游麗嬌，孫芳園，楊小芳，耿歡，雷鳴

重樓皂苷Ⅱ?qū)θ朔切〖?xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

游麗嬌，孫芳園，楊小芳，耿歡，雷鳴

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院，上海 200137

觀察重樓皂苷Ⅱ?qū)θ朔切〖?xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能的作用機(jī)制。不同濃度重樓皂苷Ⅱ作用于A549細(xì)胞48 h，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率；將細(xì)胞分為對(duì)照組和重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組，JC-10熒光探針檢測線粒體膜電位（MMP），F(xiàn)luo-4 AM熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，各濃度重樓皂苷Ⅱ可降低A549細(xì)胞存活率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組A549細(xì)胞MMP顯著降低，Ca2+、ROS水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，重樓皂苷Ⅱ高劑量組Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。重樓皂苷Ⅱ可能通過降低細(xì)胞MMP，提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，增加細(xì)胞內(nèi)ROS含量，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3表達(dá)，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

非小細(xì)胞肺癌；重樓皂苷Ⅱ；A549細(xì)胞；線粒體；凋亡

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%，是全球癌癥死亡的主要原因[1]。早期診斷和治療雖然有效，但由于化學(xué)抗癌藥物的毒性和耐藥性，故亟需探索和開發(fā)更安全、有效的抗癌藥物[2]。近年來，從中藥中提取天然的抗癌活性成分受到廣泛關(guān)注。研究報(bào)道，中藥有效成分可通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期、免疫修飾和抑制炎癥發(fā)揮抗癌活性[3-4]。線粒體是傳遞凋亡信號(hào)的主要細(xì)胞器，細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)Ca2+、活性氧（ROS）水平和線粒體膜電位（MMP）變化是線粒體功能障礙的主要事件[5]。因此，靶向線粒體途徑有望成為抗腫瘤藥物篩選的主要策略。重樓皂苷Ⅱ是從重樓中提取的天然三萜類活性成分，已有研究顯示，多種三萜類化合物可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[6]。本研究觀察重樓皂苷Ⅱ?qū)θ朔切〖?xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物和細(xì)胞

重樓皂苷Ⅱ，成都普菲德生物公司，純度＞98%，批號(hào)76296-72-5。人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基（貨號(hào)MA0315）、FBS（貨號(hào)PWL001）、青鏈霉素（貨號(hào)MA0110）、CCK-8細(xì)胞存活率檢測試劑盒（貨號(hào)MAO218）、JC-10熒光探針（貨號(hào)MB6097）、Fluo-4 AM鈣離子熒光探針（貨號(hào)MA0196）、DCFH-DA ROS熒光探針（貨號(hào)MB4682）、Hoechst 33342染色劑（貨號(hào)MB3210）和PBS（貨號(hào)MA0015），大連美侖生物；Bax（貨號(hào)5023S）、Bcl-2（貨號(hào)3498S）、cleaved Caspase-3（貨號(hào)9661S）和β-actin（貨號(hào)8457S）一抗，美國CST公司。CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司），倒置顯微鏡（德國徠卡），超凈工作臺(tái)（美國Thermo Scientific公司），純水儀（美國Millipore公司），MQ05267多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀（美國GE），電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad），Amersham Imager 600蛋白成像儀（美國GE）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

A549細(xì)胞用含10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為對(duì)照組和重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組，根據(jù)細(xì)胞存活率檢測結(jié)果，選擇細(xì)胞存活率為50%（IC50）時(shí)的濃度作為中劑量，2倍IC50濃度為高劑量，1/2 IC50濃度為低劑量，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.4 細(xì)胞存活率測定

取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，以5×l03個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板中培養(yǎng)過夜；分別以終濃度為0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L重樓皂苷Ⅱ處理細(xì)胞48 h，另設(shè)對(duì)照組（有細(xì)胞，無藥物干預(yù)）和空白孔（無細(xì)胞，只加入培養(yǎng)基）；48 h后各孔加入10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)1 h，于酶標(biāo)儀波長450 nm處檢測吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組OD值－空白孔OD值）÷（對(duì)照組OD值－空白孔OD值）×100%。

1.5 線粒體膜電位檢測

將A549細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，分別用低、中、高劑量重樓皂苷Ⅱ培養(yǎng)48 h；PBS洗滌2次，將JC-10試劑和Hoechst 33342染色液均以1∶200加入PBS中，配制JC-10工作液，每孔加100 μL JC-10工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育45 min，使用高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀分析數(shù)據(jù)并拍照，以紅綠熒光比值計(jì)算MMP。

