房 巖，孫 剛，邱澤奎，藍(lán) 藍(lán)，龍 彪，黃俊江

(1.三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院 藥用植物開(kāi)發(fā)利用福建省高校工程研究中心 福建省資源環(huán)境監(jiān)測(cè)與可持續(xù)經(jīng)營(yíng)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三明 365004；2.長(zhǎng)春師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130032；3.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002)

生物醫(yī)用材料越來(lái)越多地用于人工器官、再生組織誘導(dǎo)、藥物送達(dá)釋放、外科修復(fù)、治療診斷等領(lǐng)域[1]，而優(yōu)良的血液相容性是生物醫(yī)用材料植入人體的基本要求。血液相容性是指生物材料表面對(duì)血栓形成的抑制能力和血液正常生理功能的保持能力，包括降低血小板黏附和激活、減小紅細(xì)胞溶血率、延長(zhǎng)凝血時(shí)間等[2]。伴隨著組織工程學(xué)的深入研究，人們追求更加穩(wěn)定、性能更加優(yōu)異、免疫原性更低、更加耐生物老化、與人體環(huán)境更加一致的生物材料，將人工智能、納米技術(shù)、仿生原理、藥物控釋技術(shù)相結(jié)合，向智能化、生命化、多功能化的方向發(fā)展[3]。經(jīng)過(guò)數(shù)十億年的生命進(jìn)化和協(xié)同演化，生命體形成具有特殊微納結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、浸潤(rùn)性、黏附性和光學(xué)特性的天然表面[4-5]。以生物體表為模板，設(shè)計(jì)不同表面結(jié)構(gòu)的新型醫(yī)用材料，成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[6-7]。本文在前期工作的基礎(chǔ)上[8-10]，制備具有昆蟲(chóng)翅微觀結(jié)構(gòu)和良好血液相容性的高分子仿生膜，探討表面粗糙形貌與血液相容性之間的作用關(guān)系，為抗凝血特種功能性生物材料的選擇、優(yōu)化、控制及制備提供可參考的研究方法和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取中華稻蝗(Oxyachinensis)、棉蝗(Chondracrisrosearosea)和東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)等3種昆蟲(chóng)翅為模板，使用聚乙烯醇(PVA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))、PDMS(Dow Corning 184，美國(guó))為基材。剪取洗凈干燥的翅和PDMS膜(3 mm×3 mm)備用。有機(jī)試劑均為分析純(AR)。

1.2 方法

1.2.1 仿生膜的制備

按質(zhì)量比1∶10稱(chēng)取PVA與蒸餾水，恒溫水浴(90 ℃)，至溶解，磁力攪拌2 h(90 ℃，1 500 r/min)，靜置至無(wú)氣泡。將蝗蟲(chóng)翅粘于載玻片上，PVA水溶液均勻涂在翅表，室溫靜置24 h，得到具有翅反結(jié)構(gòu)的PVA模板。將PDMS預(yù)聚物A與固化劑B按質(zhì)量比1∶10混合攪拌，至無(wú)氣泡。涂抹于PVA模板，靜置20 min，干燥2 h(120 ℃)，得到具有翅結(jié)構(gòu)的PDMS仿生膜。同步制作無(wú)翅結(jié)構(gòu)的光滑PDMS膜作為對(duì)照(CK)。

1.2.2 血小板黏附性的測(cè)定

將PDMS對(duì)照膜和仿生膜分別置于生理鹽水中清洗3次，PBS緩沖液中浸泡2 h；取10 mL新鮮抗凝人血進(jìn)行離心(1 500 r/min，10 min)，將仿生膜置于上層的富血小板血漿中進(jìn)行恒溫孵化(37 ℃，2 h)。吸去富血小板血漿，用PBS緩沖液清洗3次，用2.5%戊二醛固定(室溫，2 h)，按一定濃度梯度乙醇/水溶液脫水(30%、50%、70%、90%和100%，30 min/次)。臨界點(diǎn)干燥，噴金處理，掃描電子顯微鏡(日立Su8010，日本)SEM下觀察血小板形態(tài)，計(jì)算其密度。

