李樞妍 陽黎恒 肖雪婷 胡錦歡 張紅巖 申乃坤 姜明國

摘要：【目的】篩選獲得對香蕉枯萎病病原菌具有拮抗作用的菌株，為香蕉枯萎病生物防治提供菌株資源?！痉椒ā恳韵憬陡H土壤為材料，利用鉻天青（Chromeazurol S，CAS）雙層平板法和平板對峙法篩選可分泌鐵載體且對香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的菌株;通過平板對峙法測定拮抗菌株對6種常見植物病原菌的拮抗活性;通過形態(tài)學觀察、生理生化測定和16S rDNA序列分析明確拮抗菌株的分類地位;通過盆栽試驗驗證拮抗菌株對香蕉枯萎病的防治效果及對香蕉植株的促生作用?！窘Y果】經CAS培養(yǎng)基初篩，從土壤中分離獲得60株可分泌鐵載體的菌株，平板對峙法復篩得到5株拮抗作用較強的菌株，其中菌株Gxun-2的抑菌效果最強，平均抑菌率達74.45%，且對供試的其他6種植物病原菌均具有較好的抑制效果，具有廣譜抗菌性。結合菌落形態(tài)、生理生化及16S rDNA進化樹分析結果，菌株Gxun-2鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。盆栽試驗顯示，菌株Gxun-2對香蕉枯萎病具有較好的防病作用，防治效果達84.21%，且對香蕉植株具有一定的促生效果，香蕉苗鮮重較對照增加32.96%?！窘Y論】菌株Gxun-2對香蕉枯萎病具有較好的防治作用，且對香蕉植株具有一定的促生效果，可作為研制香蕉枯萎病生防菌劑的候選菌株資源。

關鍵詞： 香蕉枯萎病;鐵載體;拮抗菌;分離鑒定;抑菌效果

中圖分類號： S436.681;Q939.95? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）07-1826-09

Screening， identification and biocontrol effect of antagonistic bacteria against banana Fusarium wilt

LI Shu-yan1， YANG Li-heng1， XIAO Xue-ting1， HU Jin-huan1，

ZHANG Hong-yan2， SHEN Nai-kun1*， JIANG Ming-guo1， 2

（1College of Oceanography and Biotechnology，Guangxi University for Nationalities/Guangxi Key Laboratory of Polysaccharide Materials and Modification/Guangxi Key Laboratory of Efficient Microbial and Plant Resources Utilization， Nanning? 530000， China; 2School of Chemistry and Chemical Engineering， Guangxi University for Nationalities/Guangxi Key Laboratory of Forest Products Chemistry and Engineering， Nanning? 530000， China）

Abstract：【Objective】The aim was to screen and obtain antagonistic strains against banana Fusarium wilt， and provide strain resources for biological control of banana Fusarium wilt. 【Method】The banana rhizosphere soil was used as the material to screen the strains that could secrete siderophores and had antagonistic effect on Fusarium oxysporum f sp. cubense by using chromeazurol S （CAS） double-layer plate and plate confrontation method. The antagonistic activity of antagonistic strains against six common plant pathogenic bacteria was determined by plate confrontation method. The taxonomic status of the antagonistic strains was clarified through physiological and biochemical determination and 16S rDNA sequence analysis. The pot experiment was conducted to verify the efficacy of the antagonistic strains against banana Fusarium wilt and their growth-promoting effects on banana plants. 【Result】After initially screened with CAS medium， 60 strains secreting siderophores were screened out from the soil， and five strains were selected out of them by plate confrontation method. Among them， Gxun-2 had the highest bacteriostatic rate， reaching 74.45%， and had fine inhibitory effect on the other six plant pathogens tested， with broad-spectrum antibacterial property. Combined with colony morphology， physiology and biochemistry and 16S rDNA phylogenetic tree analysis， Gxun-2 was identified as Pseudomonas aeruginosa. Pot experiment showed that the strain had obvious disease prevention effect on banana? Fusarium wilt with the control effect reaching 84.21%. It had certain growth promoting effect on banana plants，? the fresh seedling weight increased by 32.96%. 【Conclusion】Gxun-2 strain has a strong effect on preventing and treating banana wilt， and promoting growth of banana seedlings， and can be used as a candidate strain resource for development of candidate strain resources for biological control of banana Fusarium wilt.

