程立君，王世敏,*，李 周，程金朋，劉健君，余平蓮

（1.昭通學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昭通 657000；2.昭通市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昭通 657000）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界第四大糧食作物，富含維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維等成分，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和良好的保健功能[1]。我國(guó)是世界馬鈴薯第一生產(chǎn)大國(guó)，種植面積和總產(chǎn)量均占全世界的20%左右[2]，目前形成了東北、華北、西北、南方和西南冷涼地區(qū)五大馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，其中西南冷涼地區(qū)因高海拔冷涼的氣候環(huán)境和云貴高原得天獨(dú)厚的紅土資源，所產(chǎn)的馬鈴薯中淀粉和干物質(zhì)含量高，質(zhì)量較好[3]，適用于鮮食和加工。近年來(lái)，以馬鈴薯主糧化和產(chǎn)業(yè)扶貧為契機(jī)，西南地區(qū)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展[4]，尤其是馬鈴薯主食化、鮮切等加工需求迅速增長(zhǎng)，但是針對(duì)西南冷涼高地馬鈴薯的保鮮研究相對(duì)滯后。在馬鈴薯加工過(guò)程（如削皮、切片、粉碎）中，由于機(jī)械損傷導(dǎo)致代謝活動(dòng)增強(qiáng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，同時(shí)組織暴露于空氣表面與氧氣接觸，從而容易發(fā)生褐變[5]。鮮切馬鈴薯的褐變導(dǎo)致外觀不佳、品質(zhì)下降以及水分和養(yǎng)分的流失[6]，影響產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售，并阻礙了深加工產(chǎn)品的進(jìn)一步發(fā)展[7]。

鮮切馬鈴薯的褐變通常是由多酚氧化酶（PPO）引起的酶促褐變[8]。多酚氧化酶是一種含有兩個(gè)銅原子（CuA）的3型銅蛋白，在分子氧存在下，PPO可催化單酚酶羥基化和鄰二酚氧化為鄰醌，隨后醌類化合物被氧化成醌衍生物，形成的鄰醌與其他醌、氨基酸、蛋白質(zhì)非酶聚合形成黑色化合物，導(dǎo)致酶促褐變[9]，并且不同品種馬鈴薯的多酚氧化酶活性存在差異[10-11]。因此，如何有效抑制多酚氧化酶活性是西南冷涼高地鮮切馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需要。

通過(guò)調(diào)節(jié)pH和溫度等物理方法可以降低多酚氧化酶活性，從而控制馬鈴薯褐變的程度[12]，但是這些操作同時(shí)也容易導(dǎo)致馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)成分的損失。因此，本研究選擇檸檬酸、L-半胱氨酸、D-異抗壞血酸鈉、氯化鈣4種添加劑進(jìn)行復(fù)配，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法研究其不同比例復(fù)配后對(duì)鮮切馬鈴薯的護(hù)色效果，最終獲得對(duì)鮮切馬鈴薯褐變抑制效果最佳的組合，為鮮切馬鈴薯的護(hù)色保鮮提供參考，以期為高原特色馬鈴薯產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用馬鈴薯品種為昭薯ZT032，由昭通市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。挑選新鮮、大小基本一致、無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械損傷的馬鈴薯，4℃條件下貯存，備用。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、亞硫酸氫鈉、氯化鈣、鄰苯二酚、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉：均為國(guó)產(chǎn)分析純；L-半胱氨酸：生化試劑。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AX224ZH/E型精密電子天平，奧豪斯儀器有限公司；759型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海奧譜勒儀器有限公司；HL/T20MM型高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；BGZ140型干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1.1 檸檬酸對(duì)鮮切馬鈴薯護(hù)色的影響

新鮮馬鈴薯清洗、去皮后，切成厚度為3 mm的薄片，于濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的檸檬酸溶液中浸泡護(hù)色20 min后，考察其對(duì)馬鈴薯片PPO活性抑制率的影響。

1.2.1.2 L-半胱氨酸對(duì)鮮切馬鈴薯護(hù)色的影響

新鮮馬鈴薯清洗、去皮后，切成厚度為3 mm的薄片，于濃度分別為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%的L-半胱氨酸溶液中浸泡護(hù)色20 min后，考察其對(duì)馬鈴薯片PPO活性抑制率的影響。

1.2.1.3 D-異抗壞血酸鈉對(duì)鮮切馬鈴薯護(hù)色的影響

新鮮馬鈴薯清洗、去皮后，切成厚度為3 mm的薄片，于濃度分別為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%的D-異抗壞血酸鈉溶液中浸泡護(hù)色20 min后，考察其對(duì)馬鈴薯片PPO活性抑制率的影響。

