梁馨文，邢 璐，董世雄，徐士軍，張 健，段夢琪，張 博，商 鵬*

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院/西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏林芝 860000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100094）

肌肉是評定豬肉肉質(zhì)性狀的重要標(biāo)志之一，也是豬維持正常運動和生理代謝過程中必不可少的組成部分[1]。動物的肌肉生長發(fā)育機制非常復(fù)雜，是受許多遺傳基因以及信號通路等復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的[2]。組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白1（histidine triad nucleotidebinding protein1，HINT1）基因是HIT蛋白超家族的成員之一[3-4]，屬于組氨酸三聚體蛋白核苷酸轉(zhuǎn)移酶和水解酶家族成員[5]，在原核生物和真核生物中廣泛表達[6]。有研究報道，哺乳動物HINT1蛋白可作用于多種信號通路[7]，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性，調(diào)節(jié)細胞的分化、在促使細胞凋亡、抑制細胞增殖和腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用[8]。截至目前，多數(shù)研究報道圍繞HINT1基因大多跟人類疾病相關(guān)，已有研究證實HINT1基因的突變會導(dǎo)致人類常染色體軸突神經(jīng)病變伴神經(jīng)肌強直[9]，這些患者會出現(xiàn)肌肉無力，肌肉萎縮等相關(guān)癥狀[10-11]，表明HINT1基因?qū)∪馍L性狀和肌肉發(fā)育具有一定的影響。HINT1基因在豬肌肉生長上的研究還未見報道。

大約克豬是著名的瘦肉型豬種，具有生長速度快、飼料利用率高和瘦肉率高等特點[12]。藏豬是世界上少有的高原型畜種，也是我國特有的地方品種資源，其能適應(yīng)惡劣的高寒氣候，具有體型小、生長速度慢[13]和胴體瘦肉率低等特點[14]。藏豬是西藏開發(fā)特色產(chǎn)業(yè)和推廣綠色食品的重要物種資源，圍繞藏豬生長和肉質(zhì)性狀的研究顯得越發(fā)重要，本試驗主要探究HINT1基因在藏豬和大約克豬中的多態(tài)性以及在兩豬種的背最長肌和腿肌組織中的表達水平，為進一步了解HINT1基因在豬肌肉組織中的調(diào)控作用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物材料

試驗選擇飼養(yǎng)于西藏林芝市西藏農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實習(xí)牧場（海拔2 900 m左右）的藏豬（TP）和林芝市宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司的大約克豬（YY）作為試驗對象。試驗豬只均為去勢公豬，隨機挑選30日齡、90日齡及180日齡且各個日齡的生長情況相近的藏豬和大約克豬各8頭進行屠宰，屠宰后30 min內(nèi)采集背最長肌組織和腿肌組織，放入RNA保存液，待RNA保存液與樣本充分接觸后置于液氮中保存，迅速帶回實驗室，-80℃保存，用于總RNA提取。采集93份耳組織（藏豬48頭，大約克豬45頭），置于75%酒精中，-20℃保存用于DNA提取。

1.2 主要試劑

RNase free water、Fastking cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Power Taq PCR Master Mix（Bioteke Gorporation）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green)、Trizol（Thermo fisher）、SYBR Green Mix等均來自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 DNA、RNA的提取及cDNA制備

采用苯酚-氯仿法從耳組織中提取基因組DNA，提取合格的DNA放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Trizol法提取RNA，用NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA樣品的濃度，配置1%的瓊脂糖膠分別檢測RNA和DNA的完整性，提取合格的RNA放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用一步法cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計及合成

從NCBI官網(wǎng) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載HINT1基因的mRNA序列（登錄號：NM_005661623），用于實時熒光定量PCR引物設(shè)計，以GAPDH（登錄號：NM_001206359）作為內(nèi)參基因，實時熒光定量PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行設(shè)計并合成，合成后用RNase-Free water溶解，于4℃保存，定量引物見表1。

