王海帆 王予涵 初 明 李 燕 王月丹**

（1 北京大學基礎醫(yī)學院免疫學系 北京 100191 2 北大附中實驗學校 北京 100032）

2020年10月7日，瑞典卡羅林斯卡大學醫(yī)學院諾貝爾獎評選委員會宣布，2020年諾貝爾化學獎授予CRISPR／Cas9 技術的發(fā)明者——來自法國的微生物學家埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和來自美國的分子生物學家詹妮弗·杜德納（Jennifer A.Doudna），以表彰她們在基因編輯技術研究與應用領域中所作出的重要貢獻。

諾貝爾獎是當今世界上授予科學家的最高學術榮譽獎勵，只有對人類社會和科學發(fā)展具有重大影響力的科研成果及其完成人才能獲得如此殊榮?？ㄅ淼俸投诺录{研究的基因編輯技術是什么？該基因編輯技術對人類又有哪些影響和貢獻？ 在此，一起學習了解一下。

1 細菌的免疫與CRISPR／Cas9 系統

細菌是一種常見的微生物，體積很小，在動物和植物等其他生物體內均有大量的寄生性細菌。但是，在細菌體內也會有寄生物，這就是被稱為噬菌體的病毒。當人體被細菌感染后，人體的免疫系統就會對體內寄生的細菌進行清除，這就是免疫反應的現象。同樣，細菌被噬菌體感染后，也會啟動其擁有的細菌免疫系統，清除病毒的感染。

長久以來，人們一直都沒有發(fā)現細菌清除病毒感染的具體機制。直至1987年，日本科學家石野良純（Ishino Y）在對細菌的研究中發(fā)現，在大腸桿菌堿性磷酸酶的編碼區(qū)下游，存在著一段包括29 個堿基大小的重復片段和32～33 個堿基組成的非重復序列相互間隔串聯排列所組成的重復結構區(qū)域［1-2］。由于技術條件所限，這種結構區(qū)域的功能在當時并未明確，也未引起研究人員的關注。隨著現代分子生物學和測序技術的發(fā)展，在對細菌的測序工作中，人們發(fā)現這種串聯性重復結構區(qū)域在細菌中廣泛存在。為了規(guī)范研究，人們將這種串聯性重復結構區(qū)域命名為成簇規(guī)律間隔性短回文重復序列（clustered regul－arly interspaced short palindromic repeats），英文縮寫為CRISPR［3］。后來，人們通過對質粒轉染細菌的研究，發(fā)現這種串聯性重復結構區(qū)域的功能為清除進入細菌內的噬菌體和質粒等攜帶的外源性DNA 分子［4-6］，即細菌發(fā)揮適應性免疫應答效應的系統［7］。

細菌的CRISPR 結構一般是由編碼短回文重復區(qū)和間隔區(qū)序列組成的串聯性重復結構，并與其上游編碼CRISPR 相關蛋白（CRISPR-associated protein，Cas 蛋白）的Cas基因、前導區(qū)共同組成CRISPR／Cas 系統［1］（圖1）。在這個系統中，Cas基因具有非常豐富的多態(tài)性，其編碼的Cas 蛋白具有核糖核酸結合的結構域，同時還具有核酸內切酶和解旋酶的活性［8］。前導區(qū)實際上就是CRISPR 序列的啟動子區(qū)域，負責結合轉錄酶，啟動CRISPR 序列的轉錄。CRISPR 序列中的重復序列一般由21～48個堿基組成回文序列，可形成發(fā)卡結構；而間隔區(qū)則是細菌捕獲的來自質粒或噬菌體的外源性DNA片段，即細菌建立的DNA 序列“黑名單”。

圖1 CRISPR／Cas 系統基因結構模式圖

此系統是如何幫助細菌消滅入侵的外源性DNA 分子的？ 在此，筆者以CRISPR／Cas9 系統為例進行簡要說明。在外源性DNA （例如噬菌體DNA）首次進入細菌時，細菌會將外源性DNA 的一段序列整合到其自身基因組CRISPR 結構中的間隔區(qū)中，此過程稱為適應。當具有同樣DNA 序列的噬菌體再次感染細菌時，CRISPR 基因就會被激活轉錄生成一系列CRISPR RNA（crRNA），每一條crRNA 均包含一段由之前感染的外源性DNA序列轉錄而來的間隔序列（“黑名單”序列），此過程稱為表達。接著，細菌內的一種被稱為反式激活crRNA （tracrRNA）的分子，會分別與crRNA 和Cas9 蛋白結合，形成具有酶活性的RNA／蛋白酶復合物。通過堿基的互補配對作用，這個復合體可和帶有與crRNA 序列相同的外源性DNA 分子結合，并通過Cas9 的核酸內切酶活性，分別切割與crRNA 互補配對結合的DNA 鏈及其互補鏈，使DNA 分子發(fā)生雙鏈斷裂，從而降解進入細菌的外源性DNA 分子，干擾噬菌體對細菌的感染，此過程稱為干擾。

