吳長榮，代勝，梁龍飛，孫文濤，彭超，陳超，郝俊

（貴州大學動物科學學院草業(yè)科學系，貴州貴陽550025）

構樹（Broussonetia papyrifera）為桑科植物，葉蛋白含量超過20%，富含氨基酸、維生素、礦質元素及微量元素等［1］。在當前畜牧業(yè)發(fā)展迅速，蛋白飼料和粗飼料相對短缺的背景下，將其發(fā)展為優(yōu)質的木本飼料資源，對畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義。構樹纖維含量較高，直接飼喂影響家畜適口性，而且蛋白質消化率低，通過青貯發(fā)酵能適度降低纖維，增加飼喂價值［2-3］。宋博等［4］研究發(fā)現(xiàn)在育肥豬低蛋白水平飼糧中添加10%構樹全株發(fā)酵飼料可提高肌肉中肌內脂肪和游離氨基酸含量，改善豬肉品質。王永樹等［5］通過構樹葉畜禽喂養(yǎng)對比試驗，發(fā)現(xiàn)畜禽增效達46%～108%，司丙文等［6］在飼糧中添加雜交構樹青貯發(fā)現(xiàn)構樹青貯提高了肉羊的生長性能、免疫力和抗氧化能力，促進肉羊健康，同時提高了肉羊背最長肌中n-3PUFA 含量，改善了羊肉脂肪酸的構成。

然而，直接青貯對纖維的降解程度非常有限，而且構樹緩沖力高、含糖量低，直接青貯不利于乳酸菌發(fā)酵，往往容易導致青貯失敗［7］。梁春宇等［8］的研究表明，泌乳前期奶牛飼糧中添加超過14%的構樹青貯料后會導致奶牛產奶量和養(yǎng)分表觀消化率降低。另外青貯過程難免有蛋白質降解為非蛋白蛋（non-protein nitrogen，NPN）和一些含氮化合物，蛋白質的大幅度分解成為影響青貯材料營養(yǎng)價值和利用價值的一個重要因素［9］。此外，由于NPN 不能被家畜有效的利用，導致過多的被排出體外，還會引起更多的環(huán)境污染問題［10］?？挛臓N［11］研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿（Medicago sativa）添加由乳酸和無機酸組成的復合添加劑青貯后，NPN 的含量較對照組顯著降低。崔鑫［12］通過研究紫花苜蓿添加甲酸青貯發(fā)現(xiàn)，添加甲酸能更好地保存紫花苜蓿青貯料中的肽氮，Sophie 等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，添加劑對在青貯中氮組分降解有明顯的抑制作用，添加單寧提取物青貯后減少了10%的NH3-N 降解。然而，目前有關添加劑對構樹青貯發(fā)酵的影響，尤其是作為蛋白飼料而言構樹青貯中氮組分含量變化的研究報道較少。

因此，本研究以晾曬1.5 h 的雜交構樹為青貯原料，添加糖蜜后再添加纖維素酶、乳酸菌、甲酸、丙酸等添加劑，研究不同添加劑對構樹青貯飼料營養(yǎng)價值、發(fā)酵品質、酶活性和蛋白質降解的影響，從而為構樹青貯飼料的開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料準備

原材料為新鮮的雜交構樹，取于貴州省長順縣構樹組培基地（2019年6月14日），截取構樹嫩枝葉（距頂端60 cm 處）后晾曬1.5 h（溫度：25 ℃，光照：34.3×103lx），再用鍘草機將其切碎為1.5～2.5 cm 左右備用。

添加劑：糖蜜（含糖量約為48%），甲酸（HCOOH，分析純，純度≥88%），纖維素酶（主要成分為纖維素酶，酶活力≥30000 U·g-1），乳酸菌［主要成分為植物乳桿菌（Laobacillus plantarum），活菌數(shù)≥1.0×1010cfu·g-1］。構樹原料營養(yǎng)成分如下（表1）。