Key words： banana Fusarium wilt; siderophores; antagonistic bacteria; isolation and identification; bacteriostatic effect

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31660022）; National Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program（202010608012）; Guangxi Science and Technology Key Research and Development Project（AA18242026）; Xiangsihu Young Scholars Innovation Team Project of Guangxi University for Nationalities（2017-6）

0 引言

【研究意義】香蕉是世界上貿易量最大的水果之一，也是許多國家的主糧作物，具有十分重要的地位。病蟲害是香蕉產業(yè)化生產的制約因素之一，其中香蕉枯萎病對香蕉的危害最為嚴重。香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense，FOC）引起的真菌土傳病害，其發(fā)生范圍廣泛，易于流行且難以防治（莊令，2017;Wang et al.，2018;馬鳳娟等，2019）。香蕉枯萎病病原菌侵染香蕉植株后，會使維管束組織堵塞，嚴重時植株直接死亡，造成香蕉大量減產，甚至絕產。目前，香蕉枯萎病在我國云南、廣西和福建等香蕉主產區(qū)大面積發(fā)生（蘇琴等，2019），給我國香蕉種植業(yè)造成毀滅性打擊，與水稻輪作是當前防治該病害的最有效途徑，但需要較長的種植周期才能發(fā)揮效果（楊迪等，2021）。生物防治具有安全、綠色、高效等優(yōu)點，篩選更多效果好、易培養(yǎng)的拮抗菌則是香蕉枯萎病生物防治的基礎工作，對香蕉產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】前人研究表明，可分泌鐵載體的細菌通過與植物病原菌競爭鐵離子（Gamalero and Glick，2011），同時分泌吩嗪、表面活性劑和羊毛硫抗生素等活性物質（Rungin et al.，2012），從而抑制病原菌生長;此外，分泌鐵載體的菌株往往還可促進植物生長。Derbyshire等（2019）研究了40株PGPR菌株，發(fā)現這些菌株既能分泌鐵載體，又能顯著抑制致病的尖孢鐮刀菌和番茄青枯病菌菌絲生長;Ghazy和El-Nahrawy（2020）利用CAS雙層平板法篩選出2株高產鐵載體的菌株，并證明其能有效抑制玉米晚枯病菌菌絲生長和促進玉米植株生長。針對香蕉枯萎病拮抗菌也有較多研究。黃建鳳等（2017）從發(fā)生香蕉枯萎病蕉園健康植株根際篩選出2株拮抗菌，鑒定為枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，生防效率分別為59.1%和53.0%;徐志周等（2019）篩選出1株拮抗菌鑒定為伯克霍爾德菌，并通過正交試驗進行發(fā)酵條件優(yōu)化，極大提高了其對尖孢鐮刀菌的抑菌率;葉乃瑋等（2019）通過平板對峙法篩選出3株對香蕉枯萎病菌有拮抗效果的木霉菌，并通過溫室和大田藥效試驗檢測組合菌株的防效，結果表明，組合木霉菌對香蕉枯萎病的防治效果顯著高于對照組，并對香蕉單穗重有一定的提升效果;賴寶春等（2020）利用平板對峙及盆栽試驗等方法，發(fā)現灰銹赤鏈霉菌可對香蕉枯萎病產生良好的生防效果，且具有促生作用;周維等（2020）通過平板對峙法、生長速率法、平板對扣法及杯苗灌根接種法，發(fā)現菌株G9R-3能提高盆栽抗、感病香蕉品種的防治效果;楊迪等（2021）在香蕉根際土壤中篩選出2株對香蕉枯萎病具有良好防治效果的細菌，經鑒定為貝萊斯芽孢桿菌?！颈狙芯壳腥朦c】生物防治具有研發(fā)周期相對短及環(huán)境友好等優(yōu)點，是目前香蕉枯萎病防治的研究熱點之一。而篩選更多效果好、易培養(yǎng)的拮抗菌是香蕉枯病生物防治的基礎工作，但目前篩選香蕉枯病拮抗菌的方法單一，效率較低?！緮M解決的關鍵問題】以健康香蕉根際土壤為分離來源，利用鉻天青（Chromeazurol S，CAS）雙層平板分離可分泌鐵載體的菌株，再利用平板對峙法對分離菌株的拮抗效果進行復篩，篩選出抑菌率最高的菌株，進而對高抑菌率菌株進行分類鑒定、抑菌譜測定及香蕉枯萎病盆栽防效試驗，從而確定高抑菌率菌株的分類地位及對香蕉枯萎病的生防效果，旨在為高抑菌率菌株的進一步田間開發(fā)應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試生防菌株從廣西金穗集團農場健康香蕉根際土壤中分離純化獲得。供試病原菌為香蕉枯萎病菌尖孢鐮刀菌4號生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense race 4，Foc4），其他供試植物病原真菌有香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、小麥平臍蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）、假禾谷鐮刀菌（F. pseudo graminearum）、煙草赤星菌（Alternaria alternata）、煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）和蘿卜黑心病原菌（Plectosphaerella cucumerina），均由廣西農業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 拮抗菌的分離篩選與拮抗能力評估 分泌鐵載體細菌篩選：采用CAS雙層平板篩選分泌鐵載體細菌。將采集的健康香蕉根際土壤分別稀釋10-1、10-2和10-3等3個梯度懸液，每個濃度吸取100 μL分別涂布在PDA、LB和NA培養(yǎng)基上分離單菌落，將分離得到的菌株點樣至CAS檢測平板（朱芝宜等，2020），35 ℃下培養(yǎng)24～48 h，根據平板上顏色的變化（由藍到橙）及光圈直徑大小，篩選出分泌鐵載體較強的菌株。