通過識別、轉錄和干擾3 個步驟，細菌即可通過免疫記憶的方式，特異性地識別噬菌體的DNA序列，并將其降解，從而起到保護細菌正常生存和繁殖的作用。

目前，已經發(fā)現的CRISPR／Cas 系統主要分為兩大類，其中2 類CRISPR／Cas 系統都只有一個共同的效應蛋白酶——Cas9。CRISPR／Cas9 系統是發(fā)現最早、結構最簡單、研究最明確及應用最為廣泛的CRISPR／Cas 系統。

2 CRISPR／Cas 基因編輯技術的發(fā)明與發(fā)展

基因是編碼一條多肽鏈或功能RNA 所需核苷酸序列的總和，是記錄支持著生命活動基本構造和性能信息的載體，決定了一個生命的生存、生長和凋亡等全部的生理過程和表型。

自從發(fā)現核酸和基因以來，人們就一直在嘗試通過基因編輯的方式，對基因進行改造，從而實現根本性改變或調節(jié)生命活動的目的。在CRISPR／Cas9 系統并應用于編輯基因之前，人們已經在大量使用鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）及轉錄激活樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）等技術，通過可與特定DNA 序列結合的核酸酶靶向特異性的DNA 序列，進行基因的編輯［9］。但是，由于這個過程需要核酸酶蛋白分子與DNA 的特異性結合，每次編輯時，均需要按照靶點序列的不同，重新設計和構建不同的核酸酶蛋白，工作流程復雜，成本很高，單一實驗室往往很難完成，因此，其應用范圍受到了很大的制約，往往只能用于實驗室的科學研究工作。

通過研究，人們發(fā)現CRISPR／Cas9 系統導致的發(fā)生雙鏈斷裂的DNA 分子，也可通過易于發(fā)生錯誤的非同源末端連接的方式進行修復，但這種修復往往會導致基因敲除、敲入和染色體轉位等編輯效應。

2011年，卡彭蒂耶團隊發(fā)表了第1 篇關于CRISPR／Cas9 系統完整結構的論文［10］。他們通過基因分析等實驗研究發(fā)現，在細菌清除外源性DNA 過程中，共有4 個組成構件參與，分別是一種被稱為Csn1 的蛋白質分子（即Cas9）、crRNA、tracrRNA 和一種RNA 酶（RNA 酶Ⅲ）。但在這篇論文中，對于這4 種成分的具體功能，卡彭蒂耶并未給出答案。論文發(fā)表后，引起了美國加州大學伯克利分校杜德納教授的關注。2012年，杜德納與卡彭蒂耶聯手在《科學》上發(fā)表論文［11］，揭示了Cas9 是具有RNA 引導下DNA 內切酶活性的蛋白質分子，并在體外非細胞體系中，證實了該分子具有切割任意DNA 分子序列的能力，具有修改基因的活性［12］。這也是杜德納和卡彭蒂耶獲得諾貝爾化學獎的主要成就。

但是，由于在實驗中遇到了一些技術性的困難，杜德納和卡彭蒂耶團隊并未能在細胞內成功地完成基因編輯的工作，這也是最終該成果未能獲得諾貝爾醫(yī)學或生理學獎的重要原因。美國華裔科學家張峰在看到卡彭蒂耶論文之后，也開始積極研究基于CRISPR／Cas9 的基因編輯技術，于2013年最終在活體細胞內成功地實現了基因編輯，并且還在不斷發(fā)展和改進著以CRISPR／Cas系統為基礎的基因編輯技術，使人們對細胞的基因編輯技術不斷簡化和實用。

3 CRISPR／Cas 基因編輯技術的應用

由于CRISPR／Cas 技術中使用的Cas 蛋白分子具有切割任意DNA 序列的能力，具有非常好的通用性和廣泛的適用范圍，在使用時不再需要像ZFNs 和TALENs 技術那樣重新構建新的蛋白質結構，而只需要合成一段引導RNA（gRNA）即可實現對任意的基因進行編輯。這極大推動了基因編輯在各個領域中的應用，目前，CRISPR／Cas 基因編輯技術主要可用于基因功能研究、生物育種和人類疾病的治療中。

在基因功能的研究方面，CRISPR／Cas 技術可極大縮短基因編輯工具的構建時間周期，提高構建的效率，已廣泛應用于斑馬魚、小鼠、食蟹猴、果蠅、線蟲、豬、兔等各種動物的基因敲除、敲入和誘導突變等模型的建立，極大推動了人們對各種基因功能的研究和認知，為揭開生命現象的最后密碼提供了一件研究的“神器”。

