朱亮華，莊麗麗，金 蕊

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，江蘇南京 210029）

EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）廣泛感染，全世界約95%的人在某個(gè)階段都會(huì)感染，感染后通常無(wú)明顯癥狀，若累及單核巨噬細(xì)胞，可導(dǎo)致傳染性單核細(xì)胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）。有文獻(xiàn)指出，約有50%感染EB 病毒的兒童可發(fā)展為IM［1］。干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF-3）屬于IRF 家族成員之一，是負(fù)責(zé)對(duì)Ⅰ型干擾素（interferon，IFN）信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，可參與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，包括抗病毒，DNA損傷和死亡受體信號(hào)等［2］。2020 年新型冠狀病毒肺炎診治指南推薦IFN-α 作為抗病毒藥物之一。微小mRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)約22 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA 轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平，在炎性反應(yīng)、自身免疫病和腫瘤中發(fā)揮重要的作用［3］。IM患兒外周血單核細(xì)胞中IRF-3 及miRNA 的表達(dá)水平是否改變，miRNA 是否參與調(diào)控傳單病人中IRF-3 及IFN-α/β 尚不清楚。因此，本研究通過(guò)RTPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IM 患兒外周血單核細(xì)胞中IRF-3 和miRNA-146a 的表達(dá)水平，過(guò)表達(dá)及干擾miRNA-146a 后檢測(cè)IRF-3 RNA 和蛋白表達(dá)水平變化，為進(jìn)一步探討miRNA-146a 參與EB 病毒調(diào)控IM 患兒IRF-3基因表達(dá)的機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選 取2017 年1 月～2018 年12 月 在 南 京 醫(yī) 科 大學(xué)第一附屬醫(yī)院（江蘇省人民醫(yī)院）兒科住院的45例IM 患兒作為研究對(duì)象，患兒符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第八版中IM 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，年齡1～13 歲，平均（5.76±3.05）歲，男性25 例，女性20 例。選取同期門(mén)診健康體檢的34 例兒童作為對(duì)照組，年齡2～12 歲，平均（6.03±2.69）歲，男性18 例，女性16 例。兩組兒童年齡（t=0.415，P=0.339）和性別比例（χ2=4.000，P=0.261）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有可比性。

所有資料來(lái)自于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（江蘇省人民醫(yī)院），兒童監(jiān)護(hù)人均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。本研究得到南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（江蘇省人民醫(yī)院）機(jī)構(gòu)研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 材料

HeLa 細(xì)胞系由兒科實(shí)驗(yàn)室保存；Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）（Gibco，蘇州）；胎牛血清（BI，以色列）；青霉素-鏈霉素雙抗（碧云天，上海）；PBS 緩沖液（森貝佳，南京）；Dimethyl Sulfoxide（DMSO）（Amresco，美國(guó)）；胰蛋白酶（碧云天，上海）。TRIZOL（Invitrogen，美國(guó)）；異丙醇（南試，南京）；無(wú)水乙醇（南試，南京）；DEPC 水（碧云天，上海）；氯仿（南試，南京）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，上海）；甲醇（南試，南京）；BCA 蛋白濃度試劑盒（碧云天，上海）；SDS-PAGE 凝膠試劑盒（碧云天，上海）；蛋白Maker（Thermo，美國(guó)）；LipofectamineTM3000（Invitrogen，美國(guó)）；ECL 發(fā)光液（Thermo Sciemtific，美國(guó)）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗、抗IRF-3 抗 體（Sant cruz 公 司，美 國(guó)），miRNA-146a mimic，miRNA-146a inhibitor 及 對(duì) 照（銳 博 公 司，廣州）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮中將凍存的HeLa 細(xì)胞取出后，將其置入37 ℃水浴鍋中搖晃至充分溶解，加入4 mL 完全培養(yǎng)基至10 mL 離心管中，將上步中的細(xì)胞混懸液輕輕打入離心管，1 000 r/min 離心3 min。取出離心管，棄去上清液，加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打10 下，置于含7 mL 完全培養(yǎng)基的10 cm 培養(yǎng)皿中，輕輕呈米字型搖晃培養(yǎng)皿，使細(xì)胞均勻生長(zhǎng)，然后將培養(yǎng)皿置于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.3.2 細(xì)胞傳代 室溫預(yù)熱PBS、完全培養(yǎng)基和胰酶，取出待傳代的細(xì)胞（細(xì)胞密度約為85%～90%），棄 上 清，用3 mL PBS 洗 滌 細(xì) 胞2 次，加入2 mL 胰酶，放置培養(yǎng)箱中消化3 min 后，輕輕拍打培養(yǎng)皿側(cè)壁。隨后，在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察其是否消化完全，若完全消化則加入4 mL 完全培養(yǎng)基進(jìn)行終止胰酶消化，將液體轉(zhuǎn)移至另一根離心管中，1 000 r/min 離心3 min 后，棄上清后加入3 mL完全培養(yǎng)基，輕輕吹打10 下充分混均勻，然后按比例轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)LipofectamineTM3000 使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將Hela 細(xì)胞接種到12 孔板中（1.5×105/孔），待細(xì)胞增長(zhǎng)至60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每次轉(zhuǎn)染3 個(gè)復(fù)孔。