香蕉枯萎病拮抗菌篩選：采用平板對峙法篩選香蕉枯萎病拮抗菌。以香蕉枯萎病菌尖孢鐮刀菌4號生理小種（以下簡稱尖孢鐮刀菌）為靶標菌，對分離到的可分泌鐵載體菌株進行拮抗活性篩選。先將尖孢鐮刀菌接種到PDA培養(yǎng)基上30 ℃下培養(yǎng)7 d，然后用滅菌打孔器打成5 mm的圓形菌餅，再接種到PDA培養(yǎng)基中央，在距離中央2.5 cm處點接篩選出的可分泌鐵載體菌株菌液，每個培養(yǎng)基對稱選取4個點，以只接尖孢鐮刀菌的PDA培養(yǎng)基為對照，每組3個重復，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。觀察可分泌鐵載體菌株對尖孢鐮刀菌的抑制效果，待對照菌落長滿整個培養(yǎng)皿時，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，計算抑菌率。抑菌率（%）=（對照組靶標菌菌落平均直徑-試驗組靶標菌菌落平均直徑）/對照組靶標菌菌落平均直徑×100（桑建偉，2018）。

拮抗菌株抑菌譜測定：測定拮抗菌株對其他6株供試植物病原菌的拮抗活性，方法同香蕉枯萎病拮抗菌篩選。

拮抗菌株對病原菌菌絲生長及形態(tài)的影響：分別挑取與拮抗菌株對峙平板上的病原菌菌絲與對照組病原菌菌絲于潔凈載玻片上制片，在光學顯微鏡下觀察并記錄菌絲生長及形態(tài)。

