楊彩蓮，童濤，孫明芳，周波

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400016

糖尿病腎病(DKD)以持續(xù)性蛋白尿或腎小球?yàn)V過率(GFR)下降為特征，是導(dǎo)致終末期腎病(ESKD)的主要原因[1-2]。隨著糖尿病發(fā)病率的上升，盡管臨床上使用了各種控制血糖、血壓的藥物，以及生活方式的干預(yù)策略，DKD的發(fā)生率仍不斷增長(zhǎng)[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和多種細(xì)胞因子反應(yīng)均與DKD的發(fā)展密切相關(guān)，但其機(jī)制尚未完全明確[4-7]。多項(xiàng)臨床及流行病學(xué)研究證實(shí)，遺傳因素對(duì)DKD的發(fā)生也有著不可忽視的作用[8-12]。微小RNA(microRNAs，miR)為非編碼小分子RNA，可通過參與調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)而影響各種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展[13-17]，其中miR-30a因在腎臟組織中的高豐度表達(dá)而備受關(guān)注[18-20]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，鋅指轉(zhuǎn)錄因子SNAI1作為miR-30a的潛在靶基因(http://www.targetscan.org/，https://www.mirbase.org/)，在體外高糖環(huán)境誘導(dǎo)的足細(xì)胞上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)過程中明顯上調(diào)，且具有代謝記憶現(xiàn)象[21]。NCBI基因庫數(shù)據(jù)顯示，rs2222722位于miR-30a基因編碼區(qū)，其多態(tài)性可能影響miR-30a的表達(dá)與功能。已有研究證實(shí)，rs2222722基因多態(tài)性與原發(fā)性腎病綜合征[22]及各種腫瘤[23-25]的發(fā)生密切相關(guān)。而rs1543442位于SNAI1基因的3′端非編碼區(qū)，是miR-30a調(diào)控SNAI1基因表達(dá)可能的功能位點(diǎn)，該位點(diǎn)的基因多態(tài)性很可能與SNAI1基因的表達(dá)相關(guān)。鑒于目前尚未見miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442單核苷酸基因多態(tài)性與DKD關(guān)系的報(bào)道，本研究以表觀遺傳調(diào)節(jié)為切入點(diǎn)，采用病例對(duì)照設(shè)計(jì)，探討miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442單核苷酸基因多態(tài)性與中國(guó)重慶地區(qū)2型糖尿病(T2DM)患者發(fā)生DKD的關(guān)系，以及DKD在基因水平的危險(xiǎn)因素，旨在為早期篩查易感患者并進(jìn)行干預(yù)、延緩DKD的發(fā)生和進(jìn)展提供前期依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 納入2018年10月－2019年9月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的520例T2DM患者進(jìn)行回顧性分析，其中240例T2DM合并DKD的患者為病例組，280例T2DM不合并DKD的患者為對(duì)照組。DKD的診斷依據(jù)為2012年KDIGO指南[26]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織公布的糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)，確診為T2DM的患者[27]；(2)年齡≥40歲，漢族，相互無親緣關(guān)系；(3)糖尿病病程≥5年。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有急性應(yīng)激狀態(tài)史如手術(shù)史、高血糖危象、心力衰竭或尿路感染等；(2)有各種腫瘤、活動(dòng)性肝臟疾病、遺傳性疾病或自身免疫性疾病史；(3)有其他原因引起的腎功能損害并影響尿微量白蛋白/肌酐比值(ACR)者。本研究已獲重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2020-480)。

