鐘迪穎，武治興，劉 陽(yáng)，楊曉月，張有林

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；2.榆林市科技發(fā)展服務(wù)中心，陜西 榆林 719000）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是多年生優(yōu)質(zhì)豆科飼草作物，原產(chǎn)于亞洲，如今廣泛種植于世界各地，種植面積居世界第一，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好和適用性廣等優(yōu)良特性，被譽(yù)為“牧草之王”[1-4]，在中國(guó)西部、中部和華北地區(qū)大面積種植[5]，資源豐富。紫花苜?；ǘ渲懈缓ㄉ?。花色苷是花青素和糖以糖苷鍵連接而成的化合物[6]，主要存在于植物的果實(shí)、花朵、莖和葉等部位[7]，可賦予植物紅色、紫色和藍(lán)色等絢麗的顏色[8]，是一種天然的水溶性色素[9]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)花色苷進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化和抗炎等保健功能[10-11]，但關(guān)于紫花苜?；ǘ渲谢ㄉ盏难芯可跎賉12]。據(jù)報(bào)道溫度和光照等條件影響花色苷穩(wěn)定性[13-14]，造成花色苷應(yīng)用的局限性[15]。微膠囊化是一種將活性成分包埋在特定壁材中的技術(shù)[16]，可以提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)物質(zhì)的保存期[17]，隨著科學(xué)水平的進(jìn)步，目前微膠囊化技術(shù)已成為21 世紀(jì)的重點(diǎn)高新技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等多個(gè)領(lǐng)域[18]。為此，采用超聲輔助乙醇提取法對(duì)紫花苜?；ǘ渲械幕ㄉ者M(jìn)行提取，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝對(duì)花色苷進(jìn)行微膠囊化處理，以提高紫花苜?；ǘ渲谢ㄉ盏姆€(wěn)定性和貯藏性，為提高紫花苜蓿利用率和開(kāi)發(fā)新型食品著色劑提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 紫花苜?；ǘ渲谢ㄉ仗崛?/h3>

采摘新鮮紫花苜蓿花，去梗，于?60 ℃下真空冷凍干燥32 h，粉碎過(guò)0.425 mm 篩，制得紫花苜?；ǚ勰?，置于?18 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

準(zhǔn)確稱取紫花苜?；ǚ勰?，按一定液料比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間，在超聲功率為250 W條件下進(jìn)行超聲輔助提取，用濃度為0.1%的鹽酸調(diào)節(jié)pH 至1.5，提取液冷卻后在4 ℃低溫8 000 r·min?1高速離心10 min 后取上清液，真空抽濾后得紫花苜?；ǘ渲谢ㄉ沾痔嵛?，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，預(yù)凍24 h 后于?60 ℃條件下真空冷凍干燥得紫花苜?；ㄉ铡?/p>

1.2 花色苷含量的測(cè)量方法

參照Urszula 等[19]和宋德群等[20]的方法，以花色苷粗提物為樣品計(jì)算花粉末中花色苷的含量，分別 取1.0 mL 樣品加入9.0 mL 的0.025 mol·L?1的氯化鉀緩沖液(pH 1.0)和0.4 mol·L?1的乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)，振蕩搖勻，室溫條件下避光放置30 min，以蒸餾水為空白對(duì)照，在520 和700 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

式中：A=A1?A2(A1和A2分別為pH 1.0 和4.5 時(shí)，樣品在520 與700 nm 處的吸光度的差值)；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子量(449.2 g·mol?1)；D為樣品的稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積(mL)；ε為矢車菊3-葡萄糖苷的消光系數(shù)26 900 L·(cm·mg)?1；m為紫花苜蓿花粉末質(zhì)量(g)；L為光程(cm)。

1.3 花色苷提取單因素試驗(yàn)

液料比：準(zhǔn)確稱量100 mg 紫花苜?；ǚ勰蕴崛?0% (V : V)乙醇，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為30 min，分別研究液料比為20、25、30、35 和40 mL·g?1對(duì)花色苷提取的影響。

乙醇濃度：準(zhǔn)確稱量100 mg 紫花苜蓿花粉末，液料比20 mL·g?1，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間30 min，分別研究乙醇濃度為40%、50%、60%、70% 和80%對(duì)花色苷提取的影響。

提取溫度：準(zhǔn)確稱量100 mg 紫花苜?；ǚ勰毫媳?0 mL·g?1，乙醇濃度60%，提取時(shí)間30 min，分別研究提取溫度為55、60、65、70 和75 ℃對(duì)花色苷提取的影響。

