)殡u尾葡萄柚、四季柚花粉授粉提升了由良果實(shí)坐果率，使單個(gè)果實(shí)質(zhì)量下降；4倍體日本夏橙組果實(shí)坐果率低，單個(gè)果實(shí)質(zhì)量上升。

表5 不同花粉授粉對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響

3 討論

較多研究表明，異花授粉能影響果實(shí)坐果率。如藍(lán)云龍等[5]研究不同品種花粉對(duì)翡翠柚授粉，不同程度的提高了果實(shí)坐果率。王紹華等[6]的研究同樣得到異花授粉能提高水晶柚坐果率。本試驗(yàn)采用雞尾葡萄柚、四季柚、日本夏橙和4倍體日本夏橙4種花粉對(duì)由良進(jìn)行授粉，結(jié)果得到雞尾葡萄柚、四季柚、日本夏橙花粉授粉均不同程度提高由良果實(shí)坐果率。異花授粉提高由良果實(shí)的坐果率，可能是因?yàn)槿斯な诜墼黾恿酥^上附著的花粉數(shù)量，使果實(shí)的種子數(shù)增加，進(jìn)而影響了果實(shí)內(nèi)各種激素含量和激素間的比例[7-10]，從而提高了果實(shí)的坐果率，本研究中結(jié)籽率高的授粉組合果實(shí)坐果率也高，也相應(yīng)的說(shuō)明了這一點(diǎn)。本試驗(yàn)4倍體日本夏橙花粉授粉對(duì)由良果實(shí)坐果率影響不顯著，可能是因?yàn)橛闪?2倍體)與4倍體日本夏橙花粉雜交產(chǎn)生3倍體，種子少，且多敗育，對(duì)果實(shí)內(nèi)各激素含量的影響程度低有關(guān)。

雞尾葡萄柚、四季柚、夏橙均為2倍體花粉，3個(gè)品種花粉活力差異不顯著，對(duì)由良進(jìn)行授粉每個(gè)雜交組合果實(shí)結(jié)籽率和坐果率存在差異，其中以雞尾葡萄柚花粉授粉所得果實(shí)結(jié)籽率和坐果率均最高，說(shuō)明溫州蜜柑品系由良結(jié)籽和坐果情況受父本品種影響較大。雞尾葡萄柚花粉對(duì)由良授粉得到的種子總數(shù)在所有組合中最多，但種子的干癟率亦較高，這可能與雞尾葡萄柚花粉活力個(gè)體間差異較大有關(guān)。

從4種花粉對(duì)由良授粉以及自然雜交組合中獲得果實(shí)的單果種子數(shù)和坐果率等方面考慮，本研究結(jié)果表明，對(duì)于雄性不育的溫州蜜柑品系，為獲得更多種子用于珠心苗培育，宜選用同為2倍體的雞尾葡萄柚花粉進(jìn)行授粉。