表1 構樹原料營養(yǎng)成分Table 1 Nutritional components of paper mulberry silage

1.2 試驗設計

共設置4 個處理組，原料中添加4%糖蜜作為對照，記作CK 組；在添加糖蜜的基礎上分別添加1 g·kg-1纖維素酶、0.02 g·kg-1乳酸菌、4 mL·kg-1甲酸，分別記作CE、LB 和FA 組，每個處理設置3 個重復。在青貯0、1、3、7、15、30、45 d 分別取樣測定青貯料氮組分，并在青貯45 d 后棄用上層，取袋中間位置的樣品混勻用于分析青貯料營養(yǎng)和發(fā)酵品質。

1.3 試驗指標及測定

取青貯完成后樣品10 g，加入90 mL 蒸餾水，攪拌均勻，4 ℃條件下浸提24 h 后再用4 層紗布和定性濾紙過濾，濾液即為樣品的浸提液，用于營養(yǎng)成分、發(fā)酵品質、氮組分和酶活性測定。干物質（dry matter，DM）、粗蛋白（crude protein，CP）、粗纖維（crude fiber，CF）、粗灰分（crude ash，Ash）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量參照張麗英［13］的方法測定；可溶性碳水化合物（watersoluble carbohydrate，WSC）參考Wang 等［14］的方法測定；pH 值用PHS-3C 酸度計（上海精密儀器有限公司）測定；乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）的含量測定參照高海娟等［15］的方法；非蛋白氮（non-protein Nitrogen，NPN）含量用微量凱氏定氮法測定［16］；游離氨基酸（free amino acids，AA-N）含量采用茚三酮-硫酸肼比色法測定［17］；氨態(tài)氮（ammonia nitrogen，NH3-N）含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定［18］；肽氮（peptide nitrogen，peptide-N）含量按照公式：Peptide-N=NPN-（AA-N+NH3-N）計算得出?？偟╰otal nitrogen，TN）含量即為粗蛋白含量除以6.25。羧基肽酶、酸性蛋白酶和氨基肽酶活性測定參考楊智明等［19］的方法。

1.4 數(shù)據處理

采用Excel 2013 軟件對基礎數(shù)據進行分析整理和圖形繪制，采用SPSS 20.0 進行單因素（one-way ANOVA）和雙因素方差分析，并用Duncan 法對各組進行多重比較，P＜0.05 為差異顯著。并對青貯處理45 d 的指標參照王亞芳等［20］模糊隸屬函數(shù)值法對3 種添加劑處理進行綜合評價，如果測定的指標與青貯的營養(yǎng)價值呈正相關，計算公式如下：

如果為負相關，則用反隸屬函數(shù)進行轉換，計算公式如下：

式中：U為不同添加劑下的每個指標的隸屬函數(shù)值，Xj表示第j個因子的得分值，Xmin表示第j個因子得分的最小值，Xmax表示第j個因子得分的最大值。將不同添加劑處理下的每個指標的隸屬函數(shù)值相加后求平均值，即為隸屬度。

2 結果與分析

2.1 不同添加劑對構樹青貯飼料營養(yǎng)品質的影響

由表2可知，與CK 相比，3 種添加劑處理的DM 含量均增加，但只有FA 組差異顯著（P＜0.05）；3 種添加劑處理的CP 含量顯著增加（P＜0.05），CF 含量均顯著降低（P＜0.05）；FA 和CE 處理的EE 含量顯著增加（P＜0.05），LB 處理的EE 含量與CK 相比無顯著差異；FA 和CE 處理的WSC 含量均增加，但只有FA 組差異顯著（P＜0.05），LB 處理的WSC 含量顯著降低（P＜0.05）；FA 與CE 處理的ADF 含量顯著低于CK（P＜0.05）；CE 組NDF 含量顯著低于其他各組（P＜0.05）。

表2 不同添加劑對構樹青貯飼料營養(yǎng)品質的影響Table 2 Effects of different additives on nutrient quality of paper mulberry silage

