黎中雪 周江玲 彭威 侯天勇

優(yōu)異的植骨材料是臨床修復(fù)骨缺損的重要手段[1]。自體骨雖然成骨活性高，但患者需要遭受二次手術(shù)，失血更多，存在傷口感染的風(fēng)險[2]，而異體骨也具有疾病傳播、免疫排斥和植入后再吸收的潛在風(fēng)險[3]，兩者都面臨來源有限的難題。因此，人工骨替代物已成為治療骨缺損的重要策略，具有來源廣泛、操作條件可控、無免疫原性等優(yōu)點，臨床對其需求量日益攀升。故對新型人工合成骨修復(fù)材料的研發(fā)和探究具有極其重大的意義。

人工骨替代物需滿足以下兩個條件：一是具有促成骨活性，以便骨組織新生和修復(fù)；二是具有足夠的機械強度，以保持其植入后的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。硅基生物活性顆粒（Silicon-based bioactive particles，SBPs）是生物活性陶瓷和玻璃在實際應(yīng)用中最重要的形式之一，因為它們便于壓入骨缺損部位，同時易于與聚合物共混制備具有生物活性和一定機械強度的骨修復(fù)材料。以SiO2為基礎(chǔ)的人工骨移植材料具有顯著的生物活性，有研究表明該類材料能與骨良好結(jié)合并刺激新骨生長。SiO2成骨修復(fù)需要提升SiO2體外礦化能力，筆者將Ca (OH)2作為鈣前體，將鈣離子引入到二氧化硅的硅酸鹽網(wǎng)絡(luò)中，通過合成納米尺寸的硅基生物活性顆粒來促進礦化。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向成骨區(qū)域遷移和誘導(dǎo)分化成骨是骨修復(fù)過程的兩個重要環(huán)節(jié)，為了檢測新合成的納米顆粒對成骨可能的影響，本研究通過與MSCs共培養(yǎng)來檢測顆粒的成骨誘導(dǎo)作用和募集細胞遷移能力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

氨水、四乙氧基硅烷和Ca (OH)2（Aladdin 公司，中國）；間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和小鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（Cyagen 公司，中國）；CCK-8 檢測試劑盒（同仁，日本）；氯仿（Sigma 公司，美國）；DAPI 試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；Trizol（北京康為生物科技有限公司，中國）；DMEM/F12 培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國）；Transwell 小室（Corning Life Sciences，美國）。RT-PCR 合成及檢測試劑（大連寶生物工程有限公司），引物由生工生物工程上海股份有限公司合成。掃描電鏡（MultiSEM 505，ZEISS，德國）；ZATA 電位分析儀（ZetaPALS，Brookhaven，美國）；多功能酶標儀（MK3，Thermo 公司，美國）：熒光顯微鏡（Ti-E，Nikon 公司，日本）；熒光定量RT-PCR（CFX96，Bio-Rad 公司，美國）。

1.2 樣品準備

二氧化硅顆粒制備：取215.7 mL 乙醇和20 mL 超純水，攪拌均勻。然后加入3.7 mL 氨水和10.4 mL 四乙氧基硅烷（TEOS），于室溫下攪拌反應(yīng)10 h，1 000 rpm，15 min 離心，分別用乙醇和超純水離心洗滌2 次后分散在超純水中，制備成濃度為2.5 mg/mL 二氧化硅顆粒懸浮液備用。

SBPs 制備：在1mmol/L 的1.5mLCa (OH)2中加入2 mL上述二氧化硅顆粒懸浮液，室溫下攪拌反應(yīng)36 h，1 000 rpm，15 min 離心收集，超純水洗滌3 次，然后分散在超純水中，制備成濃度為30wt%活性硅顆粒溶液，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

條件培養(yǎng)配置：小鼠間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中SBPs 的濃度為0、0.5、1、2、4、8μg/mL，小鼠間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中SBPs 的濃度范圍1、4、8、16、32、64μg/mL。

