＊張?chǎng)?裘雨妮 周家杰

（浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院 浙江 310015）

1.引言

隨著人口的快速增長(zhǎng)和世界經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，全球化石燃料消耗量逐年增加，石油資源儲(chǔ)備已經(jīng)到了瀕臨枯竭的地步。面對(duì)煤、石油、天然氣等不可再生能源的枯竭，以及化石燃料的燃燒，二氧化碳不斷地排放致使全球變暖，給我們的環(huán)境帶來(lái)威脅，尋找新能源替代已經(jīng)成為必須解決的問(wèn)題?？稍偕剂仙镆掖?，被認(rèn)為是一種能有效替代化石燃料的理想新能源[1-2]。生物乙醇作為能夠循環(huán)利用的能源，對(duì)于未來(lái)能源結(jié)構(gòu)、能源安全的提升具有重要的戰(zhàn)略意義。進(jìn)入2l世紀(jì)，我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展面臨的許多種不同的問(wèn)題越來(lái)越突出，開(kāi)發(fā)生物乙醇作為化石能源的替代品，節(jié)省消耗，這種戰(zhàn)略舉措是我國(guó)解決能源問(wèn)題的重要措施。乙醇燃料具有燃燒更徹底、CO2排放較低、燃燒性能較好等優(yōu)良特性，成為21世紀(jì)的“綠色能源”。世界各國(guó)正加快生物乙醇研究開(kāi)發(fā)與推廣應(yīng)用的步伐[3-4]。

目前玉米、甘蔗等農(nóng)作物是用來(lái)提取生物質(zhì)乙醇的重要原料，生物燃料在很大程度上是地上作物，而全球農(nóng)業(yè)產(chǎn)品價(jià)格可能會(huì)上漲，僅靠這種途徑難以實(shí)現(xiàn)新能源的替代，必須開(kāi)發(fā)更多的可持續(xù)的生物質(zhì)能源原料，許多研究人員正在尋找替代生物質(zhì)資源生產(chǎn)生物乙醇[5]。藻類(lèi)生物乙醇被認(rèn)為是下一代生物燃料來(lái)源。海藻是能夠進(jìn)行光合作用的海洋生物，它們將陽(yáng)光、水和二氧化碳轉(zhuǎn)變成為藻類(lèi)的生物需要，這使許多藻類(lèi)富含碳水化合物，而碳水化合物是生產(chǎn)生物能源的基本原料。海洋藻類(lèi)資源是很豐富的，海洋占地球面積約70%，占到整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的90%，海洋中的藻類(lèi)為生物產(chǎn)業(yè)能夠工業(yè)化生產(chǎn)提供了取之不盡用之不竭的資源來(lái)源。大型海藻如海帶僅需要光照和一些簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就能在海水中很好的生長(zhǎng)；大型海藻作為替代性再生能源的發(fā)展?jié)摿薮骩6]。但是大型海藻如褐藻中的主要成分海藻酸難以降解，使得褐藻的乙醇轉(zhuǎn)化效率較低。

我國(guó)另外一些主要的經(jīng)濟(jì)藻類(lèi)如馬尾藻，因其海藻酸含量為30%，故廣泛應(yīng)用于海藻酸的工業(yè)生產(chǎn)中。海藻酸的降解是海藻乙醇生產(chǎn)面臨的主要技術(shù)問(wèn)題及瓶頸[7]。在前期研究中，課題組通過(guò)篩選獲得了能降解海藻酸的酵母菌[8]，在本研究中，利用該種酵母菌進(jìn)行海藻乙醇發(fā)酵，并針對(duì)海藻的乙醇發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵酶進(jìn)行研究，以為海藻的乙醇發(fā)酵生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