1.3.4 制備模板cDNA 分別收集兩組兒童外周血2 mL，加入2 mL Ficoll，室溫下500×g離心20 min，小心吸取第二層環(huán)狀乳白色環(huán)狀淋巴細(xì)胞層，依次按步驟加入氯仿、異丙醇、乙醇、DEPC 水，用分光光度計(jì)（onedrop）檢測(cè)RNA OD 260/280 值并記錄，按照Takara 公司說(shuō)明書(shū)，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存待用。

1.3.5 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中IRF-3和miRNA-146a基因序列設(shè)計(jì)RT-PCR引物。GAPDH和U6為內(nèi)參，由上海英駿生物有限公司合成；IRF-3上游引物：GTCGATCAAAAAGAAAGCCCCAGCG，下游引物：CATCCTGCCGTAGGCCGTGCTTCC。GAPDH上游引物：AGGTCGGAGTCAACGGAT ，下游引物：TCCTGGAAGATGGTGATG。miRNA-146a 上游引物：ACACTCCAGCTGGGCCTCTGAAATTCAGTT，下游引物：TGGTGTCGTGGAGTCG。U6上游引物：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.3.6 RT-PCR 反應(yīng) 根據(jù)Biomake 制造商說(shuō)明書(shū)，配置反應(yīng)體系如下：試劑名稱：2x SYBR green qPCR master mix，使 用 量：5 μ L；上 游 引 物（10 μ mol/L），使用量0.4 μL；下游引物（10 μmol/L），使用量：0.4 μL；ddH2O，使用量：3.2 μ L；cDNA，使用量：1 μL。

用LightCycler480Π 儀器將上述體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò) 增 程 序 為：95 ℃5 min；95 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s；將GAPDH或U6基因用作標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)，確認(rèn)溶解曲線和擴(kuò)增曲線，并通過(guò)比較CT 法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.7 蛋白免疫印跡 將6 孔板的HeLa 細(xì)胞用PBS 洗滌一次，取500 μL 胰酶消化，加入1.5 mL 完全培養(yǎng)基終止消化，離心棄上清液，并加入250 μL蛋白裂解液；將細(xì)胞裂解混合物置于渦旋儀上渦旋10 s 后冰浴10 min，重復(fù)3 次，以12 000 r/min 離心10 min，上清液即細(xì)胞總蛋白。蛋白樣品濃度檢測(cè)根據(jù)BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。配制10%分離膠，5%濃縮膠，依次進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4 °C 過(guò)夜孵育、洗膜、二抗室溫孵育1 h、洗膜、顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 7 和SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±SEM)，并且至少重復(fù)3 個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。兩組性別比較采用卡方檢驗(yàn)，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05 視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童外周血中IRF-3 和miRNA-146a 表達(dá)水平的比較