在生物育種方面，CRISPR／Cas 技術能針對作物本身的基因進行定點精準突變或精準編輯，從而能極大提高育種的效率，在農業(yè)生產上具有非常重要的應用價值。目前，該技術已在水稻、小麥和大豆等農作物中應用，改善這些農作物在抗病能力、雜種優(yōu)勢、不育性、株高、支鏈淀粉含量、抗除草劑性能和香味等方面的性能。此外，在番茄、土豆和萵苣等11 個園藝作物品種中也在使用CRISPR／Cas 的基因編輯技術［13］。有人統計，目前已有包括模式植物、農作物、果樹等木本植物和草本植物的多達21 個物種，使用該技術進行了基因編輯并取得了成功。在動物育種方面，有人采用CRISPR／Cas 技術，對綿羊胚胎的成纖維細胞進行基因編輯也取得了成功。

在人類疾病治療方面，CRISPR／Cas 技術獲得了巨大的成功。首先，通過對人類胚胎中突變的HBB基因進行編輯修飾，在治療β－地中海貧血癥的患者中取得了巨大的成果，使這種遺傳性血紅蛋白缺陷病的治愈成為現實。此外，CRISPR／Cas 技術在治療鐮刀形紅細胞貧血、血友病及亨廷頓舞蹈病等遺傳性疾病方面，也都取得了很大的進展，成為基因治療的重要技術工具［14］。利用該技術，人們還可對干細胞和CAR-T 細胞等免疫細胞進行基因編輯，敲除與治療不良反應相關的基因，從而提升干細胞和免疫細胞的治療效果，減少副作用，在惡性腫瘤等疾病的治療中，取得了成功，并且在不斷地推廣。

4 CRISPR／Cas 技術存在的問題與展望

在很短的時間內，CRISPR／Cas 技術就在基因編輯領域中取得了飛速的發(fā)展，但在造福于人類的同時，該技術也存在一些問題，并且給人類社會帶來了挑戰(zhàn)。

首先，由于CRISPR 靶向目的基因的引導片段很短，只有幾十個堿基，而人類的基因非常龐大有數10 億個堿基對，所以，很容易發(fā)生引導片段識別非目的基因序列而出現的脫靶現象，造成非目的基因的受損，產生基因編輯相關的損傷。因此，如何提升CRISPR／Cas 系統識別和編輯基因的精準度，是改善該技術應用的重要技術性問題［15］。

另一方面，為了能讓CRISPR／Cas 系統的成分發(fā)揮基因編輯功能，必須使用一定的遞送方法讓其能進入細胞。目前，主要的遞送方法包括物理遞送（例如，顯微注射、電轉導技術等）、化學遞送（例如，使用脂質體、納米顆粒投遞系統等）和生物遞送3 種方式。其中，生物遞送是臨床基因治療中最常用的遞送方法，占臨床基因治療的70%以上。主要用于生物遞送的載體是慢病毒、腺病毒和腺相關病毒（AAV）。其中，AAV 免疫原性和生物學毒性都較低，是最為常用的基因治療病毒載體，但在基因治療中，AAV 載體相關的死亡事件屢有發(fā)生，成為制約基因治療和基因編輯技術臨床應用的“瓶頸”。因此，發(fā)展和改良CRISPR／Cas 的遞送系統，提升其安全性和有效性，也是基因編輯和治療技術亟待解決的關鍵性技術問題。

由于基因是人類的生命密碼，對于人類基因的編輯，不僅面臨技術發(fā)展和改善的問題，也給人類社會生活帶來了巨大的挑戰(zhàn)。倫理學問題是CRISPR／Cas 基因編輯技術應用時難以回避的問題，哪些人類基因能被編輯？基因編輯后對人類健康和行為有哪些影響？哪些人的基因可被編輯？經基因編輯的人類胎兒是否允許出生？ 在這些問題得到科學和恰當的解答之前，對于人類的基因編輯問題應慎之又慎。

無論如何，CRISPR／Cas 技術給人們又一次帶來能改變自己命運的神奇工具，希望人們能用好這把“魔力之剪”，讓生活變得更加健康、更加美好、更加幸福。

5 寫在最后

因為是獎勵化學研究方面的成就，有關CRISPR／Cas 技術的諾獎并未授予在細菌中發(fā)現CRISPR 系統的日本科學家石野良純和首次利用CRISPR／Cas9 技術進行活體細胞基因編輯的美國華裔科學家張峰。但是，正如石野良純在祝賀2 位科學家獲獎時所說的，“但我并不后悔，古細菌的其他研究同樣讓我感到快樂，并一直支持著我走到今天”。是的，科學的意義在于發(fā)現，科學家的研究就是他們的快樂。這就是科學家追求的全部。