2.實(shí)驗(yàn)材料與方法

（1）實(shí)驗(yàn)材料：野生海藻。

（2）菌株來(lái)源：實(shí)驗(yàn)室篩選獲得酵母菌[8]。

（3）培養(yǎng)基：

活化斜面培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母粉1%，海藻酸鈉2%，瓊脂2%。

YPD液體培養(yǎng)基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。

馴化培養(yǎng)基：硫酸銨10.8g/L，磷酸二氫鉀5.0g/L，硫酸鎂1.1g/L，海藻酸鈉20g/L。

海藻發(fā)酵液培養(yǎng)基：硫酸銨10.8g/L，磷酸二氫鉀5.0g/L，硫酸鎂1.1g/L，海藻20g/L。

（4）海藻發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：首先對(duì)保存菌株進(jìn)行活化，并用YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以10%的接種量轉(zhuǎn)接到馴化培養(yǎng)基中，進(jìn)行兩輪馴化培養(yǎng)，每輪馴化培養(yǎng)的時(shí)間為48h。然后以10%的接種量接種到海藻發(fā)酵培養(yǎng)基中，因發(fā)酵為厭氧發(fā)酵，故在接入種子后的第二天用保鮮膜密封瓶口。

（5）酶活力檢測(cè)方法：

①丙酮酸脫羧酶酶活檢測(cè)

取發(fā)酵液上清液30mL，在3500rpm下離心20min，用10mmol/L磷酸鈉且含有2mmol EDTA的緩沖液洗2次，取沉淀，用EDTA-磷酸鈉緩沖液沖洗沉淀，使其重懸，在3500rpm下離心20min，離心后用適量的100mmol磷酸鈉且含2mmol MgC12的緩沖液重懸，進(jìn)行超聲波破碎，全程時(shí)間為10min，超聲時(shí)間是1s，間隔時(shí)間是1s，溫度25℃，離心，取上清液即可用于丙酮酸脫羧酶活性的測(cè)定。分別吸取2.7mL 200mmol/L檸檬酸緩沖液，0.1mL 1moL/L丙酮酸鈉溶液，0.1mL 6.4mmol/L β-NADH于比色皿中（因發(fā)酵液中發(fā)酵菌株內(nèi)已有乙醇脫氫酶且含量高于實(shí)驗(yàn)要求故實(shí)驗(yàn)中無(wú)需加入乙醇脫氫酶）。在空白對(duì)照的比色皿中加入2.8mL 200mmol/L檸檬酸緩沖液和0.1mL 1mol/L丙酮酸鈉溶液，同時(shí)兩者都加入0.1mL細(xì)胞抽提物，迅速混合均勻，在340nm波長(zhǎng)下進(jìn)行變化，每15s記錄一個(gè)數(shù)據(jù)，待吸光度值趨于穩(wěn)定時(shí)，記下吸光度值的減少量以及這個(gè)過(guò)程所用的時(shí)間，得到每分鐘減少的吸光度值，然后計(jì)算出比酶活。

②乙醇脫氫酶的酶活檢測(cè)

取發(fā)酵液上清液40mL，離心（4000rpm/min，20min），沉淀用0.066mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液洗滌2～3次。加入含有5% 50mmol/L的Tris-HCl（pH值8.0）、0.2% 1mmol/L的EDTA、2% 100mmol/L的NaCl緩沖溶液，用超聲波破碎法進(jìn)行細(xì)胞破碎，每超聲1s間歇3s，320W作用15min。4000rpm/min離心15min，取上清液，4℃保藏為粗酶液。于石英比色皿中加入3mL 0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液、0.4mL 0.05mol/L的NAD+溶液、0.4mL 17mol/L的乙醇溶液，混勻，再加入0.2mL粗酶液，快速混勻后立即在340nm處測(cè)定吸光度值，空白對(duì)照用蒸餾水代替加NAD+，其余均相同，每隔30s讀一次吸光度值，進(jìn)行酶活的計(jì)算。

③海藻酸裂解酶的酶活檢測(cè)

取發(fā)酵液上清液，4000rpm離心15min，取上清液用0.22μm的濾膜過(guò)濾，即粗酶液，4℃保存。取0.5mL粗酶液加入到盛有0.5mL 0.5%海藻酸鈉底物（將海藻酸鈉溶于0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，pH7.5）的試管中，混勻，于40℃水浴反應(yīng)10min，對(duì)照組中的酶液用去離子水代替。還原糖的測(cè)定采用DNS（3.5-硝基水楊酸）法。在1mL反應(yīng)液中加入1mL DNS溶液，沸水浴反應(yīng)5min后，流水冷卻，定容至25mL。以蒸餾水為空白，應(yīng)用分光光度計(jì)在520nm下測(cè)定吸光度。與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相比較，計(jì)算還原糖的產(chǎn)生量。酶活力單位定義為：酶液在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖所需要的酶量。