1.2 基因多態(tài)性檢測(cè) 收集外周血400 μl，利用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA blood mini kit，德國(guó)Qiagen公司)提取基因組DNA。使用NanoDrop 2000C分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)測(cè)量基因組DNA的濃度和純度。采用TaqMan-MGB探針等位基因特異性雜交法檢測(cè)miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442的單核苷酸多態(tài)性，反應(yīng)體系包括2 μl DNA、12.5 μl TaqMan PCR酶、10 μl三蒸水、1.0 μl TaqMan FAM探針、1.0 μl TaqMan HEX探針、1 μl正向引物和1 μl反向引物。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，持續(xù)40個(gè)周期。用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的引物和探針由TaKaRa Bio公司提供(RS2222722探針C FAM-TGTACGCTTTAcGCTGT-MGB，探針T HEX-ATGTACGCTTTAtGCTGTT-MGB，正向引物TAGTCTAAGTTCACTCAACTGCAGTATTTG，反向引物GCAAAAGTGACCAAACACAGAAAC；RS1543442探針A FAM-CヰCCCATGGCCAヰ-MGB，探針G HEX-AAGAGGCCTTCCCGTG-MGB，正向引物TTGATGAAGACCATTTTCTGGTTCT，反向引物GATACAAAAACCCACGCAGACA)，擴(kuò)增儀器為CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。隨機(jī)選擇DNA擴(kuò)增樣本，由上海生工生物科技公司進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證TaqMan-MGB法測(cè)定基因型的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，本研究使用的TaqMan-MGB檢測(cè)方法準(zhǔn)確率為100%。

1.3 DKD的危險(xiǎn)因素分析 分析病例組與對(duì)照組各臨床和生化指標(biāo)的差異及miR-30a rs2222722、SNAI1 rs1543442基因型的分布情況，篩選出DKD的危險(xiǎn)因素，對(duì)其臨床特征進(jìn)行分層分析，并分析各臨床特征與估算腎小球?yàn)V過率(eGFR)和ACR的相關(guān)性，然后對(duì)miR-30a rs2222722、SNAI1 rs1543442各基因型對(duì)DKD的發(fā)生是否存在協(xié)同作用進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)兩個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)基因型的分布情況進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的以M(Q1，Q3)表示，對(duì)組間不符合正態(tài)分布的連續(xù)變量的差異性分析采用非參數(shù)檢驗(yàn)法。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用Pearsonχ2檢驗(yàn)。采用logistic回歸分析對(duì)可能影響結(jié)果的混雜因素進(jìn)行調(diào)整，分析miR-30a和SNAI1單核苷酸多態(tài)性與DKD發(fā)生的關(guān)系，采用比值比(OR)和95%可信區(qū)間(CI)表示各變量對(duì)DKD發(fā)生的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床及生化指標(biāo)的差異 與對(duì)照組比較，病例組患者年齡大，收縮壓、脈壓差、纖維蛋白原、C反應(yīng)蛋白和ACR高，糖尿病、高血壓病程長(zhǎng)，吸煙率、飲酒率和eGFR低；而兩組的性別、體重指數(shù)(BMI)、舒張壓、空腹血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血脂等指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 病例組與對(duì)照組一般資料比較Tab.1 Comparison of general characteristics of patients in case and control groups

2.2 miR-30a rs2222722、SNAI1 rs1543442各基因型與DKD的關(guān)系 Logistic回歸分析結(jié)果顯示，在顯性模型中，miR-30a rs2222722 C等位基因攜帶者發(fā)生DKD的風(fēng)險(xiǎn)是T等位基因攜帶者的2.61倍(校正95%CI 1.09～6.27，P=0.032)。在隱性模型中，rs2222722 CC基因型攜帶者發(fā)生DKD的風(fēng)險(xiǎn)是CT或TT基因型攜帶者的2.73倍(校正95%CI 1.61～4.61，P<0.001)。此外，在SNAI1 rs1543442隱性模型中，校正相關(guān)混雜因素后，GG基因型也顯著增加了攜帶者發(fā)生DKD的風(fēng)險(xiǎn)(校正OR=1.70，95%CI 0.73～1.58，P=0.036)(表2)。

表2 mir-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442基因型與DKD的關(guān)系Tab.2 Correlation of miR-30a rs2222722 and SNAI1 rs1543442 genotype with DKD in diabetic patients

2.3 臨床特征分層分析 根據(jù)年齡、性別、糖尿病病程、HbA1c和BMI水平對(duì)兩組研究對(duì)象進(jìn)行分層，分析在不同人群中miR-30a rs2222722(C>T)和SNAI1 rs1543442(G>A)各基因型與DKD之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，miR-30a rs2222722 (C>T)CC基因型與DKD的關(guān)系在較年輕(<65歲)、血糖控制較差(HbA1c>8%)、BMI較低(<24 kg/m2)的研究對(duì)象中更明顯(P<0.05)。SNAI1 rs1543442(G>A)GG基因型與DKD的關(guān)系在男性、糖尿病病程<10年、HbA1c<8%和BMI<24 kg/m2的研究對(duì)象中更明顯(表3)。