表1 定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative analysis

1.5 DNA引物設(shè)計與合成

登錄 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），下載 HINT1 基因(登錄號：NC_010444)DNA序列。使用Premier 5.0軟件設(shè)計HINT1基因5'側(cè)翼區(qū)的特異性引物，送至上海生物工程有限公司合成，合成后用RNase-Free water溶解，4℃保存，引物序列見表2。

表2 HINT1基因5'側(cè)翼區(qū)引物序列Table 2 Primer sequence of HINT1 gene 5'lateral region

1.6 實時熒光定量PCR

以cDNA為模板，選用GAPDH為內(nèi)參基因，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，PCR反應(yīng)體系20 μL:SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，RNase-free ddH2O 8 μL，cDNA 模板 1 μL。在實時熒光定量PCR儀（羅氏，Light Cycler96）進行擴增。

1.7 HINT1基因的SNPs位點篩選

采用Sanger測序法對藏豬和大約克豬HINT1基因的起始密碼子上游3 000 bp區(qū)域左右進行單核苷酸多態(tài)性分析。以提取的藏豬和大約克豬DNA為模板，首先選取藏豬和大約克豬各10頭，采用混池測序?qū)INT1基因分析，經(jīng)Chromas Pro軟件進行序列對比分析，篩選出具有有效突變意義的SNPs位點后，擴大樣本進行單個個體測序，由上海生物工程股份有限公司進行測序，將所得測序結(jié)果進行基因型頻率與基因頻率統(tǒng)計。

1.8 統(tǒng)計分析

首先使用Excel整理實時熒光定量PCR的結(jié)果，采用2-ΔΔCt法計算HINT1基因的mRNA的相對表達量。利用SPSS 25.0軟件對HINT1基因表達量進行顯著性分析，利用Graphpad Prism8制備圖表，軟件以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。運用Excel計算各個突變位點的基因頻率和基因型頻率，使用卡方檢驗分析HINT1基因的基因型頻率和基因頻率的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取結(jié)果

所提取的組織RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量較好。由圖1可知，28s和18s條帶清晰，其OD值范圍在1.8～2.2之間，無降解也未有蛋白質(zhì)和DNA污染，無明顯拖尾，滿足了后續(xù)試驗要求。

圖1 RNA樣品凝膠電泳檢測結(jié)果Figure 1 Gel electrophoresis results of RNA samples

2.2 HINT1基因在肌肉組織中的mRNA表達

運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測HINT1基因在藏豬和大約克豬背最長肌和腿肌組織中的表達水平，結(jié)果見圖2。由圖2A可知，HINT1基因在30日齡藏豬背最長肌組織中的mRNA表達量極顯著高于大約克豬（P20.01）；90日齡藏豬和大約克豬表達差異不顯著（P30.05）；180日齡藏豬背最長肌組織中的mRNA表達量顯著高于大約克豬（P20.05）。由圖2B可知，HINT1基因在30日齡和90日齡藏豬腿肌組織中的 mRNA表達量極顯著高于大約克豬（P20.01），180日齡藏豬腿肌組織中的mRNA表達量顯著高于大約克豬（P20.05）。

圖2 藏豬大約克豬HINT1基因30、90和180 d在背最長肌、腿肌組織中mRNA表達量Figure 2 mRNA expression levels of HINT1 gene in longissimus dorsi muscle and leg muscle of Tibetan pigs at 30,90 and 180 days of age

2.3 HINT1基因的SNPs位點分析

利用Chromas Pro和SPSS18.0進行分析，HINT1基因共有5個突變位點，結(jié)果見圖3分別為：A-2230G、C-2209T、A-2174G、T-2083C 和 A-2082G，經(jīng)卡方檢驗，所存在的5個突變位點均符合哈迪-溫伯格定律（P30.05）?；蛐皖l率、基因頻率及卡方檢驗結(jié)果見表3。

表3 HINT1基因多態(tài)性位點基因型頻率和等位基因頻率Table 3 HINT1 gene polymorphism loci genotype frequency and allele frequency