3.結(jié)果與討論

(1)丙酮酸脫羧酶研究

首先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行一定的預(yù)處理，得到含有丙酮酸脫羧酶的粗酶液，分別吸取2.7mL 200mmol/L檸檬酸緩沖液，0.1mL 1moL/L丙酮酸鈉溶液，0.1mL 6.4mmol/L β-NADH，0.05mL 200U/L乙醇脫氫酶溶液于比色皿中。在空白對(duì)照的比色皿中加入2.8mL 200mmol/L檸檬酸緩沖液和0.1mL 1mol/L丙酮酸鈉溶液，同時(shí)兩者都加入0.1moL細(xì)胞抽提物，迅速混合均勻，在340nm波長(zhǎng)下測(cè)定，每15s記錄一個(gè)數(shù)據(jù)，記錄7min共28個(gè)數(shù)據(jù)，從而計(jì)算出吸光度。待吸光度值穩(wěn)定后，記錄從開(kāi)始到穩(wěn)定時(shí)吸光度的變化數(shù)值和在變化過(guò)程中所用去的時(shí)間，得到每分鐘吸光度的減少值。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)對(duì)在發(fā)酵過(guò)程中3（0.400U/mL）、4（1.000U/mL）、5（1.500U/mL）、6（1.900U/mL）、7（1.200U/mL）天的發(fā)酵液進(jìn)行丙酮酸脫羧酶活性的測(cè)定數(shù)據(jù)，畫(huà)出丙酮酸脫羧酶在發(fā)酵過(guò)程中含量的變化趨勢(shì)圖如圖1。

圖1 丙酮酸脫羧酶活性變化趨勢(shì)

分析：

由丙酮酸脫羧酶活性變化趨勢(shì)圖可以看出在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)丙酮酸脫羧酶活性逐漸升高，當(dāng)在第6天時(shí)酶活力值最高，最高為1.900U/mL，在達(dá)到最高值后第7天酶活力降低。丙酮酸脫羧酶是控制丙酮酸進(jìn)一步代謝的主要依賴(lài)酶，其活性成為能否積累丙酮酸的關(guān)鍵之一，據(jù)此推測(cè)第6天時(shí)發(fā)酵液中丙酮酸的含量開(kāi)始下降，此推斷很好的契合了發(fā)酵液中丙酮酸含量的變化。

(2)海藻酸裂解酶研究

①海藻酸裂解酶活性測(cè)定

對(duì)發(fā)酵液在3天、4天、5天、6天、7天分別進(jìn)行海藻酸裂解酶活性的研究，首先進(jìn)行粗酶液的制取，分別取不同天的粗酶液0.5mL加入到盛有0.5mL 0.5%海藻酸鈉底物（將海藻酸鈉溶于0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，pH7.5）的試管中，混勻，于40℃水裕中反應(yīng)10min，對(duì)照組中的酶液用去離子水代替。以反應(yīng)液中還原糖的增加量作為檢測(cè)活力的指標(biāo)，對(duì)于還原糖的增加量應(yīng)用DNS法進(jìn)行測(cè)量，根據(jù)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=1.3627x+0.0167得出還原糖的含量，根據(jù)酶活定義：酶液在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1μg（1μg=0.000001g）還原糖所需要的酶量可以計(jì)算出酶活。

根據(jù)對(duì)在發(fā)酵過(guò)程中3天（18.4U/mL）、4天（37.3U/mL）、5天（48.4U/mL）、6天（41.6U/mL）、7天（29.8U/mL）的發(fā)酵液進(jìn)行海藻酸裂解酶活性的測(cè)定數(shù)據(jù)，畫(huà)出海藻酸裂解酶在發(fā)酵過(guò)程中含量的變化趨勢(shì)圖如圖2。

圖2 海藻酸裂解酶活性變化趨勢(shì)