1.3 SBPs 的物理表征

SBPs 在掃描電鏡下（SEM）的形態(tài)：取20 L 的30wt%SBPs 溶液滴在載玻片，置于50℃烘箱中烘干，得到干燥顆粒，環(huán)境掃描電鏡于×10K 倍數(shù)下觀察顆粒的形態(tài)。

SBPs 的粒徑分布：30wt%SBPs 溶液稀釋100 倍，超聲處理5 min后，使用ZATA電位分析儀，測得顆粒的粒徑分布。

1.4 SBPs 體外生物相容性

1.4.1 系列濃度SBPs 對MSCs 增殖的影響

取P6 的小鼠骨髓MSCs，調(diào)整細胞懸液濃度，96 孔細胞培養(yǎng)板每孔所含的細胞為3 000，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱過夜，待細胞貼壁后，除去原培養(yǎng)基，加入200 L 上述濃度的BP 小鼠間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基；分別于1、3、5 d 后利用CCK-8 檢測細胞濃度；多功能酶標儀450 nm 的波長檢測每孔吸光度，OD值反映了細胞的增殖情況，每組重復(fù)3 次。

1.4.2 系列濃度SBPs 對MSCs 成骨分化的影響

按照上述步驟接種細胞至24 孔板中，分別在3、7 d 按照提取各組RNA，除去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔加入500 L的Trizol，多次吹打，轉(zhuǎn)移到EP 管。加100 L 氯仿，充分震蕩，室溫靜置5 min。4℃、12 000 rpm、離心15 min。吸取上層透明水相至無酶EP 管，加入同體積的異丙醇，混勻后室溫靜置20 min，4℃、14 000 rpm、15min。棄上清，加入1 mL 的75%乙醇重懸，12 000 rpm，離心5 min。棄上清，晾干除去乙醇，后加入30 微升Rnase-free dd H2O 重懸，-4℃保存。逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction RT-PCR）實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR Q-PCR）檢測檢測各組ALP、COLⅠ、OCN、OPN、OSX、RUNX2 相對表達量，引物設(shè)計如表1 所示。

表1 引物序列

1.4.3 系列濃度SBPs 對MSCs 遷移的影響

條件培養(yǎng)基的制備：取P6 的MSCs 接種至25 cm2培養(yǎng)瓶，細胞貼壁后，使用SBPs 濃度為0、1、4、8 μg/mL 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，3 d 后收集板內(nèi)培養(yǎng)基；細胞的接種：取P6 的MSCs 用1%FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基制備成濃度為3×105個/mL 的細胞懸液，取200 L 接種在Transwell 上室；下室加入條件培養(yǎng)基。染色：細胞培養(yǎng)箱中靜置8 h 后，4%多聚甲醛固定40 min；PBS 清洗兩次；棉簽擦拭去除小室上層細胞；使用1 g/mL DAPI 室溫下避光染色10 min；避光清洗兩次；將小室放置在載玻片上，在熒光顯微鏡（×200）下，觀察細胞的遷移情況。

按照實驗1.4.2 細胞的接種以及RNA 的提取、Q-PCR和RT-PCR，檢測MSCs 在4 g/mL SBPs 刺激下第7 d 基因SDF-1 和TGF-1 相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Prism 8.0 軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用t 檢驗分析兩組之間的差異，檢驗水平=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SBPs 的物理表征

SBPs 的平均直徑為134.3 nm，并且呈均勻分散球形顆粒，不會成團聚集，見圖1、圖2。

圖1 SBPs 的溶液狀態(tài)以及顆粒的微觀形態(tài)：A.不同濃度SBPs 溶液的光學(xué)圖像；B.SBPs 微觀形態(tài)