1.2.1.4 氯化鈣對(duì)鮮切馬鈴薯護(hù)色的影響

新鮮馬鈴薯清洗、去皮后，切成厚度為3 mm的薄片，于濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的氯化鈣溶液中浸泡護(hù)色20 min后，考察其對(duì)馬鈴薯片PPO活性抑制率的影響。

1.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化鮮切馬鈴薯護(hù)色劑配方試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬酸、L-半胱氨酸、D-異抗壞血酸鈉和氯化鈣配比，得到最優(yōu)的馬鈴薯褐變抑制劑復(fù)合配方，并對(duì)該結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 多酚氧化酶的提取及酶活性抑制率的測(cè)定

參考李利華[13]的方法，加以改進(jìn)。稱取不同處理后的馬鈴薯樣品5 g，加入預(yù)冷的pH 6.0的磷酸緩沖溶液10 mL，在冰水浴中研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入至25 mL容量瓶中，用已預(yù)冷的pH 6.0磷酸緩沖溶液定容至25 mL，混勻后4℃下浸提10 min，取出后以4℃、10 000 r/min離心30 min，離心后得到的上清液即為多酚氧化酶粗酶液。

參考李利華[13]的方法，采用比色法，取4℃冷藏的0.1 mol/L磷酸緩沖溶液4 mL及0.1 mol/L鄰苯二酚溶液1.0 mL，再加入多酚氧化酶粗酶液0.5 mL，混勻后在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定吸光值（OD值），從加入酶液開(kāi)始計(jì)時(shí)，以不加酶液作為參比溶液每隔30 s記錄1次OD值的變化。選取吸光度-時(shí)間曲線中線性部分確定反應(yīng)時(shí)間和計(jì)算酶活性抑制率[14]。酶活性抑制率為經(jīng)抑制劑處理后酶的催化活性下降的百分?jǐn)?shù)[15]。

式中：IE為酶活性抑制率，%；ΔA0為未處理對(duì)照樣品在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度變化值；ΔA1為處理樣品在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度變化值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS（version 20.0）軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析；響應(yīng)面設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析采用Design Expert（version10.0）進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酸對(duì)鮮切馬鈴薯護(hù)色效果的影響

檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，因具有螯合作用和調(diào)節(jié)pH的特性，在食品加工中能提高抗氧劑的性能，抑制酶活性，延長(zhǎng)食品保存期[16]。由圖1可知，檸檬酸對(duì)PPO活性有明顯的抑制效果。隨著檸檬酸添加量的升高，對(duì)PPO活性的抑制率逐漸增加，當(dāng)添加量達(dá)到0.5%時(shí)，酶活性抑制率達(dá)到62.03%，之后檸檬酸添加量繼續(xù)升高，但PPO活性的抑制率基本保持穩(wěn)定，這與劉麗等[17]的研究結(jié)果較一致。分析原因可能因?yàn)闄幟仕釋?duì)PPO活性中心的銅離子具有較強(qiáng)的螯合作用，破壞了活性中心，使PPO活性受到抑制[18]，另外隨著檸檬酸濃度的升高，溶液的pH值逐漸下降，使得反應(yīng)體系的pH值遠(yuǎn)離PPO的最適pH值，進(jìn)一步導(dǎo)致PPO的結(jié)構(gòu)被破壞，從而失活[19]。但檸檬酸達(dá)到一定濃度后，反應(yīng)底物也受到了檸檬酸的抑制，在同一時(shí)間也會(huì)對(duì)酶的活性中心進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)[20]，導(dǎo)致雖然濃度繼續(xù)增加，但效果不明顯。因此，試驗(yàn)選擇檸檬酸濃度0.5%作為響應(yīng)面Box-Benhnken設(shè)計(jì)中零水平的中心點(diǎn)。

圖1 檸檬酸添加量對(duì)PPO活性抑制率的影響Fig.1 Effects of citric acid additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.2 L-半胱氨酸對(duì)鮮切馬鈴薯護(hù)色效果的影響

L-半胱氨酸為含硫氨基酸之一，屬非必需氨基酸，能直接與酶促反應(yīng)產(chǎn)物醌類物質(zhì)結(jié)合生成無(wú)色的硫氫化合物，從而抑制褐變的發(fā)生[21]。由圖2可見(jiàn)，L-半胱氨酸對(duì)PPO活性有明顯的抑制作用，隨著L-半胱氨酸添加量的升高，其對(duì)PPO活性的抑制率逐漸升高，當(dāng)添加量達(dá)到0.25%時(shí)，酶活性抑制率達(dá)到61.10%；達(dá)到一定濃度后，繼續(xù)增加L-半胱氨酸添加量，酶活性抑制率變化不明顯。原因可是由于高濃度的L-半胱氨酸溶液在馬鈴薯組織中傳質(zhì)受阻，從而影響L-半胱氨酸向鮮切馬鈴薯的浸透[22-23]，L-半胱氨酸抑制鮮切馬鈴薯PPO活性的最佳添加量為0.25%。因此，選擇L-半胱氨酸添加量0.25%作為響應(yīng)面Box-Benhnken設(shè)計(jì)中零水平的中心點(diǎn)。

