沈 今， 徐德立, 王 碩， 王玉雪， 栗智敏， 程秋霞， 朱 梅

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，273165,山東省曲阜市)

0 引 言

免疫系統(tǒng)在防御病原體如細菌、病毒和真菌等攻擊和感染中起著至關(guān)重要的作用，決定著動物的生存.動物的免疫功能受多種因素的影響，例如季節(jié)、光周期、食物和溫度等[1,2].生活于溫帶地區(qū)的動物，其免疫功能常表現(xiàn)出季節(jié)變化，在冬季，一些物種的免疫功能會降低[3-5]；而另外一些物種則升高[6-9].季節(jié)變化引起的免疫能力的變化是溫度和其他因素如食物、光周期等共同影響的結(jié)果，溫度是影響動物免疫能力的重要生態(tài)因子之一[10].

大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)低溫會抑制動物的免疫功能，例如低溫會抑制小鼠[11]、拉布拉多白足鼠(Peromyscusmaniculatus)[12]和棕背鼠平 (Clethrionomysrufocanus)[13]的體液免疫，低溫同樣降低布氏田鼠(Lasiopodomysbrandtii)的天然免疫能力[14]；也有些研究發(fā)現(xiàn)不同的結(jié)果，例如低溫增加大鼠和小鼠的細胞免疫能力[14,15]，但不影響拉布拉多白足鼠的細胞免疫能力[15].可見，低溫對動物免疫能力的影響與所用動物、所檢測的免疫學(xué)指標等因素有關(guān).

免疫器官如胸腺和脾可反映動物的免疫能力，胸腺是T淋巴細胞成熟的場所；通常情況下脾臟越大免疫能力越強[16-18].植物血球凝集素(Phytohaemagglutinin,PHA)反應(yīng)是將PHA注射至嚙齒動物的足墊處，以誘導(dǎo)T細胞的增殖，根據(jù)足墊的腫脹程度反映細胞免疫功能[19,20].本文以三線倉鼠(Phodopussungoris)為研究對象，探討逐漸降低溫度對其免疫能力有何影響，我們預(yù)測低溫會抑制該物種的免疫能力.

1 材料和方法

1.1 實驗設(shè)計

本實驗中所使用的成年三線倉鼠購自于寵物店.室內(nèi)光周期為12L∶12D，單籠(30 cm×15 cm×20 cm)飼養(yǎng)，使用鋸末為墊料，食物為標準飼料塊(濟寧醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)中心)，自由取食和飲水，飼養(yǎng)大約2周，體重穩(wěn)定后，將18只成年雄性三線倉鼠隨機分為常溫組 (Warm，n=10)和低溫組(Cold，n=8).低溫組采用逐漸降溫的方式，每6天降低4度，降溫至4 ℃后，在4 ℃低溫下維持1周，每天上午9點左右稱量動物的體重.

1.2 細胞免疫的測定

PHA反應(yīng)的測定方法參考Xu 和Wang (2010)[20].具體來說，在處死動物前5天，用數(shù)顯電子測微尺(Mitutoyo Absolute cod.547-301,日本)測定每只動物左后足足墊的厚度(精確至±0.01 mm)，用75%酒精對足墊消毒，然后在足墊中心處注射0.03 mL含0.1 mg PHA (PHA-P,Sigma L-8754)的無菌PBS緩沖液(pH 值7.4)，6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后分別測量左后足足墊的厚度，PHA反應(yīng)的計算公式為：(注射后足墊厚度-注射前足墊厚度)/注射前足墊厚度，每只動物每次測定6次，最后取6次測定的平均值[20].

1.3 身體成分和器官

器官的解剖參考Xu和Wang的方法[20].動物處死后快速分離肩胛間的褐色脂肪組織(IBAT)稱重，隨后分別取出動物的心臟、肺臟、胸腺、肝臟、腎臟、腎上腺、脾臟、睪丸、附睪、貯精囊，剔除器官表面附著的結(jié)締組織和脂肪，在濾紙上吸干器官表面的液體后稱重(精確到0.001 g)，為器官鮮重.取出動物的消化道，分別分離出胃、小腸、盲腸、結(jié)腸，小心剔除器官腸系膜及結(jié)締組織和脂肪.分別稱量胃及其內(nèi)容物、小腸及其內(nèi)容物、盲腸及其內(nèi)容物、結(jié)腸及其內(nèi)容物重.之后，將其縱向剖開，用生理鹽水洗去內(nèi)容物，置濾紙上吸干表面水分后，稱重，作為器官鮮重.去除所有內(nèi)臟器官后剩余的重量為胴體鮮重.此外，小心地分離皮下脂肪、性周脂肪、腸系膜脂肪和腹膜后脂肪，這4部分脂肪的總重被認為是總體脂重，皮下脂肪含量、性周脂肪含量、腸系膜脂肪含量、腹膜后脂肪含量以及總脂肪含量的計算方法是分別用以上各部分脂肪重量除以終體重[21].

