吳聰敏, 馬蘭, 吳永紅, 俞元春*

(1.南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院， 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 南京 210037；2.中國科學(xué)院南京土壤研究所， 南京 210008)

生長素又叫吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，是最早發(fā)現(xiàn)的在自然界中普遍存在的一類植物激素[7]。IAA作用機理分為兩方面，一是使細(xì)胞壁軟化、松弛，增加細(xì)胞的滲透性和可塑性，進而促進細(xì)胞伸長；二是促進蛋白質(zhì)和RNA合成，增加原生質(zhì)體含量，促進細(xì)胞生長[8]。IAA具有多方面的生理效應(yīng)，也具有“雙重作用”，即低濃度促進生長，高濃度抑制生長[9]，可用于植物修復(fù)技術(shù)[10]。有研究報道，植物和微生物均可產(chǎn)生IAA，如藤黃微球菌[11]、馬鈴薯根際細(xì)菌[12]。IAA可以影響多種微生物的基因表達[13]，也是微生物與植物相互作用中的一種信號分子。Sun等[14]將IAA施加于食蟲草后發(fā)現(xiàn)，IAA是決定同一生態(tài)位真菌種間競爭的主要因素；外源生長素還能促進寄主的病原菌易感性和疾病癥狀發(fā)展[15]。

周叢生物以往都是通過自然形成過程和人工采集方式來富集與培養(yǎng)的，但無法滿足生態(tài)工程需要。目前已形成較成熟的方法，采用纖維材料富集并使用WC(woods hole culture )培養(yǎng)液作為室內(nèi)培養(yǎng)基對周叢生物進行擴大培養(yǎng)，但由于載體培育出的周叢生物存在生物量小、群落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等弊端，在工業(yè)生產(chǎn)等大規(guī)模應(yīng)用中仍具有一定差距。Biology生態(tài)測試板是一種常用的可表征群落生理特征的方法[16]。目前通過生態(tài)板來分析IAA對周叢生物微生物群落影響的研究較少。本研究利用Biology生態(tài)板分析了不同濃度IAA處理對周叢生物微生物群落的代謝功能的影響，探討了其碳源利用特性，旨在為周叢生物的富集與擴大提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 周叢生物的培育

試驗選用南京市玄武湖的水源，按照試驗用水與WC培養(yǎng)液體積比為1 000∶11來配置人工廢水培養(yǎng)試驗所需的周叢生物。試驗用水的pH為7.9±0.03，全氮為(1.180±0.02) mg·L-1，NO3--N為(0.670±0.02)mg·L-1，NH4+-N為(0.510±0.01) mg·L-1，全磷為(0.120±0.01) mg·L-1，TDP為(0.035±0.001)mg·L-1。采用長5 cm、寬2 cm的工業(yè)彈性材料作為周叢生物的富集載體，加入上述比例配置的人工廢水，將其置于恒溫培養(yǎng)室培養(yǎng)，期間保持2 500 lx的光照強度，28 ℃溫度和12 h/12 h的光暗比。定期觀察周叢生物的生長狀況，培養(yǎng)20 d后，載體表面出現(xiàn)一層墨綠色粘稠物質(zhì)，此時周叢生物生長成熟，可進行試驗。

1.2 試驗設(shè)計

將培育好的周叢生物從載體上取下，配置濃度梯度分別為0(CK)、5、10、25、50、100 mg·L-1的吲哚乙酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，上海)。每個濃度梯度設(shè)置3個平行，先分別向150 mL的錐形瓶中加入1 g含水量為92%～97%的周叢生物(采用烘干法，根據(jù)烘干前后周叢生物的質(zhì)量確定其含水量)，再加入100 mL不同濃度梯度的吲哚乙酸。以對照組為標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)節(jié)溶液的pH。培養(yǎng)室條件：光照強度為2 500～3 000 lx，溫度為(28±1) ℃，光暗比為12 h/12 h。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1周叢生物微生物碳源代謝能力的測定

