孫 博，孫 宇，車姣子，李雪飛，陸 潔，段昕所*

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000； 2.承德市中心醫(yī)院）

黑素瘤是由正常黑素細(xì)胞或神經(jīng)嵴細(xì)胞癌化后的黑素細(xì)胞導(dǎo)致的惡性腫瘤[1]，具有惡性程度高、易轉(zhuǎn)移的特點。世界范圍內(nèi)，每年大約有9000例患者死于黑素瘤，在皮膚腫瘤死亡患者中約占60%～80%，我國每年新發(fā)病例約2萬多例，美國疾控中心預(yù)測黑素瘤患者的數(shù)量在未來15年內(nèi)還會增加[2-4]。抑制并逃避機體免疫系統(tǒng)而得以生存與黑素瘤細(xì)胞自身存活密切相關(guān)，目前已知黑素瘤細(xì)胞可以通過自分泌—旁分泌等途徑分泌IL-10、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等免疫抑制因子來逃避免疫監(jiān)視，逃避機體免疫系統(tǒng)的識別與攻擊，為腫瘤的發(fā)生及發(fā)展創(chuàng)造有利的微環(huán)境[5]。靈芝多糖是一種從靈芝子實體中被提取出來的多糖組份，已有研究表明，靈芝多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能以及一定的抗腫瘤等作用[6]。靈芝多糖如何抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸仍是目前研究的熱點內(nèi)容。本研究通過探討靈芝多糖對B16F10黑素瘤細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的影響，進(jìn)一步明確黑素瘤發(fā)生發(fā)展機制，為黑素瘤治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與試劑

靈芝多糖為福州綠谷生物藥業(yè)技術(shù)研究所分離提取，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系林志彬教授惠贈。B16F10黑素瘤細(xì)胞株（協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫），胎牛血清（FBS，天津血液學(xué)研究所），IL-10一抗、β-actin一抗（美國Santa Cruz公司），Western-blot二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），RPMI-1640、Trizo（美國Invitrogen公司），AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒引物由上海生工生物公司設(shè)計合成。

1.2 方法

1.2.1 B16F10黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng) 在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，將B16F10黑素瘤細(xì)胞（2×105個/孔）置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基的6孔板內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)4h貼壁后，實驗組分別加入不同濃度的靈芝多糖（0.2μg /mL，0.8μg /mL，3.2μg/mL，12.8μg /mL），對照組RPMI-1640培養(yǎng)基不加靈芝多糖，繼續(xù)培養(yǎng)48h，用于下列實驗。

1.2.2 Western blot法 收集不同濃度靈芝多糖作用48h的細(xì)胞，采用BCA法提取蛋白并定量。采用SDS-PAGE凝膠電泳（50μg），轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂牛奶封閉2h，加1：100:稀釋的IL-10一抗、1：1000稀釋的β-actin一抗，4℃孵育過夜；TBST洗3次，每次10min，1：1000稀釋的IL-10二抗、1：2000稀釋的β-actin二抗室溫孵育2h；TBST洗3次，每次5min，洗滌后于凝膠成像分析系統(tǒng)中滴加ECL發(fā)光液，采集圖像，測定條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.3 RT-PCR方法 按Trizol試劑說明書提取組織總RNA。分光光度計檢測RNA濃度及純度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對其檢測。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、PCR反應(yīng)及操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。引物序列：內(nèi)對照小鼠β-actin上游引物5'GGTACCACCATGTACCCAGG3′，下游引物5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3′；IL-10上游引物5'CGGGAAGACAATAACTG3'，下游引物5'CATTTCCGATAAGGCTTGG3'。β-actin反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5min，變性95℃、退火60℃各45s，延伸72℃ 30s，重復(fù)30次，最后延伸72℃ 10min。IL-10反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5min，變性95℃、退火55℃各45s，延伸72℃ 30s，重復(fù)35次，最后延伸72℃ 10min。將產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)采圖，進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Western-blot法檢測B16F10黑素瘤細(xì)胞IL-10表達(dá)