1.2.3 溶血率的測(cè)定

取4 mL新鮮抗凝人血用5 mL生理鹽水稀釋。仿生膜在10 mL生理鹽水中孵化(37 ℃恒溫水浴，30 min)。加入0.2 mL稀釋血液，混合后恒溫(37 ℃，60 min)孵化。吸取適量液體離心(1 500 r/min，5 min)。取上清液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析TU-1800，中國(guó))測(cè)定波長(zhǎng)540 nm處的吸光度。陽(yáng)性對(duì)照組用10 mL蒸餾水加入0.2 mL稀釋血液；陰性對(duì)照組用10 mL 0.9% NaCl溶液加入0.2 mL稀釋血液，測(cè)定方法、保存條件與PDMS仿生膜相同。按下式計(jì)算溶血率：

溶血率=(Dt-Dnc)/(Dpc-Dnc)×100%

(1)

式中Dt：樣品的吸光度值；Dpc：陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度值；Dnc：陰性對(duì)照組的吸光度值。

1.2.4 動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間的測(cè)定

抽取6 mL新鮮血液，在樣品表面滴0.05 mL后靜置，設(shè)置5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(10、20、30、40和50 min)，把樣品移至燒杯并加入25 mL蒸餾水，均勻混合，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)540 nm處的吸光度。

1.2.5 微觀結(jié)構(gòu)的表征

用導(dǎo)電膠帶分別將蝗蟲(chóng)翅和仿生膜固定于銅質(zhì)圓柱形樣品臺(tái)，使用小型離子濺射儀(日立E-1045，日本)對(duì)樣品表面噴金處理(厚度約20 nm)，置于SEM下觀察和表征。

1.2.6 浸潤(rùn)性的測(cè)定

使用光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x(Data Physics OCA20，德國(guó))分別測(cè)量蒸餾水、血液在蝗蟲(chóng)翅及仿生膜表面的接觸角。液滴體積為3 μL，每個(gè)樣品測(cè)量5次，取平均值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

血樣樣本數(shù)量n=5，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.5.1軟件進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)、雙樣本t檢驗(yàn)和差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面微觀結(jié)構(gòu)

3種蝗蟲(chóng)翅表面具有相似的微觀粗糙單元，均為乳突狀。PDMS仿生膜成功復(fù)制了翅表面的形貌結(jié)構(gòu)(圖1)。

(a)中華稻蝗O. chinensis蝗蟲(chóng)翅；(b)棉蝗C. rosea rosea蝗蟲(chóng)翅；(c)東亞飛蝗L. migratoria manilensis蝗蟲(chóng)翅；(d)中華稻蝗仿生膜；(e)棉蝗仿生膜；(f)東亞飛蝗仿生膜。圖1 蝗蟲(chóng)翅及仿生膜表面微觀結(jié)構(gòu)(SEM)Figure 1 The surface microstructure of locust wings and biomimetic films

采用常用的兩種指數(shù)評(píng)價(jià)表面粗糙度[11-12]：d/l和d/(d+l)，其中，d為乳突直徑，l為乳突間距。指數(shù)(東亞飛蝗<中華稻蝗<棉蝗)越小，表示表面粗糙度(東亞飛蝗>中華稻蝗>棉蝗)越大(表1)。微觀粗糙形貌構(gòu)成了表面復(fù)合浸潤(rùn)性和血液相容性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

表1 PDMS仿生膜與對(duì)照膜的微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)及復(fù)合浸潤(rùn)性Table 1 Microstructural parameters and complex wettability of the biomimetic and smooth PDMS films

2.2 表面浸潤(rùn)性

仿生膜表面具有復(fù)合浸潤(rùn)性，符合Cassie接觸模式，水滴接觸角(θ水)為141.3°～147.6°，為超疏水表面；血液接觸角(θ血)為119.8°～126.3°，顯示出較強(qiáng)的疏血性(表1)。其中，東亞飛蝗翅仿生膜的疏水性和疏血性最強(qiáng)，接觸角分別高于對(duì)照41.2%和32.1%。在蝗蟲(chóng)翅表面，除了微米級(jí)突起還具有納米級(jí)結(jié)構(gòu)，該多級(jí)結(jié)構(gòu)是仿生膜疏水性和疏血性增強(qiáng)的主要因素。隨著微米級(jí)乳突直徑與間距比值的減小，表面粗糙度增大，接觸角隨之增加，接觸角與該比值呈負(fù)相關(guān)變化趨勢(shì)。