2.2 不同添加劑對構樹青貯飼料發(fā)酵品質的影響

與CK 相比，3 種添加劑處理的LA 和AA 含量均顯著增加（P＜0.05），且LB 處理的LA 含量和FA 處理的AA含量達到最大值；3 種添加劑處理的pH 值、PA 含量和AN/TN 均顯著降低（P＜0.05），其中LB 處理的pH 值、PA含量和AN/TN 均最低（表3）。

表3 不同添加劑對構樹青貯飼料發(fā)酵品質的影響Table 3 Effects of different additives on fermentation quality of paper mulberry silage

2.3 不同添加劑對構樹青貯飼料蛋白酶的動態(tài)影響

不同添加劑處理下構樹青貯飼料酸性蛋白酶、羧基肽酶和氨基肽酶的動態(tài)變化如表4所示。隨著青貯時間的延長，3 種酶活性總體均呈下降趨勢，且每個時間段差異顯著（P＜0.05）。0～45 d 內，LB、FA、CE 和CK 處理下酸性蛋白酶活性分別降低了80.60%、76.17%、71.06%和64.27%，羧基肽酶活性分別降低了69.67%、66.53%、59.17%和37.15%，而氨基肽酶活性在FA 和LB 處理下，到青貯第7 天就未檢測到其活性，CE 與CK 組在青貯15 d 時失活。

表4 不同添加劑對構樹青貯飼料蛋白酶的動態(tài)影響Table 4 Dynamic effects of different additives on the protease of paper mulberry silage

在同一青貯時間處理下，F(xiàn)A、LB 和CE 處理的酸性蛋白酶、羧基肽酶和氨基肽酶活性均顯著低于CK 組（P＜0.05），CE 對3 種酶活性的影響小于FA 和LB（P＜0.05）。其中，LB 組酸性蛋白酶活性在各時間段均最低（3、7 d與FA 處理差異不顯著）；0～3 d 內FA 組羧基肽酶活性降低了39.13%，之后緩慢降低，30 d 后其降低幅度小于LB組；FA 和LB 處理下第7 天氨基肽酶完全失活，而CE 和CK 在第15 天完全失活。

2.4 不同添加劑對構樹青貯飼料氮組分的動態(tài)影響

不同添加劑處理構樹青貯過程中pH 值、NPN、NH3-N、AA-N、peptide-N 和TN 含量動態(tài)變化如圖1所示。pH 值在構樹青貯過程中隨著時間延長逐漸降低，青貯0～1 d，所有處理組均快速下降，其中FA 組顯著低于其余各組（P＜0.05）。青貯15～45 d，除CK 組（4.29），各組pH 值均低于4.20。青貯后，CK 組每個時間點的pH 值均顯著高于其余各處理組（P＜0.05）。青貯0～7 d 的FA 組pH 值最低，而青貯7～45 d 的LB 組pH 值最低且各處理組pH 值均變化較小。45 d 后CK 組pH 值顯著高于其余各組（P＜0.05），但其余各組間差異不顯著（圖1a）。

NPN 含量在青貯0～1 d 生成較快，由18.34%迅速增加到30%以上，之后生成緩慢。不同青貯時間段中CK組的NPN 含量顯著高于其余各組（P＜0.05），LB 組的NPN 含量最低，0～30 d 各組間差異不顯著，30 d 后LB 組顯著低于其余各組（P＜0.05）。45 d 的CK 組NPN 含量達到52.91%，而其余各處理組均低于50%，LB 組最低（46.87%），說明添加劑處理降低了NPN 的生成量（圖1b）。