試驗采用含有31種碳源(包含10種糖類、7種羧酸、6種氨基酸、4種多聚物、2種酚酸和2種胺類)的Biology生態(tài)測試板來分析周叢生物的微生物群落代謝特征[16]。微生物作用于底物發(fā)生氧化還原電位使四氮唑藍(lán)發(fā)生氧化還原進行染色，進而對其進行定性和定量檢測。

1.3.2生態(tài)測試板接種液的配制 在超凈工作臺中，稱取1 g周叢生物置于150 mL無菌錐形瓶中，加入27 mL 0.85%已滅菌的NaCl溶液和滅菌的玻璃珠，封口后，振蕩30 min。靜置5 min后取5 mL懸液于25 mL V型槽中，再加入20 mL已滅菌的0.85% NaCl，混勻。最后使用移液槍將上述溶液加到每個孔中，每孔150 μL。將接種好的微孔板放在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72、96、120、144、168 h在ELXS08-Biology微孔板讀數(shù)儀(BIO-TEK Instruments INC，USA)上測定590 nm波長下的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每組試驗均設(shè)有3個平行。使用Excel 2013和Origin 2018軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、繪圖；使用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)的差異性。

Biology分析中平均每孔顏色變化率(average well color development，AWCD)與多樣性指數(shù)[17]的計算方法如下。

AWCD=∑ (Ci-R)/n

(1)

式中，Ci為第i個碳源孔在590 nm波長下的吸光值；R為對照孔的吸光值；n為碳源數(shù)(本研究中為31)。

Shannon多樣性指數(shù)(H)[18]可以表征微生物群落的豐富度，其計算公式如下。

H=-∑(Pi×lnPi)

(2)

Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)

(3)

式中，Pi代表第i個碳源孔吸光度值的相對比值；Ci為第i個碳源孔的吸光值；R為對照孔的吸光度值。

Simpson多樣性指數(shù)(D)[18]可以反映微生物群落的優(yōu)勢物種，其計算公式如下。

D=1-∑(Pi)2

(4)

Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)

(5)

式中，Pi代表第i個碳源孔吸光度值的相對比值；Ci為第i個碳源孔的吸光值；R為對照孔的吸光度值。

Mclntosh指數(shù)(U)[18]用于評估微生物群落的物種相似性與均一性，其計算公式如下。

U=∑(ni)2

(6)

ni=Ci-R

(7)

式中，ni表示第i個碳源孔的相對吸光值；Ci為第i個碳源孔的吸光值；R為對照孔的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度IAA對周叢生物碳代謝活性的影響

施加不同濃度IAA后，周叢生物的平均每孔顏色變化率(AWCD)隨時間的變化如圖1所示。培養(yǎng)起始的24～96 h內(nèi)，AWCD快速增長，此時周叢生物微生物碳代謝旺盛；96 h后，各處理的AWCD增長速率逐漸降低，進入平穩(wěn)期。不同處理下周叢生物的AWCD均呈現(xiàn)出隨時間增加而升高的趨勢。試驗開始后，5、10 mg·L-1低濃度IAA處理下周叢生物的AWCD均低于對照組。培養(yǎng)到72 h后，在不同濃度IAA處理下AWCD之間的差異開始呈現(xiàn)顯著性(P<0.05)。96 h時，25、50、100 mg·L-1高濃度IAA處理組的周叢生物AWCD顯著高于低濃度處理組的AWCD(P<0.05)。

2.2 不同濃度IAA下周叢生物對不同碳源的代謝能力

由圖2可知，在試驗96 h時，施加不同濃度IAA處理下周叢生物微生物群落對不同碳源的代謝能力存在差異。50 mg·L-1IAA處理組周叢生物微生物對多聚物的利用能力最高，為1.57，較對照組增加了3.29%。對照組中微生物對多聚物和氨基酸的利用能力較高，分別為1.52和1.26。25、50、100 mg·L-1高濃度IAA處理組可以提高微生物對不同碳源的利用能力和代謝能力，其對酚酸、碳水化合物、胺類的利用能力較對照組較高，而低濃度IAA作用后微生物對羧酸、碳水化合物的利用率與對照相比有所降低。不同處理對酚酸和胺類的利用率之間均無顯著性差異。