在不同濃度靈芝多糖作用下，B16F10黑素瘤細(xì)胞表達(dá)IL-10的蛋白含量受到抑制作用，與0μg/mL靈芝多糖組相比較，12.8μg/mL靈芝多糖組有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.498，P＜0.05)，如圖1：

圖1 B16F10黑素瘤細(xì)胞表達(dá)IL-10 Western-blot檢測結(jié)果

2.2 RT-PCR法檢測B16F10黑素瘤細(xì)胞IL-10的表達(dá)在不同濃度靈芝多糖作用下，B16F10黑素瘤細(xì)胞mRNA含量受到抑制，且隨靈芝多糖濃度的不斷增高，IL-10的表達(dá)量逐漸減少，呈劑量依賴趨勢。與對照組比較，除0.2μg/mL靈芝多糖組，其他組均具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.806，P＜0.05)，如圖2：

圖2 B16F10黑素瘤細(xì)胞表達(dá)IL-10 RT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

黑素瘤是細(xì)胞的異常增生的結(jié)果，機體在內(nèi)外多種因素的作用下導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，同時腫瘤細(xì)胞為了自身生存也在適應(yīng)其所處的復(fù)雜微環(huán)境[7]。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制分子抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)對腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生存具有重要作用。

TGF-β1、VEGF和IL-10是三種常見的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子。TGF-β1在腫瘤晚期可增加血管生成、抑制免疫功能，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。VEGF可通過自分泌或旁分泌方式降低免疫系統(tǒng)對腫瘤的排斥反應(yīng)，加速血管生成作用，逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[5]。IL-10具有免疫抑制效應(yīng)，抑制機體抗原提呈細(xì)胞、T細(xì)胞和固有免疫細(xì)胞的活性及功能，導(dǎo)致宿主處于免疫功能低下狀態(tài)或免疫抑制狀態(tài)，產(chǎn)生腫瘤易于生存的腫瘤微環(huán)境，從而在免疫應(yīng)答誘導(dǎo)和效應(yīng)的多個環(huán)節(jié)上抑制機體抗腫瘤免疫反應(yīng)，加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9,10]。黑素瘤細(xì)胞可分泌IL-10，還作為自分泌生長因子促進(jìn)腫瘤生長[11]。因此，IL-10的分泌對腫瘤的免疫逃逸及對疾病預(yù)后及轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要，本研究結(jié)果顯示，較高濃度靈芝多糖可有效抑制IL-10的分泌。

靈芝多糖是靈芝的主要成分[12]。張曉春等[13]研究證實靈芝多糖可以抑制腫瘤血管的生成，從而抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移。邢會軍等[14]實驗表明，靈芝多糖可以有效的抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。有文獻(xiàn)報告黑素瘤細(xì)胞上清液（B16F10-CS）的IL-10升高，在淋巴細(xì)胞與小鼠B16F10黑素瘤細(xì)胞上清液培養(yǎng)基中加入靈芝多糖后，淋巴細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B分泌增加[15]。本實驗結(jié)果顯示，靈芝多糖可抑制黑素瘤細(xì)胞分泌IL-10。李喬等[16]的研究結(jié)果顯示，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可能通過上調(diào)IL-10水平促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。Lu等[17]研究顯示，靈芝多糖可以減弱黑素瘤細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的抑制，恢復(fù)免疫細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能，進(jìn)而認(rèn)為靈芝多糖可能通過提高機體免疫力來抵制腫瘤生長。Sun等[18]利用靈芝多糖分別孵育小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞、小鼠肺腺癌LA795細(xì)胞，測定IL-10及其mRNA水平，結(jié)果顯示，在較高濃度靈芝多糖作用下，IL-10及其mRNA水平均受到抑制。與本實驗研究結(jié)果相同。因此，靈芝多糖有可能通過抑制IL-10的分泌抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；可通過恢復(fù)淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能[19,20]，恢復(fù)機體免疫防御功能，達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的作用。

本研究提示，較高濃度靈芝多糖對B16F10黑素瘤細(xì)胞產(chǎn)生IL-10具有抑制作用。因此，尋找有效方法來減少IL-10的分泌，可能對腫瘤治療有效，從而為腫瘤的免疫治療尋求新方法。