提取時(shí)間：準(zhǔn)確稱量100 mg 紫花苜?；ǚ勰?，液料比20 mL·g?1，乙醇濃度60%，提取溫度60 ℃，分別研究提取時(shí)間為15、20、25、30 和35 min 對(duì)花色苷提取的影響。

花色苷響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)：利用Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以乙醇為提取劑，在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇液料比、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行4 因素3 水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1 Response surface optimization design factors and levels

1.4 紫花苜?；ㄉ瘴⒛z囊化試驗(yàn)

微膠囊的制備：參照Cai 等[21]的方法。1) 壁材制備。第1 組：麥芽糊精(M)與黃原膠(H)按10 ? 1、20 ? 1 和30 ? 1 (w : w)進(jìn)行配比；第2 組：麥芽糊精(M)與阿拉伯膠(A) 按10 ?1、20 ? 1 和30 ?1(w:w)進(jìn)行配比，用蒸餾水制成膠體溶液，固體含量為5%(w : w)，在4 ℃充分水合24 h。2) 花色苷制備。將紫花苜?；ǚ勰┌?.3 中得到紫花苜蓿花朵中花色苷最佳提取工藝條件進(jìn)行超聲波輔助乙醇提取，得到花色苷粗提液，低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，預(yù)凍24 h 后于?60 ℃條件下真空冷凍干燥，得紫花苜?；ㄉ?。3) 微膠囊制備。準(zhǔn)確稱取100 mg 紫花苜?；ㄉ眨覝叵氯苡?.0 mL 蒸餾水中，加入8.0 mL 充分水合的壁材膠體溶液，在旋渦混合器3 000 r·min?1條件下充分混合5 min，之后轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿預(yù)凍后冷凍干燥。制備的花色苷微膠囊分別命名為M/A(10/1)-ANS、M/A(20/1)-ANS 、M/A(30/1)-ANS、M/H(10/1)-ANS、M/H(20/1)-ANS 和M/H(30/1)-ANS?？瞻孜⒛z囊作對(duì)照，為M-ANS。

微膠囊包埋率測(cè)定：參照Sahar 等[22]的方法。1) 總花色苷含量(TAC)測(cè)定：準(zhǔn)確稱量100 mg 包埋樣品，加入1.0 mL 蒸餾水，在旋渦混合器中充分混合1 min，放入超聲清洗機(jī)內(nèi)水浴20 min，加入10.0 mL乙醇，提取5 min 后過(guò)濾。2) 表面花色苷含量(SAC)測(cè)定：準(zhǔn)確稱量100 mg 包埋樣品，與10.0 mL 乙醇混合，在旋渦混合器中混合10 s，在3 000 r·min?1離心3 min 后取上清液。

掃描電子顯微鏡(SEM)觀察：參考Amr 等[23]的方法。將樣品均勻平鋪于金屬載物臺(tái)，噴金處理60 s，共3 次，用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察并拍攝微觀結(jié)構(gòu)。

色差測(cè)定：用色差儀測(cè)量樣品的亮度(L)、紅綠度(a*)和黃藍(lán)度(b*)，根據(jù)公式計(jì)算其色度(c)和色相角(h°)[21]。

熱穩(wěn)定性測(cè)定：在50 mL·min?1的氮吹掃流下，以10 ℃·min?1的溫度上升速率在30～300 °C 范圍內(nèi)掃描約5 mg 樣品。

X-射線衍射分析：參照Z(yǔ)hou 等[24]的方法。通過(guò)X-射線衍射儀對(duì)樣品進(jìn)行X-射線衍射(XRD)成像。以0.4 λ·min?1的掃描速度測(cè)試樣品，記錄2θ 在5°～70°的衍射圖像。

貯藏特性：將包埋的微膠囊樣品分別置于37 和5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，每隔14 d 取樣，測(cè)定花色苷含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用OriginPro 軟件處理，響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 軟件處理，SPSS 軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