圖2 L-半胱氨酸添加量對(duì)PPO活性抑制率的影響Fig.2 Effects of L-cysteine additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.3 D-異抗壞血酸鈉對(duì)鮮切馬鈴薯護(hù)色效果的影響

D-異抗壞血酸鈉又名赤藻糖酸鈉，具有極強(qiáng)的還原性，是一種新型生物型食品抗氧防腐保鮮助色劑，能抑制果蔬氧化酶類的活性，防止褐變現(xiàn)象的發(fā)生，對(duì)保持果蔬的外觀色澤和風(fēng)味品質(zhì)均有很大作用[24]。由圖3可知，D-異抗壞血酸鈉對(duì)鮮切馬鈴薯PPO活性有顯著的抑制作用，因?yàn)镈-異抗壞血酸鈉能夠作用于多酚氧化酶中心的銅離子，鈍化酶活性，同時(shí)能還原被酚酶氧化的酚類物質(zhì)，抑制褐變進(jìn)程[25]。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著D-異抗壞血酸鈉添加量的升高，其對(duì)PPO活性的抑制率逐漸升高，當(dāng)添加量達(dá)到0.04%時(shí)，酶活性抑制率達(dá)到77.26%，抑制效果明顯。但當(dāng)D-異抗壞血酸鈉添加量超過(guò)0.04%后，酶活性抑制率變化不明顯。因此，選擇D-異抗壞血酸鈉添加量0.04%作為響應(yīng)面Box-Benhnken設(shè)計(jì)中零水平的中心點(diǎn)。

圖3 D-異抗壞血酸鈉添加量對(duì)PPO活性抑制率的影響Fig.3 Effects of D-sodium isoascorbate additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.4 氯化鈣對(duì)鮮切馬鈴薯護(hù)色效果的影響

氯化鈣常作為食品添加劑，能使可溶性果膠凝固為凝膠狀不溶性果膠酸鈣，保持果蔬加工制品的脆度和硬度，同時(shí)Ca2+能夠抑制PPO活性，從而延緩褐變的發(fā)生[26-27]。由圖4可知，氯化鈣對(duì)鮮切馬鈴薯PPO活性具有一定的抑制作用，這可能是因?yàn)镃a2+與PPO中具有羧基的化合物結(jié)合，從而降低PPO活性[28]。隨著氯化鈣濃度的升高，對(duì)PPO活性的抑制率逐漸升高，當(dāng)添加量達(dá)到0.6%時(shí)，抑制率為36.09%，抑制效果明顯。當(dāng)氯化鈣添加量超過(guò)0.6%后，濃度繼續(xù)升高，酶活性抑制率變化趨于平緩，單獨(dú)使用氯化鈣作抑制劑時(shí)效果并不十分理想，有必要與其他抑制劑同時(shí)使用，通過(guò)交互作用增加抑制效果。因此，本試驗(yàn)選擇氯化鈣添加量0.6%作為響應(yīng)面Box-Benhnken設(shè)計(jì)中零水平的中心點(diǎn)。

圖4 氯化鈣添加量對(duì)PPO活性抑制率的影響Fig.4 Effects of calcium chloride additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化鮮切馬鈴薯護(hù)色劑配方試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以檸檬酸添加量、L-半胱氨酸添加量、D-異抗壞血酸鈉添加量、氯化鈣添加量4個(gè)因素為自變量，以PPO活性抑制率為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)分析，優(yōu)化褐變抑制劑的配方，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor and level of response surface experiment

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

2.5.2 多元二次回歸方程擬合及方差分析

利用Design Expert軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸方程擬合，通過(guò)響應(yīng)面回歸過(guò)程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立回歸模型，得到回歸方程：