2.3 不同濃度IAA對微生物碳代謝多樣性的影響

由表1可以看出，96 h時5 mg·L-1低濃度IAA處理組周叢生物微生物群落的Shannon指數(shù)(H)和McIntosh指數(shù)(U)明顯低于對照組(P<0.05)，而高濃度處理組的Shannon指數(shù)(H)和Simpson指數(shù)(D)與對照組相比差異性并不明顯。3種代謝多樣性指數(shù)表明，不同處理下微生物群落之間存在差異，但其優(yōu)勢物種相似。

表1 96 h時周叢微生物碳代謝多樣性Table 1 Microbial carbon metabolism diversity of periphytic biofilms at 96 h

3 討論

平均每孔顏色變化率(AWCD)可用于表示周叢生物微生物群落對不同碳源的利用能力[19]，其值越高表示微生物對碳源的利用率越高，代謝活性也越強[2]。本研究結(jié)果表明，不同濃度IAA處理下，周叢生物的活性隨著時間的增加而升高。在試驗的前24 h內(nèi)，各濃度IAA處理下微生物對單一碳源的利用程度較低。在培養(yǎng)的24～96 h之間，微生物群落對碳源的利用率顯著增加(P<0.05)，且以100 mg·L-1處理下碳源利用率最高，之后緩慢增加，逐漸趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)72 h后，高濃度處理組的AWCD高于對照組，對照組周叢生物AWCD顯著高于5、10 mg·L-1低濃度處理組(P<0.05)，表明高濃度IAA處理后周叢生物微生物對碳源的利用率明顯提高，微生物的豐度也相對更高。這與Wang等[20]的研究結(jié)果一致，隨著IAA濃度的升高，變形桿菌門和嗜鉻菌門繁殖速度加快，其相對豐度也明顯增加。Peng等[21]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度(50 mg·L-1)IAA處理與對照組相比，微藻的生長增加了30%。

本研究選取96 h的吸光值來評估周叢生物對不同碳源的利用情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同處理下周叢生物微生物群落對不同碳源的利用程度表現(xiàn)不同，但其中多聚物是周叢生物代謝利用率最高的碳源?？傮w來看，高濃度處理組周叢生物中微生物群落與對照組相比具有更強的碳源利用能力，而低濃度處理組中微生物的碳源利用能力與對照組相比較弱。這與AWCD變化趨勢相一致，表明施加IAA后能改變周叢生物的微生物群落結(jié)構(gòu)。不同濃度的IAA對微生物的作用因物種而異，而周叢生物作為一個復(fù)雜的微生物聚集體，IAA對其影響應(yīng)取決于所有微生物的綜合作用。

本研究采用96 h的Biology生態(tài)測試板測得的AWCD來計算Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)，真實地反映了周叢生物微生物群落功能多樣性的不同側(cè)面。除了Simpson指數(shù)以外，剩余兩個指標(biāo)存在顯著差異(P<0.05)，說明不同處理后微生物群落具有相似的優(yōu)勢物種。高濃度IAA處理后周叢生物的碳代謝多樣性大于等于對照組，而低濃度處理組周叢生物的碳代謝多樣性低于對照組，說明施加吲哚乙酸后會引起周叢生物自身組成發(fā)生變化，導(dǎo)致其物種多樣性也發(fā)生變化。高濃度IAA處理能增加周叢生物微生物的多樣性，可能是因為周叢生物中存在一些異養(yǎng)微生物，如鮑曼不動桿菌[22]、假單胞菌屬[23]等，可以有效利用IAA作為碳源和營養(yǎng)來源，誘導(dǎo)其基因表達，當(dāng)施加高濃度IAA時，可提供較多的碳源，增加微生物的多樣性。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度IAA可刺激周叢生物的生長，周叢生物可通過抗氧化酶激活、群落結(jié)構(gòu)優(yōu)化和碳代謝模式變化來適應(yīng)不同濃度的IAA。

在本研究中，高濃度IAA處理可以提高周叢生物微生物的碳源代謝和利用能力，為周叢生物的富集與擴大培養(yǎng)提供了思路和途徑，但本研究未評估周叢生物的群落結(jié)構(gòu)，需要進一步研究認(rèn)識這種變化機制。