Real-time PCR 檢測(cè)IM 患兒中IRF-3 mRNA的表達(dá)較健康對(duì)照組表達(dá)下降了61%（t=30.340，P＜0.001），見(jiàn)表1。 IM 患兒外周血miRNA-146a的表達(dá)較健康對(duì)照組增加了1.63 倍（t=34.659，P＜0.001），見(jiàn)表1。

表1 兩組IRF-3 及miRNA-146a 表達(dá)水平(±SEM)Tab 1 Expression levels of IRF-3 and miRNA-146a in two groups (±SEM)

表1 兩組IRF-3 及miRNA-146a 表達(dá)水平(±SEM)Tab 1 Expression levels of IRF-3 and miRNA-146a in two groups (±SEM)

組別例數(shù)IRF-3 表達(dá)水平miRNA-146a 表達(dá)水平健康對(duì)照組IM 患兒組34 45 t P 1.07±0.11 0.42±0.08 30.340＜0.001 1.05±0.11 2.76±0.27 34.659＜0.001

2.2 IRF-3 和miRNA-146a 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

IM 患兒外周血中IRF-3 和miRNA-146a 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.960，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 IRF-3 和miRNA-146a 表達(dá)水平的相關(guān)性Fig 1 Correlation between the expression levels of IRF-3 and miRNA-146a

2.3 過(guò)表達(dá)miRNA-146a 及其抑制劑對(duì)IRF-3 mRNA 水平的影響

分別轉(zhuǎn)染miRNA-146a mimic（75 nmol/L）及其 抑 制 劑miRNA-146a inhibitor（150 nmol/L）在HeLa 細(xì)胞中，使用Real-time PCR 檢測(cè)IRF-3 mRNA。與對(duì)照組（mimic control）相比，miRNA-146a mimic 組IRF-3 mRNA 的表達(dá)明顯降低（t=8.270，P＜0.001），見(jiàn)表2。 而miRNA-146a 抑制劑組IRF-3 mRNA 的表達(dá)較對(duì)照組（inhibitor control）明顯升高（t=8.582，P＜0.001），見(jiàn)表3。

表2 miRNA-146a 過(guò)表達(dá)對(duì)IRF-3 mRNA 表達(dá)的影響(±SEM )Tab 2 Effect of overexpression of miRNA-146a on IRF-3 mRNA expression(±SEM)

表2 miRNA-146a 過(guò)表達(dá)對(duì)IRF-3 mRNA 表達(dá)的影響(±SEM )Tab 2 Effect of overexpression of miRNA-146a on IRF-3 mRNA expression(±SEM)

組別mimic control miRNA-146a mimic t P IRF-3 mRNA 表達(dá)水平1.03±0.06 0.49±0.07 8.270＜0.001

表3 miRNA-146a 抑制劑對(duì)IRF-3 mRNA 表達(dá)的影響(±SEM)Tab 3 Effect of miRNA-146a inhibitor on IRF-3 mRNA expression (±SEM)

表3 miRNA-146a 抑制劑對(duì)IRF-3 mRNA 表達(dá)的影響(±SEM)Tab 3 Effect of miRNA-146a inhibitor on IRF-3 mRNA expression (±SEM)

組別inhibitor control miRNA-146a inhibitor t P IRF-3 mRNA 表達(dá)水平1.01±0.05 1.52±0.07 8.582＜0.001

2.4 過(guò)表達(dá)miRNA-146a 及其抑制劑對(duì)IRF-3 蛋白水平的影響

分別轉(zhuǎn)染miRNA-146a mimic（75 nmol/L）及其 抑 制 劑miRNA-146a inhibitor（150 nmol/L）在HeLa 細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)Western blot 法對(duì)IRF-3 蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明miRNA-146a mimic 組（0.72±0.01）較對(duì)照組（1.22±0.02）IRF-3 的表達(dá)明 顯 下 調(diào)（t=46.170，P＜0.001），見(jiàn) 圖2A。而miRNA-146a inhibitor 組（1.48±0.02）較 對(duì) 照 組（0.89±0.01）IRF-3 蛋 白 的 表 達(dá) 明 顯 上 調(diào)（t=25.891，P＜0.001），見(jiàn)圖2B。