1. 2. 2 拮抗菌株分類鑒定

1. 2. 2. 1 形態(tài)學觀察 將拮抗菌株在LB培養(yǎng)基上劃線28 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色及透明度等特征，并在光學顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。

1. 2. 2. 2 生理生化特征 拮抗菌株的生理生化反應測定參照《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）和《伯杰細菌鑒定手冊》（布坎南和吉本斯，1984）。

1. 2. 2. 3 拮抗菌株種屬鑒定 將拮抗菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，取1 mL菌液12000 r/min離心1 min收集菌體，采用Chelex-100提取拮抗菌DNA。使用通用引物Eubac27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和Eubac1492R（5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'）作為細菌16S rDNA擴增上、下游引物（周登博等，2017）。PCR反應體系50 μL：上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，2×Taq PCR Mix 25 μL，ddH2O 21 μL;擴增程序：95 ℃預變性4 min;95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進行32個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行序列比對，運用MEGA 6.0的Neighbor-joining法（自展數為1000）構建并分析菌株系統發(fā)育進化樹（楊迪等，2021）。

1. 2. 3 拮抗菌株對香蕉枯萎病盆栽防效及對香蕉植株的促生作用測定

1. 2. 3. 1 拮抗菌株發(fā)酵原液制備 挑取LB固體培養(yǎng)基上拮抗菌株單菌落到LB液體培養(yǎng)基中35 ℃過夜培養(yǎng)作為種子液，按2%的接種量轉接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min下35 ℃培養(yǎng)2 d，稀釋至OD600=1.0，用血球計數板調節(jié)菌懸液濃度為1.0×108 CFU/mL。

1. 2. 3. 2 尖孢鐮刀菌孢子液制備 刮取PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的病原菌菌絲至PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃下200 r/min培養(yǎng)5 d，用2層紗布過濾去除菌絲，用血球計數板調節(jié)孢子濃度至1×106 CFU/mL，4 ℃下儲存待用。

1. 2. 3. 3 試驗設計 將3～4片葉齡的香蕉苗移栽至以滅菌土與蛭石為基質的花盆中，10 d后選取長勢基本一致的香蕉苗，每盆香蕉苗傷根處理后灌根接種25 mL處理液。陽性對照組1（FOC）：尖孢鐮刀菌孢子懸液;陰性對照組2（CK）：LB液體培養(yǎng)基;處理組1（FOC+拮抗菌）：尖孢鐮刀菌孢子懸液+拮抗菌株發(fā)酵原液;處理組2（拮抗菌）：拮抗菌發(fā)酵原液。7 d后再次向處理組1和處理2灌根等量的拮抗菌發(fā)酵原液。所有處理3次重復。

1. 2. 3. 4 測定項目及方法 接種30 d后，觀察記錄香蕉苗發(fā)病情況。根據香蕉苗球莖縱剖面褐變程度確定病級：0級，球莖縱剖面無褐變出現;1級，球莖縱剖面褐變面積≤25%;3級，25%<球莖縱剖面褐變面積≤50%;5級，50%<球莖縱剖面褐變面積≤75%;7級，球莖縱剖面褐變面積>75%（杜嬋娟等，2020）;計算各組病情指數和防效，發(fā)病指數（%）=∑（各級病株數×相對級數值）/（調查總株數×最高病級數值）×100，防治效果（%）=（CK病情指數-處理病情指數）/ CK病情指數×100。測量各組香蕉苗鮮重，計算拮抗菌株促生效率，促生效率（%）=∑（處理組2各株鮮重-陰性對照組2各株鮮重）/陰性對照組2各株鮮重×100。