所有處理組NH3-N 含量隨著青貯時間的延長逐漸增加，0～7 d 生成速率較快，之后趨于平穩(wěn)。不同青貯時間段中CK 組的NH3-N 含量均顯著高于其余各組（P＜0.05），LB 與FA 組間差異不顯著，但顯著低于CE 組（P＜0.05）。青貯0～30 d FA 與CE 組間差異不顯著，之后CE 組顯著高于FA 組（P＜0.05）。青貯45 d CK 組NH3-N含量（9.93%），顯著高于其余各組（P＜0.05），LB 組最低（8.09%），但均低于10%，說明構樹青貯生成的NH3-N較少，青貯效果較好，且添加劑對NH3-N 的生成具有抑制作用，其中乳酸菌抑制效果最好（圖1c）。

AA-N 含量隨時間延長逐漸增加，各處理組在0～3 d 生成速率較快，由3.73%迅速增加到20%以上，3～45 d較緩慢。不同青貯時間段中AA-N 含量表現(xiàn)為CK 組＞FA 組＞CE 組＞LB 組，CK 組生成量最多，F(xiàn)A 與CE 組間差異不顯著，但都顯著高于LB 組（P＜0.05）。青貯完成時CK 組達到39.38%，CE 組最低（34.01%）（圖1d）。

Peptide-N 含量整體呈現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，在0～1 d 上升但差異不顯著，1～45 d 逐漸降低（P＜0.05），不同青貯時間段peptide-N 含量表現(xiàn)為LB 組＞CE 組＞FA 組＞CK 組，青貯45 d 后LB 組peptide-N 含量顯著高于其余各組（P＜0.05，圖1e）。

TN 含量隨青貯時間的延長逐漸降低，其中1～3 d 顯著降低（CK 除外，P＜0.05），在不同時間段內，除處理3 d，CK 處理的TN 含量在其余時間段低于3 種添加劑處理，且CE 處理7 和15 d 以及LB 處理0、1、3、30 和45 d 均達到最大值，但與其他添加劑處理差異不顯著（圖1f）。

圖1 不同添加劑對構樹青貯飼料氮組分的動態(tài)影響Fig.1 Dynamic effects of different additives on nitrogen components in paper mulberry silage

2.5 隸屬函數(shù)分析及綜合評價

為綜合評價不同添加劑對構樹青貯飼料營養(yǎng)價值、發(fā)酵品質和蛋白質的影響，進行了構樹青貯料各品質指標綜合隸屬函數(shù)分析，依據以下16 個指標的平均隸屬函數(shù)值進行排序，其中，正相關指標是：DM、CP、CA、NDF、LA 和AA，負相關指標是：EE、CF、ADF、WSC、pH、PA、AN/TN、NPN、酸性蛋白酶和羧基肽酶。數(shù)值越大則綜合營養(yǎng)價值越高，從表5可以看出綜合營養(yǎng)價值從高到低為：LB 組＞CE 組＞FA 組＞CK 組。

表5 不同添加劑對構樹青貯飼料營養(yǎng)價值、發(fā)酵品質和蛋白質降解的隸屬函數(shù)分析Table 5 Membership function analysis of different additives on nutritional value，fermentation quality and protein degradation of paper mulberry silage

3 討論

3.1 不同添加劑對構樹青貯飼料營養(yǎng)品質的影響

在青貯過程中，青貯料的保存因植物的呼吸、微生物的蛋白酶活動及脫氨作用等而受到不利影響，進而造成原料營養(yǎng)成分流失［21］。本試驗中，F(xiàn)A 組DM 和WSC 含量最高，且DM 含量顯著高于CK 組，與LB 和CE 組差異不顯著，WSC 含量顯著高于其余各組，而Ash 含量FA 組顯著低于LB 和CE 組，這與于浩然等［22］的研究結果類似，這主要是由于添加甲酸使得青貯料pH 迅速降低，植物呼吸受到抑制，從而保存了更多的DM 和WSC［23-24］。CP 含量在LB 組最高，顯著高于CK 組，但與其余處理組差異不顯著，與董志浩等［25］在對桑葉（Morus alba）青貯時添加乳酸菌的結果一致，可能是由于青貯發(fā)酵中較低的pH 值抑制了微生物的繁殖，而大多微生物多為細菌，失活的細菌主要由蛋白質構成保存在飼料中進而增加其含量［26］。CE 組EE 含量最高，顯著高于其余各組，而CF 和NDF 含量最低，ADF 含量較低，CF 含量在FA、LB 和CE 組間差異不顯著，NDF 含量顯著低于各組，與陳光吉等［27］的研究結果一致，由于纖維素酶對植物細胞壁有降解作用，尤其是對纖維類物質的降解，進而提高能量價值［28］。