表3 臨床特征分層分析miR-30a和SNAI1單核苷酸多態(tài)性與DKD的關(guān)系Tab.3 Stratified analysis of the correlation between the miR-30a SNAI1 SNP and risk of DKD

2.4 miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442基因型與eGFR和蛋白尿的關(guān)系 采用logistic回歸法進(jìn)一步分析miR-30a rs222272和SNAI1 rs1543442不同基因型與eGFR和ACR升高的關(guān)系，校正年齡和性別后發(fā)現(xiàn)，在miR-30a rs2222722(C>T)隱性模型(TT+CTvs.CC)中，CC基因型攜帶者較TT+CT基因型攜帶者更容易發(fā)生eGFR下降(OR=2.13，95%CI 1.37～3.32，P=0.001)及ACR升高(OR=1.59，95%CI 1.08～2.34，P=0.019)，且C等位基因攜帶者發(fā)生eGFR降低(OR=1.59，95%CI 1.15～2.18，P=0.005)及ACR升高(OR=1.43，95%CI 1.07～1.91，P=0.015)的風(fēng)險(xiǎn)也明顯高于T等位基因攜帶者。然而，在SNAI1 rs1543442(G>A)隱性和顯性模型中，均未見與eGFR降低和ACR升高有相關(guān)性(表4)。

表4 miR-30a和SNAI1單核苷酸多態(tài)性與eGFR≤60 ml/(min·1.73 m2)和ACR≥30 mg/g的關(guān)系Tab.4 Correlation between miR-30a, SNAI1 SNP genotypes and the risk of eGFR ≤60 ml/(min·1.73 m2) and ACR≥30 mg/g

2.5 DKD獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-30a rs222272的CC基因型和SNAI1 rs1543442的GG基因型是DKD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表5)。

表5 DKD獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析Tab.5 Analysis on the independent risk factors for DKD

2.6 miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442基因型協(xié)同作用分析 進(jìn)一步分析miR-30a rs222272和SNAI1 rs1543442各基因型間是否存在增加DKD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的協(xié)同作用，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn)基因型間存在協(xié)同作用(P>0.05，表6)。

表6 miR-30a rs2222722和SNAI1 rs1543442基因多態(tài)性對(duì)DKD發(fā)生的協(xié)同作用分析Tab.6 Synergistic effect of miR-30a rs2222722 and SNAI1 rs1543442 polymorphisms on DKD

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，miR-30a rs2222722(C>T)CC基因型與DKD的發(fā)生存在明顯相關(guān)性。在調(diào)整了相關(guān)混雜因素后，CC基因型攜帶者發(fā)生DKD的風(fēng)險(xiǎn)是CT和TT基因型患者的2.73倍；進(jìn)一步探討miR-30a rs2222722基因型與ACR升高和eGFR水平之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CC基因型攜帶者較TT或CT基因型攜帶者更容易發(fā)生ACR升高和eGFR降低。

研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞損傷在DKD的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，而EMT是DKD足細(xì)胞損傷的重要形式[28-31]。細(xì)胞發(fā)生EMT后細(xì)胞間連接和黏附減弱，失去了細(xì)胞極性和原始形態(tài)，而細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移能力則增強(qiáng)[32-33]。足細(xì)胞發(fā)生EMT可能是足細(xì)胞功能障礙、蛋白尿和腎小球硬化的主要原因[30]。miR-30a以各種方式參與細(xì)胞不同的生理生化過程，進(jìn)而影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，其中也包括細(xì)胞EMT過程[34-35]。有研究發(fā)現(xiàn)，在不同類型的腎臟疾病(如DKD、局灶節(jié)段性腎小球硬化和膜增生性腎小球腎炎)中，人體腎臟穿刺活檢發(fā)現(xiàn)miR-30a表達(dá)水平均明顯降低[20]，而足細(xì)胞損傷是這些疾病的重要特征。還有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)阿霉素(ADR)處理后的腎臟足細(xì)胞miR-30a表達(dá)水平明顯降低，當(dāng)外源性給予miR-30a類似物時(shí)，足細(xì)胞上皮標(biāo)記物的表達(dá)則明顯上調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物在miR-30a模擬物的存在下其表達(dá)被抑制；當(dāng)足細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性miR-30a抑制劑時(shí)，其上皮標(biāo)記物的表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)上調(diào)，這表明miR-30a可能對(duì)預(yù)防足細(xì)胞EMT有著不可忽視的作用[36]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)下，miR-30a在小鼠足細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)，而給予外源性miR-30a類似物后，小鼠腎小球及足細(xì)胞損傷得到明顯改善[37]，提示miR-30a對(duì)足細(xì)胞具有保護(hù)作用。

