梅偉英，陸煒青，陳韞煒，梅文星，申春悌

(常州市中醫(yī)醫(yī)院 呼吸科，江蘇 常州 213000)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是以慢性或頑固性咳嗽為特征的呼吸系統(tǒng)常見疾病，其發(fā)病機(jī)理主要為持續(xù)氣道高反應(yīng)性及炎性反應(yīng)，灰塵、冷空氣、油煙等為常見發(fā)病誘因，CVA是兒童與成人慢性咳嗽的主要類型[1-2]。目前CVA的臨床治療以支氣管擴(kuò)張劑、糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗劑及擴(kuò)張支氣管平滑肌、改善氣道痙攣?zhàn)饔玫乃幬餅橹?，但此類藥物長期使用存在毒副作用，且停藥后易復(fù)發(fā)[3]。

中醫(yī)藥治療注重辨證論治、標(biāo)本兼治，在改善癥狀、減輕西藥毒副作用、提高生活質(zhì)量等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在CVA的臨床治療中被逐漸重視。CVA在中醫(yī)學(xué)屬“咳嗽”“哮喘”“久咳”等范疇，臨床治療常從祛風(fēng)滌痰、宣肺化飲等著手。江蘇省名中醫(yī)申春悌教授在中醫(yī)藥治療肺系疾病方面積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，其臨床治療咳喘常以祛風(fēng)化痰為法，擅長使用射干、麻黃配伍治療CVA。中藥射干，為鳶尾科植物射干的干燥根莖，味苦性寒，入肺經(jīng)；麻黃，為麻黃科麻黃屬植物的草質(zhì)莖，性溫味辛微苦，入肺與膀胱經(jīng)。射干、麻黃配伍為《金匱要略》主治寒痰郁肺之咳喘的射干麻黃湯中的君藥，“咳而上氣，喉中水雞聲，射干麻黃湯主之”，具有溫肺化飲、下氣祛痰之功效。射干與麻黃在現(xiàn)代咳嗽、哮喘等呼吸系統(tǒng)急性病的中醫(yī)藥治療中被廣泛配伍應(yīng)用[4]。研究表明，射干、麻黃配伍治療CVA具有明確療效[5]，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、分子機(jī)制等目前尚未明確。

本研究擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，立足中醫(yī)藥辨證論治理論，結(jié)合申春悌教授臨床經(jīng)驗(yàn)，通過篩選，預(yù)測(cè)射干、麻黃活性成分治療CVA的可能作用靶點(diǎn)基因，預(yù)測(cè)其參與的生物學(xué)過程與信號(hào)通路，嘗試探究其潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 射干-麻黃活性成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)分別收集中藥射干(Belamcandae Rhizoma)、麻黃(Ephedrae Herba)的活性成分，以中藥的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)>30%、類藥性(drug like，DL)>0.18為藥動(dòng)學(xué)(ADME)篩選條件[6-8]，篩選獲得射干、麻黃有效活性成分，并下載相關(guān)成分的TCMSP疾病預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.2 CVA靶點(diǎn)基因收集

以“cough variant asthma”為主題詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)檢索目前公認(rèn)的CVA疾病靶點(diǎn)基因，下載靶點(diǎn)信息進(jìn)行整理。

1.3 射干-麻黃調(diào)控CVA的藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將預(yù)測(cè)的射干-麻黃有效活性成分作用疾病靶點(diǎn)，與GeneCards獲得的CVA疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入R軟件中，對(duì)靶點(diǎn)信息取交集，獲得射干-麻黃活性成分直接作用的CVA疾病靶點(diǎn)，并與射干-麻黃有效活性成分共同導(dǎo)入至生物醫(yī)學(xué)網(wǎng)絡(luò)可視化工具CytoScape軟件中，以中藥名稱、活性成分、CVA靶點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)(Node)，關(guān)聯(lián)關(guān)系為邊線(Edge)[9]，構(gòu)建射干-麻黃活性成分調(diào)控CVA的藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 目標(biāo)靶點(diǎn)基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