2 結果與分析

2. 1 分泌鐵載體細菌分離結果

經CAS培養(yǎng)基初篩，從土壤中初步篩選得到284株菌株，其中60株可在菌落周圍出現橙色暈圈，為可分泌鐵載體菌株（圖1）。再經平板對峙法復篩得到5株對尖孢鐮刀菌具有較強拮抗效果的菌株（表1，圖2），其中Gxun-2的抑菌效果最強，病原菌菌落平均直徑僅為1.95 cm，平均抑菌率達74.45%，故將Gxun-2作為后續(xù)研究目標菌株。

2. 2 菌株Gxun-2的抑菌譜測定結果

由表2可看出，菌株Gxun-2對供試植物病原菌均有一定的抑制效果，其中對小麥平臍蠕孢菌的平均抑菌率最高，為80.96%，顯著高于對其他病原菌的抑菌率（P<0.05）;對香蕉炭疽病菌、假禾谷鐮刀菌、煙草靶斑病菌和蘿卜黑心病原菌的平均抑菌率在70.00%～80.00%，對煙草赤星菌的平均抑菌率為64.85%，表明菌株Gxun-2對尖孢鐮刀菌以外的其他常見植物病原真菌也有較好的抑制效果，具有廣譜抑制作用。

2. 3 菌株Gxun-2對病原菌菌絲生長及形態(tài)的影響

光學顯微鏡下觀察發(fā)現，未處理病原菌菌絲光滑，粗細均勻，生長健壯;而經菌株Gxun-2拮抗的病原菌菌絲多發(fā)生畸變，顏色變暗、變粗，許多菌絲出現斷裂或彎曲打結現象（圖3）。

2. 4 拮抗菌株Gxun-2鑒定

2. 4. 1 菌株形態(tài)學及生理生化特征 菌株Gxun-2在LB培養(yǎng)基上生長狀況良好，菌落呈圓形，表面光滑，邊緣較整齊，能分泌黃綠色色素散發(fā)熒光（圖4-A）。革蘭氏染色結果為陰性菌，菌體形態(tài)呈短桿狀（圖4-B）。生理生化鑒定結果（表3）顯示，菌株Gxun-2在NaCl 含量5.5%以下均可生長，明膠液化、卵磷脂酶、硝酸鹽還原、氧化酶試驗、精氨酸雙水解及葡萄糖利用接觸酶反應為陽性;V-P試驗、木糖利用、MR試驗及硫化氫產生為陰性。

2. 4. 2 菌株Gxun-2 16S rDNA序列測定分析與系統發(fā)育進化樹構建 以菌株Gxun-2基因組為模板，經16S rDNA PCR擴增，其產物測序后得到1438 bp的基因片段。將該擴增序列通過EzBioCloud進行相似性比對，選取15株與Gxun-2同源性較高的菌株序列通過MEGA 6.0構建系統發(fā)育進化樹。結果（圖5）顯示，菌株Gxun-2與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）JCM 5962處于同一分支，最大相似度為100%。結合菌株形態(tài)學特征和生理生化檢測，將菌株Gxun-2鑒定為銅綠假單胞菌。

2. 5 菌株Gxun-2對香蕉枯萎病盆栽防效及對香蕉植株的促生效果

盆栽防效及促生效果試驗結果（圖6和圖7）顯示，陽性對照組1（FOC）香蕉苗球莖縱剖面褐變明顯（圖6-A），發(fā)病率達90.48%，而經菌株Gxun-2處理后處理組1（FOC+Gxun-2）香蕉苗的發(fā)病率為14.29%，防治效果達84.21%;且菌株Gxun-2處理組（Gxun-2）鮮重較對照組2（CK）提高32.96%，說明該菌株對香蕉苗具有較高的防病和促生效果。