圖2 miRNA-146a 過(guò)表達(dá)（A）及抑制劑（B）對(duì)IRF-3 蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect of miRNA-146a overexpression（A）and inhibitor（B）on IRF-3 protein expression

3 討論

傳染性單核細(xì)胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）是一種自限性疾病，以喉嚨痛、頸淋巴結(jié)腫大、疲勞和發(fā)熱為臨床特征，但可合并肺炎、心肌炎、血小板減少、中性粒細(xì)胞減少等并發(fā)癥，部分患者可能表現(xiàn)為慢性活動(dòng)性EBV（CAEBV）。CAEBV 的患者通常表現(xiàn)出在IM 期間出現(xiàn)的體征，如發(fā)熱、淋巴結(jié)病、脾腫大和肝炎，并且血液中EBV DNA 的水平顯著升高。較不常見(jiàn)的是，患者也可能出現(xiàn)EBV 相關(guān)的噬血細(xì)胞綜合征或EBV 相關(guān)的噬血細(xì)胞淋巴組織細(xì)胞增生癥（HLH），該病3 年生存率僅為60%［5］。固有免疫反應(yīng)對(duì)于維持免疫穩(wěn)態(tài)和消滅入侵病原體至關(guān)重要，這涉及多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)和翻譯后修飾。IRF3 可誘導(dǎo)IFN-I 產(chǎn)生，對(duì)于先天性抗病毒反應(yīng)至關(guān)重要。2019 年末開(kāi)始肆虐全球的新型冠狀病毒（2019-nCoV）肺炎，重癥患者可快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、膿毒性休克、頑固性代謝性酸中毒和難以控制的出凝血功能障礙，多版本國(guó)家臨床診治指南均將IFN-α 作為新冠肺炎抗病毒治療藥物之一。有文獻(xiàn)報(bào)道［6］，重組人干擾素α1b 輔助阿昔洛韋治療可以有效改善IM 患兒免疫功能，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷。微小RNAs（miRNAs）是一種約22 bp 的非編碼RNA，它具有內(nèi)源性的單鏈進(jìn)化保守序列，通常作為一種內(nèi)源性的基因表達(dá)抑制劑，通過(guò)抑制mRNA 的降解和翻譯，在許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮多種功能，包括自身免疫反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥等。EB病毒感染致IM 患兒體內(nèi)IRF-3 及miRNA 的表達(dá)水平及其相關(guān)性如何，miRNA 是否參與調(diào)控EB 病毒感染病人中IRF-3 及IFN-α/β 尚不清楚。