2.3 血小板黏附

血小板黏附是評(píng)價(jià)生物醫(yī)用材料血液相容性的重要指標(biāo)。對(duì)照組表面黏附了大量活化的血小板以及大塊的纖維狀物質(zhì)，血小板數(shù)量較多且已完全被激活，發(fā)生形變、團(tuán)聚、黏附和凝血現(xiàn)象[圖2(a)]。在以中華稻蝗、棉蝗和東亞飛蝗翅為模板的仿生膜表面，血小板黏附量分別為3.06×104、2.83×104和0.95×104個(gè)/cm2，明顯低于對(duì)照組(10.89×104個(gè)/cm2)，而且血小板的形狀基本得以保持。其中，中華稻蝗、棉蝗翅仿生膜表面的血小板部分出現(xiàn)不規(guī)則偽足和變形，但基本結(jié)構(gòu)仍清晰可辨[圖2(b)和(c)]。東亞飛蝗翅仿生膜表面的血小板數(shù)量最低，僅為對(duì)照組的8.7%，同時(shí)形態(tài)保持完好，具有較好的抗凝血性[圖2(d)]。

(a)對(duì)照；(b)中華稻蝗；(c)棉蝗；(d)東亞飛蝗。圖2 PDMS膜表面的血小板黏附狀態(tài)Figure 2 The adhesion condition of platelet on the PDMS films

2.4 溶血率

溶血率表征材料對(duì)紅細(xì)胞造成破壞的程度，對(duì)醫(yī)用材料的篩選具有特殊意義[13]。陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度值(Dpc)為1.225 L/(g·cm)，陰性對(duì)照組的吸光度值(Dnc)為0.001 L/(g·cm)，將樣品的吸光度值(Dt)代入公式(1)計(jì)算溶血率，PDMS仿生膜表面溶血率均<5%，符合我國(guó)醫(yī)用高分子材料的溶血率標(biāo)準(zhǔn)，血液相容性能夠達(dá)到機(jī)體環(huán)境的要求，可認(rèn)為材料本身對(duì)紅細(xì)胞沒(méi)有破壞作用[14]。將仿生膜、對(duì)照膜表面溶血率分別與5%的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)，所得P值設(shè)為P1值，3種仿生膜P1值均小于0.05，表明溶血率顯著優(yōu)于國(guó)家醫(yī)用材料標(biāo)準(zhǔn)；將仿生膜表面溶血率分別與對(duì)照膜表面溶血率進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)，所得P值設(shè)為P2值，東亞飛蝗和中華稻蝗的P2值均小于0.05，表明這兩種仿生膜表面溶血率顯著優(yōu)于對(duì)照膜表面，對(duì)凝血反應(yīng)和微血栓形成具有有效的抑制作用(表2)。

表2 PDMS膜表面吸光度、溶血率及P值Table 2 Absorbance,hemolysis rate and P values of the PDMS films

2.5 動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間

動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間可檢測(cè)內(nèi)源性凝血因子的激活程度，進(jìn)而判斷生物材料的抗凝血性能。對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)，吸光度越大，表明溶液中血紅蛋白濃度越高，血液在材料表面凝固性越弱，凝血時(shí)間越長(zhǎng)，材料的血液相容性越好。仿生膜的吸光度高于對(duì)照組，除棉蝗50 min時(shí)間節(jié)點(diǎn)外，與對(duì)照組吸光度之間均有顯著差異(雙樣本t檢驗(yàn)，P<0.05)，顯示出更加優(yōu)異的血液相容性。在10～30 min內(nèi)，對(duì)照組和仿生膜吸光度均快速下降，最高幅度達(dá)58%，說(shuō)明前30 min內(nèi)源性因子被激活的程度較高。在40、50 min兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，中華稻蝗和棉蝗仿生膜吸光度仍下降較快，東亞飛蝗仿生膜吸光度雖亦呈向下趨勢(shì)，但相對(duì)平緩。在5個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，東亞飛蝗與中華稻蝗、東亞飛蝗與棉蝗仿生膜吸光度之間均有顯著差異(P<0.05)，表明其抗凝血性和血液相容性均優(yōu)于中華稻蝗和棉蝗仿生膜(表3)。

表3 PDMS膜表面的動(dòng)態(tài)凝血過(guò)程Table 3 Dynamic coagulation course of blood on the surface of PDMS films