3.2 不同添加劑對構樹青貯飼料發(fā)酵品質的影響

pH、有機酸含量、氨態(tài)氮/全氮（AN/TN）是評價青貯料發(fā)酵品質必不可少的指標。當青貯飼料的pH 值低于4.2［29］，乳酸含量范圍在4%～6%［30］，AN/TN 在10%以下時［31］，可以將其評為優(yōu)質飼料。本試驗中，所有處理組pH、乳酸含量和AN/TN 均達到優(yōu)質青貯飼料標準，且pH 值、PA 含量和AN/TN 較CK 組均顯著降低，LA 和AA含量較對照組顯著增加。調制青貯時，常添加甲酸添加劑作為防腐劑抑制有害微生物的滋生，來保證青貯過程中原料的品質，同時甲酸由于自身的酸化作用來降低pH 值，使飼料迅速達到穩(wěn)定狀態(tài)。代寒凌等［32］研究發(fā)現(xiàn)添加劑甲酸處理小黑麥（Triticale rimpau）和黑麥（Secale cereale）青貯能降低pH 值、PA 含量和AN/TN，提高LA 和AA 含量，不產生任何丁酸，本研究結果與此一致。劉輝等［33］對紫花苜蓿青貯研究也得出類似結論。纖維素酶添加劑可將植物細胞壁的結構性多糖降解為單糖，為乳酸菌提供充足的發(fā)酵底物，促進乳酸發(fā)酵，使發(fā)酵品質提高［34］。徐煒等［35］研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿青貯時添加纖維素酶添加劑使pH、PA 含量和AN/TN 降低，LA 和AA 增加，Hristov［36］也得出類似的結論。添加乳酸菌可彌補青貯原料中乳酸菌數(shù)量的不足，當乳酸菌數(shù)量增加時，可有效利用青貯料中的可溶性碳水化合物發(fā)酵產生乳酸，使pH 值迅速降低，抑制有害微生物活動，進而阻止丁酸的產生。Filya 等［37］研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌添加劑可以降低苜蓿青貯pH 和改善發(fā)酵品質，本研究結果與此一致。

3.3 不同添加劑對構樹青貯飼料蛋白酶的動態(tài)影響

青貯過程中的蛋白降解是由植物蛋白酶以及微生物酶共同作用而引發(fā)的牧草蛋白的水解現(xiàn)象［38］。Rooke等［39］和Sullivan 等［40］認為植物蛋白水解酶在牧草萎蔫和青貯過程中對牧草真蛋白的降解發(fā)揮主要作用。酸性蛋白水解酶、羧基肽酶和氨基肽酶是牧草中存在的3 種主要植物蛋白水解酶，植物脫離土壤或其他生存條件后，自身代謝加快后會激活更多的蛋白酶將植物蛋白質水解為小肽、氨基酸和氨態(tài)氮［41］。因此這3 種酶的活力可以代表青貯飼料中蛋白降解的能力，以及潛在的有氧穩(wěn)定性。在本試驗中，酸性蛋白酶和羧基肽酶在青貯0～7 d 內FA 組的酶活性最低，這主要是由于甲酸的快速酸化，pH 迅速下降，使羧基肽酶的活性降至最低，并限制了肽的降解程度［42］。然而這兩種酶在青貯30 d 后，LB 組的酶活性顯著低于其余各組，可能是青貯后期乳酸菌大量繁殖，產酸量增加，導致pH 下降快，抑制了酶活性［43］。CE 組的3 種酶活性較FA 和LB 組高，這可能是由于添加纖維素酶作用下的發(fā)酵底物的水解產物較少［44］。而氨基肽酶活性在添加FA 和LB 后，到青貯第7 天就未檢測到其活性，CE 與CK 組在青貯15 d 時失活，這與代艷［45］的研究結果相似。說明酸性蛋白降解酶和羧基肽酶在整個青貯過程中均對植物蛋白的降解起到了較為重要的作用，而氨基肽酶只在構樹青貯的前7 d 對構樹中植物蛋白的降解起到了分解作用。