1.4 白細胞數(shù)的測定

用剪刀將動物頸部動脈剪開，取血，迅速將20 μL血液，溶于0.38 mL白細胞稀釋液[含1.5%的冰醋酸，1%龍膽紫(Sigma)]中，用手指輕彈混勻，放于冰中，大約2 h后，取20 μL上述溶液小心地滴在已放有蓋玻片的血球計數(shù)板上，在低倍顯微鏡下(10×)觀察，并用血球計數(shù)器計算4個角4個大格中所有的白細胞總數(shù)，然后乘以5×107，即為血液中所含白細胞總數(shù)(109cells/L)[20].

1.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 18軟件進行分析.統(tǒng)計分析之前，用One-sample Kolmogorove-Simirnov test檢驗數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布.比值包括PHA反應(yīng)和脂含量用反正弦轉(zhuǎn)換后進行分析.采用多因變量線性模型(General Linear Model multivariate analysis，GLM)中重復(fù)測量(Repeated Measures)的方差分析方法分析體重以及PHA反應(yīng)隨時間的變化情況，每個時間點上低溫組和常溫組間的差異采用獨立樣本t-檢驗(Independent Samples T-test) 進行分析.常溫組和低溫組身體成分、白細胞總數(shù)用獨立樣本t-檢驗進行分析.以體重為協(xié)變量采用GLM方法分析器官鮮重的組間差異.結(jié)果數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤(Mean ± SE)表示，P<0.05為統(tǒng)計學(xué)上差異顯著.

2 結(jié) 果

2.1 體重

重復(fù)測量的方差分析顯示，三線倉鼠體重隨時間而發(fā)生變化(F30,480=75.172,P<0.001)，同時受時間與分組之間交互作用的影響(F30,480=12.660,P=0.015).具體來說，常溫組體重隨處理時間而逐漸增加(F30,270=90.286,P<0.001) ，而低溫組體重隨時間同樣逐漸增加(F30，210=11.882,P<0.001).獨立樣本t-檢驗分析顯示，常溫組和低溫組的體重從實驗處理第1天(t=-0.733,df=16,P=0.474) 至第29天(t=1.928,df=16,P=0.072) 均無顯著差異，第30天(t=2.758,df=16,P=0.043)和第31天(t=2.198,df=16,P=0.014)低溫組體重顯著低于常溫組(圖1).

圖1 低溫對雄性三線倉鼠體重的影響.星號(*) 表示低溫和常溫組之間差異顯著(P<0.05)

2.2 身體成分

常溫組動物的胴體鮮重、性周脂肪含量、腹膜后脂肪含量、總體脂重及其含量均顯著高于低溫對照組，而皮下脂肪及其含量、性周脂肪、腸系膜脂肪及其含量、腹膜后脂肪在兩組間則沒有顯著差異(表1).

表1 低溫對三線倉鼠身體成分的影響

2.3 器官鮮重

低溫組腎臟鮮重、盲腸及其內(nèi)容物、結(jié)腸及其內(nèi)容物重量均顯著高于常溫組，免疫器官胸腺和脾臟鮮重以及其他器官鮮重在低溫和常溫組之間沒有顯著差異(表2).

表2 低溫對三線倉鼠器官鮮重的影響

2.4 白細胞數(shù)

白細胞總數(shù)在低溫與常溫組之間沒有顯著差異(t=-1.718,df=16,P=0.105) (圖2).

圖2 低溫對雄性三線倉鼠白細胞數(shù)的影響

2.5 細胞免疫

重復(fù)測量的方差分析顯示，PHA反應(yīng)隨PHA注射后時間的延長而發(fā)生變化(F4,64=27.609,P<0.001)，同時受時間與分組之間交互作用的影響(F4,64=3.342,P=0.015) (圖3).具體來說，常溫組PHA反應(yīng)在注射PHA后24 h達到最大值(F4,36=35.794,P<0.001)，而低溫組PHA反應(yīng)在注射PHA后逐漸降低(F4,28=5.371,P=0.002).獨立樣本T檢測分析表明，低溫組PHA反應(yīng)24 h顯著低于常溫組(t=2.247,df=16,P=0.039) ，而注射PHA后6 h (t=1.330,df=16,P=0.202)、12 h (t=1.714 ,df=16,P=0.106)、48 h (t= 0.814,df=16,P=0.428)、72 h (t= 1.463,df=16,P=0.163)的PHA反應(yīng)兩組間則沒有顯著差異 (圖3).總體脂重與PHA反應(yīng)6 h (r=0.037,P=0.885)、12 h (r=0.004,P=0.989)、24 h (r=0.179,P=0.477)、48 h (r=-0.120,P=0.634)、72 h (r=-0.044,P=0.863)均不存在相關(guān)性.