本研究通過(guò)檢測(cè)IM 患兒和健康對(duì)照兒童外周血中miRNA-146a 的表達(dá)水平，結(jié)果表明兩組存在明 顯 差 異，這 與Ning［7］，Hatton 等［8］，Boosani 和Agrawal［9］的 研 究 結(jié) 果 相 同，EB 病 毒 誘 導(dǎo) 成 人 機(jī) 體產(chǎn)生miRNA21、23、24、27、34、146a、155。實(shí)驗(yàn)組患兒外周血中檢測(cè)的IRF-3 表達(dá)水平低于健康兒童。相關(guān)性分析顯示，miRNA-146a 與IRF-3 表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這表明EB 病毒越高，IRF-3 水平則越低，反之則越高，兩者相互影響，參與疾病的進(jìn)展。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明，在HeLa 細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miRNA-146a 及其抑制劑對(duì)IRF-3 mRNA 水平有影響，檢測(cè)到IRF-3mRNA 及蛋白水平均有顯著降低和升高。證實(shí)在EB 病毒下調(diào)IM 患兒IRF-3基因的表達(dá)過(guò)程中，miRNA-146a 可能發(fā)揮重要作用并參與IM 的發(fā)病。EB 病毒潛伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，Lmp1），可 通 過(guò)NF-κB 途 徑 導(dǎo) 致miRNA-155 表達(dá)提高，同時(shí)還能與其靶向結(jié)合，導(dǎo)致免疫信號(hào)通路中IKKε、SHIP1、MyD88 等因子出現(xiàn)異常表達(dá)，這表明EB 病毒具有調(diào)控人體miRNA表達(dá)，進(jìn)而破壞人體免疫功能的作用［10-13］。miRNA-146 家 族 包 括miRNA-146a 和miRNA-146b，上 述2個(gè)成員靶基因基本相同，主要定位于人體5 號(hào)染色體與10 號(hào)染色體中，但兩者在3，末端核苷酸存在一定區(qū)別［14］。大量研究表明，miRNA-146a 與人體免疫應(yīng)答存在明顯關(guān)系，其不僅能通過(guò)作用于TLRs，如TLR2、TLR4、TLR5/MyD88/NF- κB 通 路 和RIG-I 通 路 中 的 主 要 因 子 的TRAF6、IRAK-1 和IRAK-2，對(duì)人體免疫起到負(fù)向調(diào)控的作用［15-17］，還具有通過(guò)miRNA-146a 抑制轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白1 活性，從而降低人體白細(xì)胞介素2 的表達(dá)，起到抑制T淋巴細(xì)胞的增生的作用；此外還可通過(guò)抑制Fas 表達(dá)，起到阻止結(jié)構(gòu)域蛋白的合成，讓T 淋巴細(xì)胞發(fā)生活化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［18］。miRNA-146a 在人體免疫功能中起到了舉足輕重的作用，其在人體發(fā)生免疫性疾病或是腫瘤疾病中作用也被證實(shí)。有研究表明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者外周血單核細(xì)胞中miRNA-146a 表達(dá)下調(diào)，引起外周血單核細(xì)胞中Ⅰ型干擾素（IFN）表達(dá)下降，同時(shí)miRNA-146a表達(dá)水平與SLE 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分及IFN 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，這表明miRNA-146a 能靶向作用于IRF-5，從而起到讓TRAF6 和IRAK1 直接抑制Ⅰ型IFN 調(diào)控通路，達(dá)到相應(yīng)的靶向作用。所以，我們推測(cè)miRNA-146a 有 望 成 為SLE 患 者 治 療 的 新 靶 點(diǎn)［19］。其它研究指出，甲狀腺癌患者中miRNA-146a 表達(dá)上調(diào)，乳腺癌中高表達(dá)的miRNA-146a 可負(fù)向調(diào)控TRAF6、IRAK1、NF-κB 等，這進(jìn)一步證實(shí)miRNA-146a 可作為治療部分腫瘤疾病的新靶點(diǎn)［20］。還有，在丙型肝炎中當(dāng)miRNA-122 表達(dá)上調(diào)時(shí)，可起到防止HCV-RNA 降解的作用；服用miRNA-122 抑制藥物的患者，其miravirsen 在治療后能有效地降低HCV-RNA 的表達(dá)水平，同時(shí)患者耐藥性較低，表明miRNA 靶向治療EB 病毒相關(guān)疾病有顯著成效［21，22］。EB 病毒不僅在兒童IM 疾病中起到重要作用，同時(shí)在鼻咽癌［23］、淋巴瘤［24，25］等腫瘤疾病的發(fā)病中扮演重要角色，而IRF 具有抑制EB 病毒于腫瘤的作用，且兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，這為后續(xù)臨床研究病毒相關(guān)疾病的治療提供幫助。

綜上所述，鑒于miRNA-146a 與IRF-3 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，后續(xù)重點(diǎn)研究miRNA 能否成為EB 病毒相關(guān)腫瘤療效評(píng)價(jià)指標(biāo)，以及進(jìn)一步探討EB 病毒相關(guān)腫瘤病人中miRNA-146a 對(duì)IRF-3 基因的調(diào)控及其機(jī)制，為將來(lái)miRNA 靶向治療EB 病毒相關(guān)疾病提供幫助。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

朱亮華：負(fù)責(zé)臨床標(biāo)本收集，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，撰寫(xiě)文稿；莊麗麗：負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；金蕊：負(fù)責(zé)總體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)分析。