回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，回歸方程極顯著（F=10.58，P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.279 8＞0.05），表明該模型有很好的擬合度，能將檸檬酸添加量、L-半胱氨酸添加量、D-異抗壞血酸鈉添加量和氯化鈣添加量4個(gè)因素對(duì)鮮切馬鈴薯護(hù)色效果進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。方差分析結(jié)果表明：一次項(xiàng)B，交互項(xiàng)BC、BD，二次項(xiàng)A2、B2、D2對(duì)PPO活性抑制率的影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C對(duì)PPO活性抑制率的影響顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)AB、AC、AD對(duì)PPO活性抑制率的影響不顯著；各因素對(duì)多酚氧化酶活性抑制率影響的順序?yàn)椋築（L-半胱氨酸添加量）＞C（D-異抗壞血酸鈉添加量）＞D（氯化鈣添加量）＞A（檸檬酸添加量）。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.5.3 響應(yīng)曲面圖分析

各因素交互作用對(duì)鮮切馬鈴薯PPO活性抑制率的影響見(jiàn)圖5～10。每個(gè)響應(yīng)曲面圖代表兩個(gè)自變量之間的相互作用對(duì)PPO活性抑制率的影響。通過(guò)對(duì)圖5～10的分析可知，除了BC（圖8）BD（圖9）的響應(yīng)面圖陡峭，等高線呈橢圓形，表明其交互作用極顯著（P＜0.01），其他兩兩因素交互作用的響應(yīng)面圖較平緩，等高線均呈橢圓形，隨著檸檬酸、L-半胱氨酸、D-異抗壞血酸鈉和氯化鈣水平的增加，酶活性抑制率變化均呈現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢(shì)，表明選擇合適的檸檬酸、L-半胱氨酸、D-異抗壞血酸鈉和氯化鈣添加量對(duì)抑制多酚氧化酶活性至關(guān)重要。

圖5 檸檬酸和L-半胱氨酸添加量的交互作用對(duì)酶活性抑制率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot showing the interaction effects of citric acid and L-cysteine additions on the inhibitory rates of PPO activities

圖8 L-半胱氨酸和D-異抗壞血酸鈉添加量的交互作用對(duì)酶活性抑制率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot showing the interaction effects of L-cysteine and sodium D-isoascorbate additions on the inhibitory rates of PPO activities

圖9 L-半胱氨酸和氯化鈣添加量的交互作用對(duì)酶活性抑制率影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface plot showing the interaction effects of L-cysteine additions and calcium chloride on the inhibitory rates of PPO activities

2.5.4 褐變抑制劑配比的確定

在獲得非線性回歸模型和響應(yīng)面分析的基礎(chǔ)上，得出酶活性抑制率的最佳條件為：檸檬酸添加量0.47%，L-半胱氨酸添加量0.28%，D-異抗壞血酸鈉添加量0.05%，氯化鈣添加量0.54%，該條件下酶活性抑制率預(yù)測(cè)值為95.84%。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的可靠性，在此最優(yōu)配比條件下，進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，酶活性抑制率的平均值為95.13%，與預(yù)測(cè)值相比，兩者的相對(duì)誤差為0.71%，誤差較小，說(shuō)明該模型可以很好地反映酶活性抑制率與各褐變抑制劑添加量的關(guān)系，利用響應(yīng)面法優(yōu)化褐變抑制劑添加量配比的研究是可靠的。

圖6 檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量的交互作用對(duì)酶活性抑制率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot showing the interaction effects of citric acid and D-sodium isoascorbate additions on the inhibitory rates of PPO activities

圖7 檸檬酸和氯化鈣添加量的交互作用對(duì)酶活性抑制率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot showing the interaction effects of citric acid and calcium chloride additions on the inhibitory rates of PPO activities

圖10 D-異抗壞血酸鈉和氯化鈣添加量的交互作用對(duì)酶活性抑制率影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface plot showing the interaction effects of sodium D-isoascorbate and calcium chloride additions on the inhibitory rates of PPO activities

3 結(jié)論

試驗(yàn)選擇西南冷涼高地種植的馬鈴薯品種昭薯ZT032為護(hù)色試驗(yàn)品種，通過(guò)添加護(hù)色劑抑制鮮切馬鈴薯中多酚氧化酶活性，減少褐變發(fā)生。單因素試驗(yàn)中研究了單一檸檬酸、L-半胱氨酸、D-異抗壞血酸鈉和氯化鈣對(duì)鮮切馬鈴薯的護(hù)色效果，并在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法進(jìn)行復(fù)配研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合護(hù)色劑對(duì)多酚氧化酶的酶活性抑制率效果優(yōu)于單一護(hù)色劑的效果。采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到西南冷涼高地鮮切馬鈴薯護(hù)色劑的最佳添加量配比為：檸檬酸0.47%，L-半胱氨酸0.28%，D-異抗壞血酸鈉0.05%，氯化鈣0.54%，此時(shí)PPO的酶活性抑制率為95.13%，與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為0.71%。該研究對(duì)高原特色鮮切馬鈴薯等產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。