3 討論與結(jié)論

良好的抗凝血生物材料不僅要具有出色的加工和物化性能，而且要具有優(yōu)異的血液相容性和組織相容性。生物醫(yī)用材料與血液的相互作用受到多種因素的影響，如表面形貌、化學(xué)組成、浸潤(rùn)性、血液成分、血流動(dòng)力學(xué)特征等[15]。材料表面微觀形貌對(duì)血細(xì)胞的位向、附著、增殖以及蛋白質(zhì)的合成、分泌等具有重要影響，是血液相容性的決定因素之一。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，表面粗糙度越高的材料暴露在血液的面積越大，凝血的可能性也就越大。但根據(jù)非光滑耦合理論[16]，一定范圍內(nèi)的粗糙度可優(yōu)化表面的復(fù)合浸潤(rùn)性，增大仿生膜的水滴接觸角與血液接觸角，減少血液中各種成分與材料表面的接觸機(jī)會(huì)以及對(duì)細(xì)胞膜的損傷，達(dá)到抗溶血和抗凝血的效果[17]。

正常情況下的血液流動(dòng)為層流狀態(tài)，從血管軸心到血管壁，血液流動(dòng)方向一致，但遇到粗糙表面時(shí)，層流狀態(tài)可能被打亂，變?yōu)橥牧?。微納雙重結(jié)構(gòu)減小了血細(xì)胞與材料表面的有效接觸面積，降低了血細(xì)胞被捕獲的概率，產(chǎn)生特殊的細(xì)胞效應(yīng)性，有利于抑制血栓的形成[18]。血管內(nèi)壁的納米溝槽一方面抑制了血小板的黏附，另一方面優(yōu)化了流體動(dòng)力學(xué)，降低了血液流動(dòng)的紊亂性和血小板激活的概率[19]。

以蝗蟲(chóng)翅為模板制備了PDMS仿生膜，成功復(fù)制了翅表面的形貌結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性(水滴接觸角141.3°～147.6°)和疏血性(血液接觸角119.8°～126.3°)。微納多級(jí)結(jié)構(gòu)是仿生膜疏水性和疏血性增強(qiáng)的主要因素。根據(jù)血小板黏附、溶血率、動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間等指標(biāo)，仿生膜表面具有較好的血液相容性。對(duì)照膜表面黏附了大量活化的血小板以及大塊的纖維狀物質(zhì)，血小板數(shù)量較多且已完全被激活，發(fā)生形變、團(tuán)聚、黏附和凝血現(xiàn)象。而在以中華稻蝗、棉蝗和東亞飛蝗翅為模板的仿生膜表面，血小板黏附量明顯低于對(duì)照組，而且血小板的形狀基本得以保持。其中，東亞飛蝗翅仿生膜表面的血小板數(shù)量最低，僅為對(duì)照組的8.7%，同時(shí)形態(tài)完好，未被激活，具有較好的抗凝血性。仿生膜表面溶血率均<5%，符合我國(guó)醫(yī)用高分子材料的溶血率標(biāo)準(zhǔn)。與對(duì)照膜相比，仿生膜的動(dòng)態(tài)凝血過(guò)程更加平緩，具有更長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間。在3種仿生膜中，東亞飛蝗的抗凝血性能和血液相容性均優(yōu)于中華稻蝗和棉蝗仿生膜，對(duì)凝血反應(yīng)和微血栓形成具有顯著的抑制效應(yīng)，這是由于東亞飛蝗翅具有更大的表面粗糙度和更高的疏水性、疏血性，不利于血細(xì)胞的黏附和鋪展。具有大比表面積和高孔隙率的微納米表面可以促進(jìn)血細(xì)胞與微結(jié)構(gòu)單元之間的相互作用，并且微納米效應(yīng)阻止了細(xì)胞的機(jī)械損傷。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[20]。構(gòu)建具有特殊浸潤(rùn)性的功能材料已成為各國(guó)學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)領(lǐng)域，其中仿生材料是近年來(lái)功能材料研究的熱點(diǎn)課題[21]。不同尺寸參數(shù)的表面形貌和浸潤(rùn)性是研究其血液相容性的基礎(chǔ)。揭示這些因素與血液相容性之間的作用關(guān)系，可為與人類(lèi)健康密切相關(guān)的新型醫(yī)用工程材料的選擇、制備及控制提供有利依據(jù)。