圖3 低溫對雄性三線倉鼠PHA反應(yīng)的影響.星號(*)表示組間差異顯著(P<0.05)

3 討 論

低溫降低了三線倉鼠的體重、體脂重和細胞免疫水平，而脾臟鮮重、胸腺鮮重、白細胞數(shù)沒有顯著性變化.

3.1 低溫對體重和身體成分的影響

低溫顯著降低了三線倉鼠在實驗處理第30天和第31天的體重，這與布氏田鼠[22]、黑線倉鼠(Cricetulusbarabensis)[21]和長爪沙鼠(MerionesUnguiculatus)[23]的體重不受低溫影響的結(jié)果不同.這可能與低溫處理的方式以及物種差異有關(guān)，本實驗是采取逐漸降低溫度至4 ℃，而在布氏田鼠、黑線倉鼠和長爪沙鼠的研究中直接將動物放于4 ℃低溫環(huán)境中.低溫顯著降低了三線倉鼠的胴體鮮重，這與黑線倉鼠[21]的研究結(jié)果一致，但與布氏田鼠[22]和長爪沙鼠[23]中胴體鮮重不受低溫影響的結(jié)果不同.低溫降低了三線倉鼠的脂肪總重，說明低溫下三線倉鼠動用了體內(nèi)的能量貯存，這一結(jié)果與布氏田鼠[22]和長爪沙鼠[23]低溫下脂肪含量沒有顯著變化不同.

3.2 低溫對免疫的影響

我們發(fā)現(xiàn)三線倉鼠胸腺和脾臟鮮重、白細胞總數(shù)均不受低溫的影響，這與低溫下長爪沙鼠免疫器官不發(fā)生變化的結(jié)果一致[27].常溫組PHA反應(yīng)隨PHA注射時間延長先升高，到24 h達最大值，隨后降低，而低溫組PHA反應(yīng)隨著PHA注射時間延長逐漸降低，并且低溫組注射PHA后24 h的PHA反應(yīng)顯著低于常溫組，表明低溫抑制了三線倉鼠的細胞免疫能力，暗示其防御病毒等胞內(nèi)病原體的能力可能下降.該結(jié)果與黑線倉鼠細胞免疫不受低溫影響的結(jié)果不同[24]，原因可能是與物種差異、低溫處理的方式不同等有關(guān).此外，我們發(fā)現(xiàn)，常溫組三線倉鼠PHA反應(yīng)最大值出現(xiàn)在注射PHA后24 h，而在長爪沙鼠、黑線倉鼠中PHA反應(yīng)最大值出現(xiàn)在注射PHA后6 h[20,24]，這可能與它們的分布及其生活環(huán)境中病原體種類和數(shù)量有關(guān).通常情況下，如果病原體的種類及數(shù)量較少，能進行快速的免疫反應(yīng)對動物來說是有利的；反之，如果動物經(jīng)常受到許多種類的病原體攻擊，那么免疫反應(yīng)發(fā)生較慢是有利的[19]，長爪沙鼠主要分布于內(nèi)蒙古荒漠半荒漠區(qū)，黑線倉鼠是主要分布于華北地區(qū)，其生境中病原體種類和數(shù)量可能較少.盡管三線倉鼠是寵物鼠，其祖先原始生活于蒙古高原西部和南部草原，生活環(huán)境中的病原體種類和數(shù)量可能較多.

脂肪不僅是動物的能量儲存場所，而且還能分泌許多脂肪因子如瘦素等，通常情況下機體的能量貯存降低會損害動物的免疫功能[25,26]，我們發(fā)現(xiàn)PHA反應(yīng)與總體脂重不存在相關(guān)性，盡管低溫條件下三線倉鼠總體脂重顯著下降，但降低的體脂可能不是其細胞免疫受抑制的原因.低溫等應(yīng)激環(huán)境通常會導(dǎo)致應(yīng)激激素如皮質(zhì)酮水平的升高，而應(yīng)激激素通常能抑制動物的免疫功能[27]，三線倉鼠細胞免疫受抑制是否由應(yīng)激激素引起的，還需要進一步研究.