花色苷含量隨液料比的增加呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，在液料比為30 mL·g?1時(shí)達(dá)到最大，可能是在適當(dāng)?shù)囊毫媳葪l件下，提取劑用量的增加使花色苷與提取劑接觸面積增大[25]，促進(jìn)花色苷的溶出，而當(dāng)提取劑用量增加過(guò)多，花色苷溶出量已達(dá)最大值，同時(shí)導(dǎo)致糖類和脂類物質(zhì)溶出[26]，液料比以30 mL·g?1為宜?；ㄉ蘸侩S乙醇濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在乙醇濃度為60%時(shí)達(dá)到最大?？赡苁窃诘蜐舛葪l件下，乙醇濃度的增加使環(huán)境的滲透壓增大，從而促進(jìn)花色苷的滲出，而當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，導(dǎo)致溶液的極性過(guò)低，不利于花色苷的溶出[27]，乙醇濃度以60%為宜?；ㄉ蘸侩S提取溫度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在提取溫度為65 ℃時(shí)達(dá)到最大，可能是在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下，細(xì)胞內(nèi)的花色苷易溶出，溫度過(guò)高時(shí)，破壞了花色苷的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致花色苷的提取量降低，提取溫度以65 ℃為宜?；ㄉ蘸侩S提取時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為25 min 達(dá)到最大，可能是在適當(dāng)?shù)奶崛r(shí)間內(nèi)，提取時(shí)間的增加使溶出的花色苷積累更多，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，部分花色苷被氧化、降解，從而導(dǎo)致花色苷的提取量降低，提取時(shí)間以25 min 為宜(圖1)。

圖1 不同液料比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)紫花苜蓿花粉末花色苷提取效果的影響Figure 1 Effects of different liquid-to-material ratios, concentration of ethanol, and extraction temperature and time on extracting anthocyanins from alfalfa flower powder

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行BBD 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)。回歸擬合后得到花色苷含量(Y)的二次多項(xiàng)回歸模型Y=1.58 + 6.083 × 10?3A+7.833 × 10?3B+ 4.667 × 10?3C+ 1.917 × 10?3D+ 0.030AB?3× 10?3AC? 0.013AD+ 3.5× 10?3BC? 0.018BD+0.011CD? 0.023A2? 0.007 7B2? 0.057C2? 0.015D2。

表2 BBD 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 BBD response surface optimization design parameters and results

該回歸模型P< 0.001，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著。R2= 0.990 3，RAdj2= 0.980 5，說(shuō)明該回歸模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好，可用于紫花苜?；ǚ勰┗ㄉ蘸康姆治?。該模型Y中A、B、AB、AD、BD、CD、A2、B2、C2和D2對(duì)結(jié)果影響極顯著，C對(duì)結(jié)果影響顯著(表3)。

各響應(yīng)面曲線走勢(shì)越陡，說(shuō)明液料比、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取花色苷影響越顯著[28]?？梢钥闯觯绊懽饔帽憩F(xiàn)為乙醇濃度 > 液料比 > 提取溫度 > 提取時(shí)間(表3、圖2)。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面分析圖Figure 2 Response surface evaluations of the interactions among these factors

表3 紫花苜?；ǚ勰┲谢ㄉ崛×糠讲罘治鯰able 3 Analysis of the extraction values for anthocyanins from alfalfa petal powder

2.3 最佳提取條件優(yōu)化

紫花苜蓿花粉末中花色苷最佳提取工藝條件為液料比31.11 mL·g?1、乙醇濃度60.53%、提取溫度65.15 ℃、提取時(shí)間24.56 min?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將以上工藝條件調(diào)整為液料比31 mL·g?1、乙醇濃度61%、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間25 min。在此條件下又進(jìn)行了3 組平行試驗(yàn)，得出紫花苜?；ǚ勰┲谢ㄉ蘸繛?.581 mg·g?1，該實(shí)際值與理論值接近且穩(wěn)定，獲得的最佳工藝條件可靠。

2.4 紫花苜?；ㄉ瘴⒛z囊化

2.4.1 紫花苜?；ㄉ瘴⒛z囊包埋率與色差分析

加入水膠體的微膠囊包埋率均高于空白對(duì)照，原因是加入水膠體改變了淀粉特性，增大了壁材粘度，使之帶來(lái)更好的封裝效率與致密性，但粘度達(dá)到一定程度再增加粘度對(duì)包埋影響不大。與單一材料相比復(fù)合材料更能提高微膠囊的穩(wěn)定性，包埋效果最好的是M/H(30/1)-ANS，包埋率達(dá)到98.37% (表4)。

表4 不同壁材的花色苷微膠囊包埋率及色差分析Table 4 Analysis of encapsulation efficiency and color differences in anthocyanin microcapsules produced using different wall materials