將獲得的射干-麻黃有效活性成分作用的CVA疾病靶點(diǎn)基因上傳至String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，選擇物種為人類(Homo Sapiens)，進(jìn)行靶點(diǎn)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 目標(biāo)靶點(diǎn)基因本體與KEGG信號(hào)通路富集分析

使用R軟件Bioconductor生物醫(yī)學(xué)分析工具包對(duì)獲得的射干-麻黃有效活性成分作用的CVA疾病靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)[10]和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[11]信號(hào)通路富集分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，預(yù)測(cè)目標(biāo)靶點(diǎn)基因可能參與的生物學(xué)功能注釋過程與分子信號(hào)通路，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 射干-麻黃有效活性成分與作用疾病靶點(diǎn)收集

通過TCMSP平臺(tái)共檢索獲得射干活性成分56個(gè)、麻黃活性成分363個(gè)，根據(jù)研究設(shè)定的OB>30%、DL>0.18藥動(dòng)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)射干-麻黃活性成分進(jìn)行篩選，剔除兩藥物的共有成分后，獲得射干-麻黃有效活性成分30個(gè)，預(yù)測(cè)疾病靶點(diǎn)基因110個(gè)，結(jié)果如表1所示。

2.2 射干-麻黃調(diào)控CVA疾病靶點(diǎn)基因獲取

從GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索獲得CVA疾病靶點(diǎn)基因2083個(gè)，與上述獲得的射干-麻黃有效活性成分作用疾病靶點(diǎn)基因110個(gè)進(jìn)行取交集計(jì)算，最終獲得射干-麻黃活性成分調(diào)控CVA目的靶點(diǎn)基因75個(gè)，結(jié)果以維恩圖呈現(xiàn)，見圖1。

圖1 射干-麻黃活性成分調(diào)控CVA目的靶點(diǎn)基因Fig.1 Venn diagram of the GeneCards cough-variant asthma targets and targets of Belamcandae Rhizomea-Ephedrae Herba couple medicine

2.3 射干-麻黃活性成分-CVA靶點(diǎn)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將2.2節(jié)篩選獲得的射干-麻黃有效活性成分與其調(diào)控的CVA疾病靶點(diǎn)基因信息導(dǎo)入至CytoScape軟件中，構(gòu)建射干-麻黃活性成分-CVA靶點(diǎn)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。如圖2所示，麻黃、射干與各自有效活性成分及CVA疾病靶點(diǎn)基因通過邊線相連接構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)，靶點(diǎn)基因中PTGS1、NCOA2分別與25、21個(gè)射干-麻黃有效活性成分相聯(lián)系，受到多個(gè)活性成分的直接調(diào)控作用，為靶點(diǎn)基因中度值(degree)最高的2個(gè)基因；中藥活性成分中山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、毛地黃黃酮(luteolin)等與較多CVA靶點(diǎn)基因存在直接聯(lián)系，可能是射干-麻黃發(fā)揮重要藥理學(xué)作用的主要成分。

2.4 目標(biāo)靶點(diǎn)基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將獲得的75個(gè)射干-麻黃調(diào)控的CVA靶點(diǎn)基因上傳至String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI分析，結(jié)果如圖3所示。75個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)基因編碼的蛋白彼此通過邊線相連接形成網(wǎng)絡(luò)，每一條邊線代表相應(yīng)基因編碼的蛋白間存在生物學(xué)功能互相作用的關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，度值為18.5，局部聚類置信度為0.612，未形成局部聚類，僅形成單一網(wǎng)絡(luò)聚類。

將String數(shù)據(jù)庫的PPI分析結(jié)果下載保存，導(dǎo)入至CytoScape軟件重新構(gòu)建目標(biāo)靶點(diǎn)基因編碼的蛋白之間的PPI網(wǎng)絡(luò)，使用CytoHubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行度值計(jì)算分析，獲得在該網(wǎng)絡(luò)中度值最高的10個(gè)關(guān)鍵蛋白，編碼該蛋白的基因則為射干-麻黃活性成分調(diào)控CVA的關(guān)鍵基因，結(jié)果見圖4。CytoHubba從射干-麻黃活性成分調(diào)控的75個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)基因中篩選獲得了10個(gè)關(guān)鍵基因，排名為：IL6、VEGFA、EGFR、CASP3、MAPK8、CCND1、ESR1、MYC、FOS、RELA。