3.4 不同添加劑對構樹青貯飼料氮組分的動態(tài)影響

pH 值的大小能反映飼料能否良好的保存［46］，當pH 值下降到4.2 以下時，不僅能抑制不良微生物繁殖，保存更多的營養(yǎng)物質，還使得植物蛋白酶的活性降低，進而抑制蛋白降解［11］。在本試驗中，所有處理組的pH 值在青貯過程中均逐漸降低，這種變化趨勢與前人研究結果一致［47-48］。青貯0～3 d 的pH 下降較快，且FA 組顯著低于其余各組，7 d 以后LB 組pH 最低，這可能是青貯前期甲酸自身的酸性使pH 迅速降低，而后期甲酸酸性減弱，乳酸菌數(shù)量增加，產生更多的乳酸使pH 值降低［49］。

青貯過程中蛋白質會降解為NPN，NH3-N、AA-N、peptide-N 大量生成［41］。TN 在整個青貯過程中呈下降趨勢，這與崔鑫［12］的研究結果相一致，可能是添加劑使構樹中蛋白水解并進一步分解成氨氣或硫化氨等揮發(fā)性物質造成的。添加劑處理會不同程度抑制植物真蛋白降解為NPN［50］，一定程度上會增加青貯飼料中NPN、NH3-N 和AA-N 含量［51］，本試驗中，NPN 含量在青貯前7 d 快速增加，尤其在青貯前1 d 最劇烈，之后緩慢增加，這可能是青貯前期較高的pH 和酶活性使蛋白降解較快［52］。AA-N 首先由植物蛋白酶分解產生，然后在梭菌等微生物的作用下進一步降解為氨以及胺等［14，52］，AA-N 和NH3-N 變化曲線基本一致，都逐漸上升，而前3 d 生成速率快，后期生成緩慢，說明在整個青貯過程中都發(fā)生了蛋白降解［42］。所有處理組的NPN、NH3-N 和AA-N 含量隨時間的延長逐漸增加，且處理組均低于對照組，與葛劍等［53］的研究結果相一致，說明添加劑處理較CK 明顯抑制了蛋白的降解，其中LB 組的效果最好，可能是本試驗中基礎添加糖蜜提供了充足的發(fā)酵底物使乳酸充分發(fā)酵。本試驗中，peptide-N 含量隨時間增加呈先增加后降低趨勢，與Tao 等［54］的研究結果相似。peptide-N 含量在青貯前期的增加可能是由于青貯前期pH 值較高植物蛋白酶活性較高降解蛋白所致，后期逐漸降低是由于微生物蛋白酶利用肽氮進行自身的生長繁殖和降解肽為胺等物質，再者梭菌等有害微生物也能降解肽［42］。其中CK 組peptide-N 含量較其他處理組低，可能是由于所有處理組中CK 組pH 值較高，少許的大腸桿菌及梭菌存活進而降解肽［39］。

4 結論

與對照相比，各添加劑處理對構樹青貯的營養(yǎng)成分含量和發(fā)酵品質均有不同程度的提升作用，對蛋白質降解有明顯的抑制作用，各組構樹青貯飼料的綜合營養(yǎng)價值從高到低依次為：LB 組＞CE 組＞FA 組＞CK 組。