加入水膠體的花色苷微膠囊亮度均高于空白對(duì)照。不同壁材的紫花苜蓿花色苷微膠囊均為紅色。

2.4.2 紫花苜蓿花色苷微膠囊SEM 圖像分析

不同壁材的紫花苜?；ㄉ瘴⒛z囊均呈多孔狀結(jié)構(gòu)，這是冷凍干燥過(guò)程中水分升華引起的收縮力不均勻造成的(圖3)。從微膠囊的表面形態(tài)來(lái)看，M/H(30/1)-ANS 和M/A(30/1)-ANS 的表面較M-ANS光滑，進(jìn)一步證實(shí)了水膠體的加入可提高微膠囊的封裝效率[29]。

圖3 紫花苜?；ㄉ詹煌诓奈⒛z囊微觀形態(tài)Figure 3 Morphology of various alfalfa anthocyanin microcapsules produced using different wall materials

2.4.3 紫花苜?；ㄉ瘴⒛z囊熱穩(wěn)定性及X-射線衍射分析

采用熱重分析儀對(duì)幾種不同壁材的微膠囊進(jìn)行熱重測(cè)定。麥芽糊精與黃原膠和阿拉伯膠相互作用影響了紫花苜?；ㄉ瘴⒛z囊的熱穩(wěn)定性。包埋的微膠囊受熱后重量損失較小，熱穩(wěn)定性較好(圖4)?；ㄉ盏淖畲笫е匕l(fā)生在115 ℃，這可能是由于花色苷的脫糖反應(yīng)與開(kāi)環(huán)反應(yīng)使其降解成了酚酸和醛[30]。含有花色苷的微膠囊的最大失重在225 ℃，這可能是花色苷中糖環(huán)發(fā)生了脫水反應(yīng)及CO2流失所致[31]。

一般晶體材料的衍射圖呈尖峰，非晶體材料的衍射圖呈寬峰[32]。M-ANS、M/A-ANS 和M/H-ANS的微膠囊衍射峰都呈寬峰狀，且衍射圖基本相同，表明結(jié)晶度較低，均為非晶結(jié)構(gòu)(圖4)。微膠囊的結(jié)晶度與流動(dòng)性和吸濕性有關(guān)，結(jié)晶度越高則吸濕性越差，Diego 等[33]研究表明，非晶體結(jié)構(gòu)材料的吸濕性要強(qiáng)于晶體材料。本研究表明，紫花苜?；ㄉ瘴⒛z囊后吸濕性提高。

圖4 不同壁材微膠囊熱重變化及X-射線衍射圖Figure 4 Thermogravimetry and X-ray diffraction of microcapsules produced using different wall materials

2.4.4 紫花苜?；ㄉ瘴⒛z囊貯藏特性

所有花色苷微膠囊在 5 ℃的穩(wěn)定性均比37 ℃的穩(wěn)定性高，添加了黃原膠與阿拉伯膠的微膠囊比未添加水膠體的空白微膠囊穩(wěn)定性更好，水膠體的添加比例對(duì)微膠囊的貯藏效果無(wú)影響。在5 和37 ℃條件下，紫花苜?；ㄉ战?jīng)微膠囊化后的貯藏穩(wěn)定性均優(yōu)于未經(jīng)微膠囊化的花色苷。綜合分析，貯藏效果最好的是M/H(30/1)-ANS，其在5 ℃下貯藏28 d花色苷保留率達(dá)97.67% (圖5)。

圖5 紫花苜蓿花色苷不同壁材微膠囊的貯藏特性Figure 5 Storage characteristics of Medicago sativa anthocyanin microcapsules produced using different wall materials

3 討論與結(jié)論

紫花苜蓿富含各種生物活性物質(zhì)，花色苷的提取工藝研究已有文獻(xiàn)報(bào)道。許英一等[12]用正交試驗(yàn)法研究了紫花苜?；ㄉ盏奶崛」に?，在料液比為30 g·mL?1，提取溫度為60 ℃，超聲時(shí)間為10 min，提取的總花色苷含量為93.23 mg·(100 g)?1。但上述工藝的提取量低于本研究的1.581 mg·g?1，可見(jiàn)該工藝具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。Box-Behnken 試驗(yàn)法相較于正交試驗(yàn)法，不僅能得到各因素與響應(yīng)值的明確的函數(shù)關(guān)系式，而且能全面反映各因素之間的交互作用，確定各因素對(duì)響應(yīng)值的影響順序[34]。本研究中影響紫花苜?；ǘ渲谢ㄉ仗崛『康囊蛩乇憩F(xiàn)為乙醇濃度 > 液料比 > 提取溫度 > 提取時(shí)間。