SNAI1 rs1543442的GG基因型也與DKD的發(fā)生相關(guān)，在隱性模型中，rs1543442 GG基因型攜帶者發(fā)生DKD的風(fēng)險(xiǎn)是AA或AG基因型攜帶者的1.70倍。作為miR-30a的一個(gè)潛在靶基因，SNAI1基因鋅指結(jié)構(gòu)域可與鈣黏蛋白E(E-cadherin)啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的CAGGTG序列結(jié)合，導(dǎo)致E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，啟動(dòng)細(xì)胞EMT過程[38]。據(jù)報(bào)道，SNAI1基因活化后通過下調(diào)E-cadherin抑制了腎小管上皮表型相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時(shí)伴有波形蛋白、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原的表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)了腎纖維化，因此，抑制SNAI1基因活性可能對(duì)抑制甚至逆轉(zhuǎn)腎纖維化有重要意義[39]。且已有研究證實(shí)，miR-30a可通過下調(diào)SNAI1的表達(dá)抑制肝星狀細(xì)胞的活化和EMT過程，延緩肝臟纖維化[40]。此外，在糖尿病性白內(nèi)障模型中，miR-30a的上調(diào)可使SNAI1、α-SMA及波形蛋白的表達(dá)水平降低，并抑制高糖和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(TGF-β2)誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT過程[41]。但本研究結(jié)果顯示SNAI1 rs1543442多態(tài)性與患者的ACR升高或eGFR水平無關(guān)；因此，SNAI1與DKD的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。同時(shí)，本研究也未發(fā)現(xiàn)miR-30a rs2222722與SNAI1 rs1543442的多態(tài)性之間存在協(xié)同作用，miR-30a與SNAI1對(duì)足細(xì)胞EMT的影響的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

本研究還根據(jù)患者年齡、性別、糖尿病病程、BMI和HbA1c水平對(duì)各基因型與DKD的相關(guān)性進(jìn)行了分層分析。結(jié)果表明，rs2222722 CC基因型與DKD呈正相關(guān)，且在年齡<65歲、男性、BMI<24 kg/m2、血糖控制不良(HbA1c≥8%)的患者中更明顯。而rs1543442 GG基因型攜帶者與DKD呈正相關(guān)，且在男性、糖尿病病程<10年、HbA1c<8%、BMI<24 kg/m2的患者中更明顯，提示miR-30a和SNAI1基因型與DKD發(fā)生的關(guān)系還與臨床特征有關(guān)。

本研究也存在不足之處：(1)本研究的樣本量較小，應(yīng)招募更多的T2DM患者組成更大的研究隊(duì)列，以提高結(jié)果的代表性；(2)盡管本研究結(jié)果顯示在中國(guó)重慶漢族人群中，miR-30a rs2222722 CC基因型和SNAI1 rs1543442 GG基因型是T2DM患者發(fā)生DKD的危險(xiǎn)因素，但仍需選擇更多的基因位點(diǎn)來驗(yàn)證目標(biāo)基因單核酸多態(tài)性與DKD之間的關(guān)系；(3)目前尚未有其他探討miR-30a和SNAI1基因多態(tài)性與DKD關(guān)系的研究，本研究結(jié)果仍需在其他人群中進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，本研究在中國(guó)重慶人群中發(fā)現(xiàn)miR-30a rs2222722(C>T)CC基因型和SNAI1 rs1543442(G>A)GG基因型與T2DM患者DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外，miR-30a rs2222722 CC基因型與eGFR降低和ACR升高也有密切聯(lián)系，但尚需更大樣本、多中心、前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。