3 討論

香蕉枯萎病是一種危害嚴重的真菌土傳病害，目前尚無有效的防治方法。生物防治具有安全、有效、持久等優(yōu)點，成為近年來的研究熱點之一。國內有關利用生防微生物防控香蕉枯萎病的研究已有較多報道，篩選出包括芽孢桿菌（馬鳳娟等，2019;鄧濤等，2020）、放線菌（賴寶春等，2020）和木霉（朱佳芯等，2021）等多種對香蕉枯萎病具有良好拮抗效果的微生物。但在拮抗菌株篩選、菌株拮抗效果及拮抗機理方面仍有待進一步研究。本研究從健康香蕉根際土壤利用CAS平板初篩獲得60株可分泌鐵載體的菌株，再經過平板對峙復篩獲得5株菌株的抑菌率在30.00%以上，其中編號為 Gxun-2菌株的抑菌率可達74.45%，說明根際菌株分泌鐵載體進行拮抗菌初篩的方法可行。鐵載體是部分微生物在缺鐵條件下分泌的一種小分子量（一般<10 kD）的鐵螯合物（Leong，1986），具有極強的螯合Fe3+能力。分泌鐵載體的細菌可通過鐵載體競爭植物根際周圍有限的鐵，使病原菌吸收不到足夠的鐵營養(yǎng)，生長繁殖受到抑制，從而減輕對植物的危害，起到生物防治作用（Masalha et al.，2000）;同時，植物可利用微生物產生的鐵載體螯合的鐵，從而改善植物的鐵營養(yǎng)，對植物生長有一定促生作用（Braud et al.，2009）。

本研究根據菌株Gxun-2形態(tài)特征、生理生化特性及系統發(fā)育進化樹分析，鑒定為銅綠假單胞菌，該菌株除可顯著拮抗尖孢鐮刀菌外，對其他常見植物病原菌也有較強的拮抗效果。銅綠假單胞菌是一種人類和動物的條件性致病菌，具有較強的感染性和耐藥性，常會引起傷口、肺部及尿道感染，是臨床上三大條件性致病細菌之一，具有固有和獲得性的多重耐藥性（Breidenstein et al.，2011;張明亮等，2019）。但近年來分離篩選出一系列具有良好生物防治效果的根際來源銅綠假單胞菌，除分泌鐵載體外（Dharni et al.，2012），還可分泌綠膿菌素、藤黃綠膿菌素、吩嗪化合物、胞外多糖及新型抗生素等多種拮抗植物病原菌的代謝產物（Lee et al.，2013），可對多種植物真菌或細菌起到良好防治作用，稱之為銅綠假單胞菌生防菌株（Tewari? and Arora，2014）。本研究香蕉枯萎病盆栽防效及促生效果試驗結果顯示，菌株Gxun-2具有良好的防病和促生作用，但其具體防病促生機理有待進一步探究。目前，選育的銅綠假單胞菌生防菌株在生物防治上的應用仍局限于活菌防治，但由于銅綠假單胞菌無法產生芽孢，常出現生物活菌制劑不穩(wěn)定、貨架期短、有效定殖能力差及田間防治效果不穩(wěn)定等問題（蔣海霞等，2015）。雖然從植物根際環(huán)境中分離出的銅綠假單胞菌與臨床分離出的菌株相比致病性較低，但仍不能排除對人體產生毒性的可能性，應注意使用活菌對環(huán)境安全性的影響（Wu et al.，2011）。因此，理想的選擇是利用銅綠假單胞菌的工程菌或分泌的代謝產物作為微生物源農藥進行病害防治。通過基因組學和代謝工程的方法，對具有生防功能的銅綠假單胞菌菌株中的致病相關基因敲除，降低其致病性和細胞毒性;或通過基因工程和代謝工程改造，異源表達銅綠假單胞菌相關活性成分的基因或基因簇，提高抑菌代謝產物的發(fā)酵效價，可為微生物農藥產業(yè)化生產提供安全保障。

4 結論

利用CAS平板篩選具有分泌鐵載體能力菌株的方法可高效篩選出拮抗香蕉枯萎病病原菌菌株;篩選出的菌株Gxun-2具有較強的防病促生效果，可作為研制香蕉枯萎病生防菌劑的候選菌株資源。

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（責任編輯 麻小燕）