圖2 SBPs 粒徑分布

2.2 SBPs 體外生物相容性

2.2.1 不同濃度的SBPs 對MSCs 增殖的影響

不同濃度的SBPs 的增殖速度與對照組幾乎無差別，說明SBPs 雖然對MSCs 的增殖無促進作用，但也無細胞毒性（見圖3）。

圖3 不同濃度的SBPs 對MSCs 增殖的影響

2.2.2 不同濃度的SBPs 對MSCs 成骨分化的影響

適宜濃度下SBPs 對MSCs 有明顯的促成骨作用（見圖4）。第3 d 時4μg/mL 的SBPs 對基因ALP有明顯的促進作用，1μg/mL 和8μg/mL 對該基因無明顯的促表達作用，在第7 d 后1、4、8μg/mL 均能顯著促進ALP 的表達。不同濃度的SBPs 均能在第3 d 促進OPN 的表達，并且促進效果幾乎相同，但在第7d，OPN 的表達量出現(xiàn)明顯的差別，4μg/mL這組基因表達量為最大值，8μg/mL這組的基因表達量最低。第3 d 時，1μg/mL、4μg/mL均能促進OSX 的表達，8μg/mL與空白對照組之間無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，說明8μg/mL 的SBPs 不能促進OSX 的表達；7 d 后，三組對OSX 的表達均有明顯的促進作用，其中4μg/mL 和8μg/mL 這兩組結(jié)果相似。誘導(dǎo)分化3 天，三種濃度的SBPs 刺激下，RUNX2 的表達量相似且高于空白組，7d 后，4μg/mL 的SBPs能顯著促進該基因的表達，但在8μg/mL 的SBPs 刺激下，與3 d 的表達量無明顯差別，且顯著低于4μg/mL 的刺激組，成骨分化作用開始減弱。為了探究高濃度的SBPs 是否能誘導(dǎo)細胞成骨分化甚至出現(xiàn)抑制情況，筆者檢測了MSCs 在濃度為16、32、64μg/mL 的SBPs 作用下，成骨相關(guān)基因的表達情況。從圖5 可以看出在高濃度的SBPs 刺激下，MSCs 的成骨分化相關(guān)基因表達量都低于對照組，有明顯的抑制作用，并且隨著濃度的升高，抑制作用增強。

圖4 低濃度SBPs 刺激MSCs 成骨相關(guān)基因的相對表達量：A.ALP；B.COLⅠ；C.OCN；D.OPN；E.RUNX2；F.OSX

2.2.3 不同濃度的SBPs 對MSCs 遷移的影響

MSCs 與4 g/mL 的SBPs 共培養(yǎng)產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)MSCs 遷移的數(shù)量最多（見圖6）。進一步通過熒光顯微鏡對視野中熒光強度進行分析，其可定量反應(yīng)遷移的細胞數(shù)量，與空白對照組比較，3 個濃度組均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，其中4 g/mL 的SBPs 最顯著（見圖7，P<0.001）。因此筆者進一步檢測了MSCs 在該濃度刺激下SDF-1 和TGF-1 的相對表達量，如圖8 所示，經(jīng)4 g/mL SBPs 刺激后的MSCs 表達的SDF-1 和TGF-1 顯著多于對照組。

圖6 不同濃度的SBPs 對MSCs 遷移的影響（×200）：A.0 g/mL；B.1 g/mL；C.4 g/mL；D.8 g/mL

圖7 不同濃度的SBPs 對MSCs 遷移的定量分析

圖8 MSCs 在4 g/mL SBPs 刺激下第7 d 基因SDF-1 和TGF-1 相對表達量：A.SDF-1 相對表達量；B.TGF-1 表達量

3 討論

人工骨替代物在制備時需要加入一定的化學(xué)試劑，可能會對接觸的細胞和組織產(chǎn)生影響，因此，安全性是需要首先考慮的問題。合成材料對細胞的毒性體現(xiàn)在促進細胞死亡或是影響細胞增殖，筆者研究顯示，不同濃度的SBPs 對共培養(yǎng)的MSCs 增殖速度的影響與空白對照組幾乎無差別，提示SBPs 具有較好安全性。