微膠囊化是一種將活性物質(zhì)包埋嵌入包埋材料中，形成具有致密物理屏障的微小顆粒的技術(shù)，其中被包埋的活性物質(zhì)稱為芯材，包埋在外部的包埋材料稱為壁材。麥芽糊精是一種易溶解的淀粉水解物，粘度低，可以保持花色苷分子的穩(wěn)定性，因而被廣泛用作包埋材料。根據(jù)水解程度的不同可得到不同分子量的麥芽糊精，其中，葡萄糖當(dāng)量(DE)在10～20 的麥芽糊精最常用于花色苷的包埋[16,35]。目前，麥芽糊精、阿拉伯膠等水溶性小分子化合物已成功地用作包埋花青素提取物的壁材[36-37]，且大量研究證明，麥芽糊精與水膠體組合可以提高微膠囊的包埋效率[22,38-39]。黃原膠具有耐高溫、耐酸堿、性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是一種良好的包裝材料。阿拉伯膠具有良好的成膜性和乳化性，可以保護(hù)花色苷不被氧化。Ewelina 等[40]以麥芽糊精和阿拉伯膠等水膠體為包埋壁材，對(duì)野櫻桃中的花色苷進(jìn)行微膠囊化，結(jié)果表明采用復(fù)合包埋壁材的花色苷微膠囊包埋效果好，微膠囊化是保持花色苷等敏感化合物穩(wěn)定性的有效方法。Cai 等[21]以不同配比的羧甲基淀粉和黃原膠為包埋壁材，對(duì)藍(lán)莓花色苷進(jìn)行微膠囊化，結(jié)果表明藍(lán)莓花色苷微膠囊均具有較高的包埋率，且微膠囊化后的藍(lán)莓花色苷穩(wěn)定性提高。Kanha等[41]采用噴霧 + 冷凍干燥復(fù)合方式，以兩種不同的親水膠體(明膠-阿拉伯膠和殼聚糖-羧甲基纖維素)為壁材制備黑米花色苷提取物的微膠囊，結(jié)果表明：采用明膠-阿拉伯膠和殼聚糖-羧甲基纖維素制備的微膠囊包埋率分別為84.9% 和94.7%，且具有良好的緩釋作用。Ban 等[32]以殼聚糖和羧甲基纖維素為壁材，采用真空冷凍干燥法包埋生姜精油，結(jié)果表明制備的微膠囊具有較好的微觀結(jié)構(gòu)和包埋率，能保持較高的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。微膠囊制備的常用方法有噴霧干燥法和冷凍干燥法，噴霧干燥具備快速、靈活、低成本等優(yōu)點(diǎn)，但其進(jìn)出風(fēng)口的高溫易破壞熱敏類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，而真空冷凍干燥方式由于其干燥過(guò)程中隔絕氧氣、低溫等特點(diǎn)，更有利于熱敏物質(zhì)的結(jié)構(gòu)保留[42]。本研究采用真空冷凍干燥方式制備的紫花苜?；ㄉ瘴⒛z囊，微膠囊包埋率高且貯藏效果較好。

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken 組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面法對(duì)紫花苜?；ǘ浞勰┲谢ㄉ仗崛l件進(jìn)行優(yōu)化，得出花色苷最佳提取工藝條件為：液料比31 mL·g?1、乙醇濃度61%、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間25 min、超聲功率250 W。在此條件下花色苷提取量為1.581 mg·g?1。以麥芽糊精、黃原膠和阿拉伯膠作為壁材，采用冷凍干燥方式對(duì)紫花苜?；ㄉ者M(jìn)行微膠囊化，不同壁材的包埋率差異顯著，其中最優(yōu)的壁材為麥芽糊精 ? 黃原膠=30 ? 1 (w : w)，包埋率可達(dá)到98.37%。微膠囊化的紫花苜?；ㄉ毡任次⒛z囊化的穩(wěn)定性好，加入膠體的壁材比只用麥芽糊精作為壁材包埋效果及貯藏特性更優(yōu)，微膠囊化為擴(kuò)大紫花苜?；ǘ渲谢ㄉ盏膽?yīng)用提供了方法。