分析：

由上表可知在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液當(dāng)中海藻酸裂解酶活性不是太高，其原因可能是提取的粗酶液僅僅是產(chǎn)生在胞外的一部分酶，而且由于時(shí)間限制，沒(méi)有進(jìn)行純化，故酶活力較低，由趨勢(shì)圖可以看出海藻酸裂解酶在開(kāi)始發(fā)酵時(shí)（3天時(shí)）酶活不是很高，而在發(fā)酵4-5天時(shí)酶活明顯升高，第5天時(shí)達(dá)到最高為48.4U/mL，此時(shí)發(fā)酵液當(dāng)中海藻酸裂解旺盛，用于乙醇生產(chǎn)的糖供應(yīng)豐富，在6-7天時(shí)酶活降低表明海藻酸裂解減少，菌的活性降低，菌開(kāi)始死亡。

②判定EDTA對(duì)酶活力的影響

分別測(cè)定添加EDTA（乙二胺四乙酸）和未添加EDTA的海藻酸裂解酶粗酶液反應(yīng)體系的吸光度值：做三個(gè)平行試驗(yàn)，用同批發(fā)酵的三瓶相同發(fā)酵液分別提取粗酶進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：添加EDTA的酶液活力明顯低于未添加EDTA的酶液，證明EDTA能夠減弱海藻酸裂解酶的活性，但是并沒(méi)有使海藻酸裂解酶完全失活，推測(cè)可能是由于EDTA的添加量不夠，或是其未全部溶于溶液中，因?yàn)镋DTA不溶于水，需調(diào)pH至7.5才能將其溶解。

(3)乙醇脫氫酶研究

對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行乙醇脫氫酶活性變化的研究，乙醇脫氫酶是胞內(nèi)酶，因此需要破碎細(xì)胞提取酶，但是由于時(shí)間和技術(shù)限制，無(wú)法對(duì)其進(jìn)行純化，故粗酶液活力較低。通過(guò)計(jì)算可知5天發(fā)酵液的粗酶液酶活力125U/mL粗酶液。同理，在發(fā)酵3天、4天、6天及7天也進(jìn)行了酶活力測(cè)定，分別為71.1U/mL，94.8U/mL，111.4U/mL和97.2U/mL。繪制酶活力變化趨勢(shì)圖，如圖3。

圖3 乙醇脫氫酶活性變化趨勢(shì)

分析：

由表可以看出乙醇脫氫酶在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)（發(fā)酵第3天時(shí)）酶活很小，而在發(fā)酵第4、5天時(shí)酶活迅速上升，同時(shí)此時(shí)也是產(chǎn)生乙醇的重要時(shí)間，6天后酶活開(kāi)始降低，此時(shí)海藻酸裂解變少，乙醇產(chǎn)生量降低，菌體開(kāi)始進(jìn)入死亡狀態(tài)。

4.結(jié)論

對(duì)發(fā)酵過(guò)程中三種關(guān)鍵酶的研究中，在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)丙酮酸脫羧酶活性逐漸升高，在第6天時(shí)酶活力值最高，最高為1.9U/mL，第7天酶活力降低。丙酮酸脫羧酶是控制丙酮酸進(jìn)一步代謝的主要依賴(lài)酶，此數(shù)據(jù)很好的契合了發(fā)酵液中丙酮酸含量的變化；可以看出海藻酸裂解酶在開(kāi)始發(fā)酵時(shí)（3天時(shí)）酶活不是很高，而在發(fā)酵4-5天時(shí)酶活明顯升高，第5天時(shí)達(dá)到最高為48.4U/mL，此時(shí)發(fā)酵液當(dāng)中海藻酸裂解旺盛，用于乙醇生產(chǎn)的糖供應(yīng)豐富，在6-7天時(shí)酶活降低表明海藻酸裂解減少，菌的活性降低，菌開(kāi)始死亡，而EDTA對(duì)于海藻酸裂解酶的活性具有一定的抑制作用，會(huì)降低酶活；乙醇脫氫酶在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)（發(fā)酵第3天時(shí)）酶活很小，在發(fā)酵第4、5天時(shí)酶活迅速上升，第5天時(shí)酶活達(dá)到最高為125U/mL同時(shí)也是產(chǎn)生乙醇的重要時(shí)間，6天后酶活開(kāi)始降低，此時(shí)海藻酸裂解變少，乙醇產(chǎn)生量降低，菌體開(kāi)始進(jìn)入死亡狀態(tài)。