圖4 關(guān)鍵基因排名結(jié)果Fig.4 Ranking of the hub genes

2.5 目標(biāo)靶點(diǎn)基因GO與KEGG分析

將獲得的射干-麻黃活性成分調(diào)控的CVA靶點(diǎn)基因整理，導(dǎo)入至R軟件，運(yùn)行Bioconductor工具包進(jìn)行GO生物學(xué)過程富集分析與KEGG信號(hào)通路富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，75個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)基因共富集于98個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)的GO生物學(xué)過程，根據(jù)P值從小到大進(jìn)行排列，主要生物學(xué)過程包括核受體活性、直接配體調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、甾體激素受體活性、類固醇結(jié)合等。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，靶點(diǎn)基因共富集于215條KEGG信號(hào)通路，其中110條經(jīng)檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，按照P值從小到大排列，排名前5位的是PI3K-Akt信號(hào)通路、腫瘤中的微小RNA、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染。分別將GO與KEGG富集分析結(jié)果可視化呈現(xiàn)，結(jié)果見圖5～6。

圖5 目標(biāo)靶點(diǎn)基因GO富集分析Fig.5 Gene ontology enrichment analysis of the target genes

圖6 目標(biāo)靶點(diǎn)基因KEGG富集分析Fig.6 Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway enrichment analysis of the target genes

3 討論

CVA常因冷空氣、灰塵等因素誘發(fā)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)持續(xù)或陣發(fā)性的干咳，難以停止。兒童CVA治療不當(dāng)、不及時(shí)可能進(jìn)一步發(fā)展為典型哮喘發(fā)作，CVA嚴(yán)重影響患者的日常生活質(zhì)量。中醫(yī)藥治療立足整體觀念與辨證論治，具有簡便廉驗(yàn)的特點(diǎn)，在CVA的臨床治療中與西藥配合，能夠發(fā)揮出良好的功效。

本研究立足于射干-麻黃配伍辨證治療CVA，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)理論方法及在線分析工具，對(duì)其有效活性成分調(diào)控CVA疾病靶點(diǎn)基因的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)及潛在分子機(jī)制展開探索。首先根據(jù)中藥口服生物利用度、類藥性等藥動(dòng)學(xué)原則，從TCMSP平臺(tái)篩選獲得射干-麻黃有效活性成分30個(gè)，對(duì)應(yīng)不同疾病靶點(diǎn)110個(gè)；從GeneCards疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫篩選獲得CVA的疾病靶點(diǎn)基因，經(jīng)過取交集處理得到射干-麻黃活性成分可能產(chǎn)生直接調(diào)控作用的CVA疾病靶點(diǎn)基因75個(gè)；將上述獲得的射干-麻黃有效活性成分與目標(biāo)靶點(diǎn)基因進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建分析。從網(wǎng)絡(luò)中可知，射干-麻黃的多個(gè)不同有效活性成分分別與多個(gè)不同的CVA靶點(diǎn)基因相聯(lián)系，而同一個(gè)靶點(diǎn)亦可能同時(shí)受到多個(gè)不同活性成分的作用，提示射干-麻黃治療CVA的多成分、多靶點(diǎn)、網(wǎng)絡(luò)調(diào)控特點(diǎn)。