二氧化硅材料在血管生成，藥物輸送[4]中得到一定應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)[5]硅酸鹽生物陶瓷通過刺激內(nèi)皮細胞與骨髓基質(zhì)細胞的相互作用，能促進血管化和成骨。雖然二氧化硅具有內(nèi)在的對抗核轉(zhuǎn)錄因子NF-B 激活的能力，對破骨細胞有明顯的抑制作用，對成骨細胞有激活作用，能夠改善骨的生化和力學(xué)性能[6]，能夠顯著提高小鼠的骨密度。但是，單純的二氧化硅納米顆粒與模擬體液或類似物反應(yīng)時，不會促進骨組織工程相關(guān)支架表面羥基磷灰石的形成。也就是說，單獨使用二氧化硅作為骨組織工程支架材料時，不會促進種子細胞在支架內(nèi)部形成羥基磷灰石，而羥基磷灰石作為骨組織重要的無機物成分，不能合成勢必影響其成骨質(zhì)量。研究表明，這可能是由于缺乏鈣離子所致，因為羥基磷灰石是以鈣離子為核心形成的微晶，微環(huán)境中鈣離子的存在有利于細胞礦化[7]。而且研究還表明，隨著硅離子的增加，骨髓間充質(zhì)干細胞的總DNA 含量、磷-粘附斑激酶和總整合素水平均上升；硅離子通過激活MAPK/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和p38 信號通路刺激細胞粘附，更有效地促進成骨[8]。此外，如果硅離子的生物活性納米顆粒的尺寸越接近于天然骨的無機組分羥基磷灰石微晶尺寸（直徑小于100 nm），成骨效果越顯著[9]。因此，筆者將TEOS 作為硅前體，通過添加氫氧化鈣，進而合成納米尺徑的生物活性顆?！猄BPs。這種顆粒既有硅離子存在，又存在骨組織礦化形成羥基磷灰石需要的鈣離子，兩種成分共同存在，同步降解，相互作用，更加穩(wěn)定，可以避免許多傳統(tǒng)復(fù)合材料的缺點，即復(fù)合材料在溶解過程中不同的吸收速率，這不可避免地導(dǎo)致體內(nèi)物質(zhì)的不穩(wěn)定[10]。

體外的成骨誘導(dǎo)實驗顯示，SBPs具有優(yōu)異的促成骨作用，并且發(fā)現(xiàn)對種子細胞的反應(yīng)性存在臨界值：4μg/mL 時，SBPs促成骨能力最強，隨著濃度升高，成骨效果降低。MSCs 在濃度8μg/mL 的刺激下，成骨相關(guān)基因的表達量低于濃度1μg/mL。可能是因為Si 離子濃度過高，降低了細胞的活性[11]，影響了細胞成骨分化能力；也可能是因為高濃度的硅離子會與成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的地塞米松結(jié)合，抑制了成骨補充劑在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的刺激作用從而影響了MSCs 成骨分化[12]。成骨誘導(dǎo)第三天，相較于其余兩組濃度，在4 μg/mL 的濃度刺激下，成骨基因有明顯的表達，這是因為硅以Si (OH)4的形式從材料中釋放出來[13]，在骨形成和鈣化的早期階段起著重要作用，已表明它可以刺激人成骨細胞產(chǎn)生I 型膠原[14]。有研究表明，硅酸可通過促進骨損傷部位SDF-1 和TGF-1 的釋放[15]，實驗1.4.3 結(jié)果證明SBPs可以誘導(dǎo)MSCs產(chǎn)生SDF-1 和TGF-1，因此筆者推測當(dāng)SBPs 植入體內(nèi)時，可以在組織微環(huán)境中通過離子交換形成硅酸后募集宿主MSCs 至骨損傷部位，加速骨損傷的修復(fù)，其潛在的機制還有待進一步驗證。

總之，本研究通過sol-gel 合成的納米尺徑的SBPs 無細胞毒性，在適宜濃度范圍內(nèi)（1～4 g/mL）具有促成骨和誘導(dǎo)MSCs 遷移作用。未來可以將其引入到天然高分子可降級材料中（如透明質(zhì)酸殼聚糖、絲素蛋白、明膠和殼聚糖等）合成新型復(fù)合骨移植材料，一方面可以發(fā)揮促成骨作用，另一方面可以誘導(dǎo)細胞遷移，在高分子材料降解后的空間內(nèi)重新形成骨組織，實現(xiàn)骨重建。