1.6 Ca2+水平檢測

將A549細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，分別用低、中、高劑量重樓皂苷Ⅱ培養(yǎng)48 h；PBS洗滌2次，將Fluo-4 AM試劑和Hoechst 33342染色液分別以1∶800、1∶200加入PBS中，配制Fluo-4 AM工作液，每孔加100 μL工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育45 min，使用高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀分析數(shù)據(jù)并拍照，以綠色熒光強(qiáng)度表示Ca2+水平。

1.7 活性氧水平檢測

將A549細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于黑色透底96孔板中培養(yǎng)過夜，分別用低、中、高劑量重樓皂苷Ⅱ培養(yǎng)48 h；PBS洗滌2次，將DCFH-DA試劑和Hoechst 33342染色液分別以1∶1 000、1∶200加入PBS中配制DCFH-DA工作液，每孔加100 μL工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育45 min，多功能酶標(biāo)儀于激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm處測量各孔OD值，計(jì)算ROS含量。

1.8 Western blot檢測

取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL密度接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，分別用低、中、高劑量重樓皂苷Ⅱ培養(yǎng)48 h；RIPA裂解液冰上裂解，提取總蛋白，BCA法蛋白定量；按照上樣濃度比例加入5×蛋白上樣緩沖液，金屬浴95 ℃、10 min使蛋白變性；經(jīng)PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；用一抗稀釋液按1∶1 000比例稀釋Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3一抗，4 ℃孵育過夜；1×TBST洗滌3次，每次10 min；室溫孵育二抗2 h，1×TBST洗滌3次，每次10 min，ECL成像采集圖像，采用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 重樓皂苷Ⅱ?qū)549細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組比較，各濃度重樓皂苷Ⅱ顯著降低細(xì)胞存活率（＜0.01）。重樓皂苷Ⅱ濃度為1 μmol/L時(shí)，A549細(xì)胞存活率為50%，故選擇1 μmol/L作為中劑量、2 μmol/L作為高劑量、0.5 μmol/L作為低劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖1。

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001

2.2 重樓皂苷Ⅱ?qū)549細(xì)胞線粒體膜電位的影響

當(dāng)MMP正常時(shí)，JC-10聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)MMP降低時(shí)，JC-10從線粒體基質(zhì)釋放到胞漿中，此時(shí)JC-10為單體，產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果顯示，對(duì)照組紅色熒光較強(qiáng)，表明MMP較高；與對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)，紅綠熒光比值降低，提示MMP下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。結(jié)果見圖2。

注：A.對(duì)照組；B.重樓皂苷Ⅱ低劑量組；C.重樓皂苷Ⅱ中劑量組；D.重樓皂苷Ⅱ高劑量組；與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 重樓皂苷Ⅱ?qū)549細(xì)胞Ca2+水平的影響

Fluo-4 AM進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶剪切形成Fluo-4，從而滯留在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)luo-4可與細(xì)胞內(nèi)的Ca2+結(jié)合，產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果顯示，對(duì)照組綠色熒光較弱，表明Ca2+水平較低。與對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組綠色熒光明顯增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.001）。結(jié)果見圖3。

注：A.對(duì)照組；B.重樓皂苷Ⅱ低劑量組；C.重樓皂苷Ⅱ中劑量組； D.重樓皂苷Ⅱ高劑量組；與對(duì)照組比較，***P＜0.001

2.4 重樓皂苷Ⅱ?qū)549細(xì)胞活性氧含量的影響

與對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅱ中、高劑量組A549細(xì)胞ROS含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。結(jié)果見圖4。

注：A.對(duì)照組；B.重樓皂苷Ⅱ低劑量組；C.重樓皂苷Ⅱ中劑量組； D.重樓皂苷Ⅱ高劑量組；與對(duì)照組比較，**P＜0.01

2.5 重樓皂苷Ⅱ?qū)549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，重樓皂苷Ⅱ中、高劑量組Bax蛋白表達(dá)顯著升高，重樓皂苷Ⅱ低、高劑量組cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表1、圖5。

表1 各組A549細(xì)胞Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*＜0.05，**＜0.01

注：A.對(duì)照組；B.重樓皂苷Ⅱ低劑量組；C.重樓皂苷Ⅱ中劑量組； D.重樓皂苷Ⅱ高劑量組

3 討論

肺癌當(dāng)前以手術(shù)、化療和放療為主，但不良反應(yīng)大。天然植物類抗腫瘤藥物因其不良反應(yīng)少成為研究熱點(diǎn)[7]。有研究顯示，重樓皂苷Ⅱ?qū)Π螂装8]、肝癌[9]等具有一定作用。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討重樓皂苷Ⅱ?qū)θ朔切〖?xì)胞肺癌A549細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制。