靶點(diǎn)基因是藥物活性成分發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵對(duì)象。從目標(biāo)靶點(diǎn)基因編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系可見，獲得的75個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)基因彼此均存在密切聯(lián)系，網(wǎng)絡(luò)中無分散的聚類產(chǎn)生，平均每個(gè)靶點(diǎn)基因的度值為18.5，提示彼此之間平均與18個(gè)以上的不同靶點(diǎn)基因相聯(lián)系，共同發(fā)揮重要的生物學(xué)功能作用。進(jìn)一步通過CytoHubba插件分析計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)中基因的度值大小，篩選出網(wǎng)絡(luò)中度值最高的10個(gè)關(guān)鍵基因。靶點(diǎn)基因中C反應(yīng)蛋白(CRP)、花生四烯酸5-脂加氧酶(ALOX5)、關(guān)鍵基因白介素6(IL6)等是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的重要炎癥因子，在大量相關(guān)炎癥反應(yīng)中被廣泛研究；關(guān)鍵基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)、表皮生長因子受體(EGFR)等廣泛參與氣道重塑并與炎癥細(xì)胞的募集相關(guān)；關(guān)鍵基因雌激素受體1(ESR1)、核受體輔活化子2(NCOA2)等則是參與多種受體激活活動(dòng)反應(yīng)的重要因子。靶點(diǎn)基因彼此聯(lián)系，在不同的信號(hào)通路中發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)功能。射干-麻黃有效活性成分可能通過調(diào)控CVA目標(biāo)靶點(diǎn)基因，發(fā)揮對(duì)多個(gè)與CVA發(fā)病病理機(jī)制相關(guān)的信號(hào)通路的介導(dǎo)調(diào)控作用，從而達(dá)到治療的目的。

從目標(biāo)靶點(diǎn)基因的GO生物學(xué)過程、KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果來看，射干-麻黃活性成分調(diào)控的75個(gè)CVA靶點(diǎn)基因共富集于98個(gè)生物學(xué)過程、110條信號(hào)通路，涉及氣道炎癥反應(yīng)與氣道高反應(yīng)性調(diào)控、自身免疫反應(yīng)、病毒感染、類固醇激素受體結(jié)合活動(dòng)等CVA病理與治療相關(guān)過程。氣道炎癥反應(yīng)與氣道高反應(yīng)性是CVA發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，CRP、IL6等炎癥因子水平在CVA發(fā)病中顯著升高，糖皮質(zhì)激素對(duì)氣道局部炎癥反應(yīng)的抑制作用顯效明顯[12]，射干-麻黃配伍的方劑治療CVA研究中發(fā)現(xiàn)CRP、IL4等炎癥因子水平明顯下降[13]，靶點(diǎn)基因富集于類固醇結(jié)合、甾體激素活性等過程，提示射干-麻黃有效活性成分可能通過調(diào)控IL3、IL6等炎癥因子信號(hào)通路發(fā)揮抑制局部炎癥、發(fā)揮類糖皮質(zhì)激素作用。目前臨床常以β受體激動(dòng)劑、白三烯受體拮抗劑等藥物擴(kuò)張支氣管平滑肌、緩解氣道痙攣治療CVA，研究表明麻黃堿等成分可能通過ALOX5等靶點(diǎn)基因參與的白三烯受體相關(guān)通路調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)以減輕氣道反應(yīng)性[14-15]。機(jī)體免疫調(diào)節(jié)是CVA發(fā)病的另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，有研究認(rèn)為類似過敏反應(yīng)為機(jī)體免疫功能的異常表現(xiàn)，目的靶點(diǎn)基因富集于CD8+T細(xì)胞調(diào)節(jié)通路、自身免疫系統(tǒng)等信號(hào)通路，提示射干-麻黃活性成分可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)調(diào)控CVA的病理發(fā)生，亦有研究表明麻黃成分可改善機(jī)體免疫功能[16]。皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒等感染是呼吸系統(tǒng)疾病的常見病因，病毒感染可誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，不少CVA反復(fù)發(fā)作的病因即為呼吸系統(tǒng)的慢性病毒感染所致[17]，射干-麻黃活性成分參與調(diào)控病毒感染相關(guān)相號(hào)通路，可能是CVA病理機(jī)制研究的新方向。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論方法，揭示了射干-麻黃配伍治療CVA潛在的有效活性成分-疾病靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并預(yù)測(cè)目標(biāo)靶點(diǎn)基因可能參與的相關(guān)生物學(xué)過程與信號(hào)通路。研究結(jié)果提示射干-麻黃治療CVA存在多成分、多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路、多生物學(xué)過程的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制特點(diǎn)，提出射干-麻黃可能通過抑制氣道炎癥反應(yīng)與高反應(yīng)性、調(diào)節(jié)自身免疫功能、干預(yù)病毒感染活動(dòng)等環(huán)節(jié)發(fā)揮治療作用的觀點(diǎn)，希望能為后續(xù)具體實(shí)驗(yàn)研究提供方向。