圖3 HINT1基因SNPs位點測序峰圖Figure 3 Sequencing peak of SNPs of HINT1 gene

3 討論

肌肉發(fā)育是由營養(yǎng)、時間、飼養(yǎng)管理、基因等多種因素共同影響的[15]，其中基因作為影響其發(fā)育的內(nèi)在因素受到育種工作者的高度關(guān)注。組氨酸三聚體蛋白超家族是一個具有核苷酸轉(zhuǎn)移酶和水解酶活性的家族，HINT1蛋白是組氨酸三聯(lián)體（HIT）家族的成員之一[16]，它是一類普遍存在于哺乳動物組織、在進化中高度保守、分布最為廣泛的一種蛋白[17]。有研究證實，HINT1基因的缺失會促進小鼠胚胎成纖維細胞的生長[18]，肌肉組織是從中胚層細胞中分化而形成的，中胚層分化出兩種不同類型的細胞，即成肌細胞和成纖維細胞，成纖維細胞的生長進一步影響肌肉組織發(fā)育。在陳瑩等[1]的研究中表明了在不同階段藏豬與大約克豬中背最長肌組織的表達有著顯著差異，且根據(jù)豬的生長趨勢以及前人的研究報道得知豬的快速生長階段是2～6月齡[19]，所以本文分別選取了30日齡、90日齡、180日齡的藏豬和大約克豬作為試驗對象。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，藏豬HINT1基因在背最長肌和腿肌組織中的表達量均在30日齡時達到巔峰，隨后在90日齡和180日齡呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，并且在30日齡時藏豬的背最長肌和腿肌組織中的表達水平極顯著高于大約克豬（P20.01）。在90日齡時藏豬的背最長肌組織中的表達量高于大約克豬，但差異不顯著（P=0.284），但在腿肌組織中藏豬的表達水平極顯著高于大約克豬（P20.01），這說明不同豬種的肌肉組織在不同生長時期的生長速度是不同的，而藏豬在剛出生時的肌肉生長速度明顯低于大約克豬[20-21]，這可能是藏豬生長緩慢的原因之一，且90日齡和180日齡是豬肌肉發(fā)育的關(guān)鍵時期，藏豬和大約克豬分別在兩組織上表達趨勢一致，但在90日齡稍有差別，這可能與不同發(fā)育階段不同肌纖維類型生長速度不一致有關(guān)[22]。180日齡時藏豬的背最長肌和腿肌組織中的表達水平顯著高于大約克豬（P20.05）。結(jié)合李潔等[23]的研究表明HINT1基因與氨酰-tRNA合成酶具有相同的水解產(chǎn)物，而表達氨酰-tRNA合成酶的相關(guān)基因會導(dǎo)致腓骨肌萎縮[23]。推測HINT1基因在豬的肌肉生長發(fā)育過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

本研究在HINT1基因5'側(cè)翼區(qū)起始密碼子上游3 000 bp左右發(fā)現(xiàn)5個突變位點：A-2230G、C-2209T、A-2174G、T-2083C 和 A-2082G。上述單核苷酸多態(tài)性位點的基因型頻率和基因頻率在藏豬和大約克豬中存在極顯著差異（P20.01），且符合哈迪溫伯格定律，推測這5個SNPs位點多態(tài)性可能是受HINT1基因調(diào)控后的品種間性狀導(dǎo)致。結(jié)合5個SNPs位點的多態(tài)性與實時熒光定量PCR結(jié)果，進一步證明了HINT1可能是影響豬肌肉生長的關(guān)鍵功能位點，這符合藏豬和大約克豬的品種特性。研究結(jié)果表明HINT1基因會抑制肌肉的生長發(fā)育，但是對于該基因具體分子調(diào)控機制還需要進一步討論。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究采用RT-qPCR和Sanger測序法，從不同品種豬的兩個肌肉組織著手，探究了HINT1基因5'側(cè)翼區(qū)域的多態(tài)性及mRNA表達差異的分析，推測5'側(cè)翼區(qū)SNPs的變化影響了HINT1基因的mRNA表達水平，且HINT1基因的表達與骨骼肌的生長發(fā)育呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果為進一步探索豬生長發(fā)育及分子輔助育種提供一定的新思路和理論依據(jù)。