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅱ可降低細(xì)胞存活率，提示重樓皂苷Ⅱ可抑制A549細(xì)胞增殖，且隨著藥物濃度增加，抑制效果增強(qiáng)。當(dāng)線粒體產(chǎn)生能量時(shí)，線粒體內(nèi)膜將質(zhì)子泵入內(nèi)膜和外膜之間的空隙，導(dǎo)致大量質(zhì)子積聚，形成質(zhì)子梯度，并在兩側(cè)產(chǎn)生電位差，從而形成MMP，MMP是評(píng)價(jià)線粒體功能完整性的指標(biāo)[10-11]。采用熒光染料JC-10檢測MMP，結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅱ處理后，A549細(xì)胞MMP降低，提示呼吸鏈?zhǔn)軗p，線粒體功能異常。線粒體能吸收并釋放Ca2+，從而維持細(xì)胞正常功能，如新陳代謝、增殖和凋亡等[12]。Ca2+水平升高導(dǎo)致線粒體Ca2+超負(fù)荷，使線粒體外膜通透性增加，線粒體內(nèi)的Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)線粒體功能障礙[13]。重樓皂苷Ⅱ處理后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，導(dǎo)致線粒體腫脹、破裂，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。低濃度ROS在細(xì)胞生理調(diào)節(jié)中起重要作用，高濃度ROS可產(chǎn)生毒性作用導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]。線粒體是產(chǎn)生ROS的主要場所，ROS水平升高可使線粒體膜通透性增加，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，并激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-16]。采用DCFH-DA熒光染料檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量，結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅱ可增加A549細(xì)胞內(nèi)ROS含量，提示重樓皂苷Ⅱ可使線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

凋亡是細(xì)胞程序性死亡的主要方式，在維持組織穩(wěn)態(tài)中起重要作用[17]。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡中起重要調(diào)節(jié)作用，主要由抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax等組成。凋亡系統(tǒng)激活后，Bax和Bcl-2會(huì)在線粒體外膜上形成同型低聚體，并使細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，誘導(dǎo)Caspase激活[18]。本研究結(jié)果表明，重樓皂苷Ⅱ處理后，A549細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)降低，提示重樓皂苷Ⅱ可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，重樓皂苷Ⅱ可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與降低A549細(xì)胞MMP，提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，增加細(xì)胞內(nèi)ROS含量，調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究為重樓皂苷Ⅱ用于NSCLC的輔助治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of Polyphyllin Ⅱ on Apoptosis of Human Non-Small Cell Lung Cancer A549 Cells

YOU Lijiao, SUN Fangyuan, YANG Xiaofang, GENG Huan, LEI Ming

To observe the effects of polyphyllin Ⅱ on human non-small cell lung cancer A549 cells; To explore its possible mechanism of action.Different concentrations of polyphyllin Ⅱ acted on A549 cells for 48 hours, and the cell survival rate was detected by CCK-8 method. A549 cells were divided into control group, polyphyllin Ⅱ low-, medium-, and high-dosage groups, and JC-10 fluorescent probe was used to detect MMP; Fluo-4 AM fluorescent probe was used to detect intracellular Ca2+level; DCFH-DA fluorescent probe was used to detect intracellular ROS level; Western blot was used to detect the protein expressions of Bax, Bcl-2, and cleaved Caspase-3 in cells.Compared with the control group, the survival rate of A549 cells in each polyphyllin Ⅱ group significantly decreased, with statistical significance (<0.01). The MMP of A549 cells was significantly reduced, the levels of Ca2+and ROS significantly increased, and the expression of Bcl-2 protein was significantly reduced in each polyphyllin Ⅱ group; protein expressions of Bax and cleaved Caspase-3 increased significantly in polyphyllin Ⅱ high-dosage group, with statistical significance (<0.05).Polyphyllin Ⅱ may promote A549 cell apoptosis by reducing cell MMP, increasing intracellular Ca2+level, increasing intracellular ROS content, and regulating apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax, cleaved Caspase-3 expression.

non-small cell lung cancer; polyphyllin Ⅱ; A549 cells; mitochondria; apoptosis

R285.5

A

1005-5304(2021)10-0081-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202103001

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81973649）；浦東新區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)領(lǐng)先人才培養(yǎng)項(xiàng)目（pwr12019-02）；浦東新區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（PWZy2020-07）；浦東新區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床高原學(xué)科建設(shè)計(jì)劃（PWYgy2018-01）

雷鳴，E-mail：leiming6891@163.com

（收稿日期：2021-03-01）

（修回日期：2021-03-20；編輯：鄭宏）