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香菇柄多糖的提取純化及抗氧化活性研究

2021-10-25 03:35江崇弘
科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新 2021年30期
關(guān)鍵詞:層析無(wú)水乙醇蒸餾水

陳 平 江崇弘

(1、南陽(yáng)理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,河南 南陽(yáng)473000 2、河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽(yáng) 473000)

香菇為真菌植物門(mén)真菌香蕈的子實(shí)體,屬擔(dān)子菌綱傘菌科,是世界上著名的食用菌之一,且具有較高的藥用價(jià)值[1]。香菇多糖為香菇提取物中最重要的活性成分之一,在調(diào)控機(jī)體免疫,抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化等方面的作用顯著[2-4],相關(guān)研究受到越來(lái)越多人的關(guān)注。有研究指出香菇多糖的分子量和純度與其功能密切相關(guān)。香菇多糖本身為一種復(fù)雜的生物大分子,大大增加了其提取純化的難度,進(jìn)而限制了香菇多糖功效的發(fā)揮、構(gòu)效關(guān)系以及作用機(jī)制的研究。目前用于香菇多糖提取的方法主要有熱水浸提、酸提法、酶提法、微波輔助法、超聲輔助法等[5],這些方法所得多糖多為粗多糖。香菇柄是香菇采收過(guò)程中的副產(chǎn)物,產(chǎn)量大,價(jià)格便宜,主要用于加工生產(chǎn)香菇醬、飼料等低附加值產(chǎn)品,鑒于香菇柄中的營(yíng)養(yǎng)成分近似于香菇傘,且多糖亦為其主要活性成分,故對(duì)香菇柄進(jìn)行深加工和綜合利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[6]。本文以香菇柄為原料,利用水溶液浸提法提取香菇柄中的多糖后,聯(lián)合柱層析法對(duì)提取的粗多糖進(jìn)純化,并就純化所得多糖的抗氧化活性進(jìn)行初步研究,以期為香菇柄中多糖的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料。香菇,購(gòu)自市內(nèi)萬(wàn)德隆超市。

1.2 主要試劑。濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇、過(guò)硫酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、碳酸氫鈉等試劑均為分析純。G-150 葡聚糖凝膠:上海伊卡生物科技有限公司;DEAE——52 纖維素和DPPH:福州飛凈生物科技有限公司;ABTS/ABTS 底物:上海士鋒生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備。小型粉碎機(jī):北京中興偉業(yè)儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫水浴鍋:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海申順生物科技有限公司;紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì):上海菁華科技儀器有限公司;低速離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;恒流泵層析柱:上海夏美生化發(fā)展有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法。1.4.1 香菇柄多糖的提取。購(gòu)買(mǎi)的香菇取柄,用清水洗凈表面的泥土,撕碎,在45℃下進(jìn)行低溫烘干,粉碎,過(guò)40 目篩,稱取適量置于500mL 圓底燒瓶中,按照1:40(香菇柄:水)質(zhì)量體積比加入蒸餾水混勻后放入水浴鍋中,在85℃的條件下浸提3h,抽濾后得濾液,對(duì)所得濾液進(jìn)行減壓濃縮至一定體積后,加入適量無(wú)水乙醇,使樣品中無(wú)水乙醇濃度至90%,攪拌均勻后,4℃過(guò)夜,取出樣品離心收集沉淀,并用無(wú)水乙醇洗滌絮凝物沉淀3 次,將所得絮凝物在60℃真空干燥烘干至恒重得香菇柄粗多糖。1.4.2 香菇柄多糖含量的測(cè)定。多糖含量測(cè)定采用苯酚硫酸法,具體步驟參考文獻(xiàn)[7]。1.4.3 香菇柄多糖的純化。1.4.3.1 香菇柄多糖DEAE-52 纖維素離子交換層析對(duì)于粗多糖初步純化采用DEAE-52 纖維素離子交換層析,具體實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[8]。準(zhǔn)確稱取熱水提取法得到的粗多糖50mg 加5mL 蒸餾水溶解,4000r/min 離心10min,制成10mg/mL的多糖溶液,過(guò)0.45μm 濾膜后上樣,依次用蒸餾水、0.2mol/mL、0.4mol/mL NaCl,以1mL/min的洗脫速度洗脫,洗脫體積約100mL,收集洗脫液。并用苯酚硫酸法測(cè)其在490nm 波長(zhǎng)下的吸光值,根據(jù)吸光值繪制洗脫曲線。1.4.3.2 香菇柄多糖葡聚糖凝膠過(guò)濾層析。為得到均一性多糖,將離子交換層析純化所得多糖采用G-150 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化,具體實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[9]。準(zhǔn)確稱取經(jīng)離子交換層析初步純化得到的多糖20mg 加2mL 蒸餾水溶解,4000 r/min 離心10min,制成10mg/mL的多糖溶液,0.45μm 濾膜過(guò)濾后上樣。用蒸餾水進(jìn)行洗脫,洗脫速度為0.2mL/min,收集洗脫液并用苯酚硫酸法測(cè)其在490nm 波長(zhǎng)下的吸光值,根據(jù)吸光值繪制洗脫曲線,收集主要組分濃縮到原來(lái)體積的1/4。用蒸餾水透析24h,干燥至恒重后用于后續(xù)活性分析。1.4.4 香菇柄多糖抗氧化活性的測(cè)定。1.4.4.1 香菇柄多糖DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)[10]。準(zhǔn)確稱取純化制備的香菇柄多糖用蒸餾水配制濃度分別為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的多糖溶液待測(cè),取3mL 多糖待測(cè)液與3mL 濃度為0.08mg/mL的DPPH 溶液混勻,放置2min,用無(wú)水乙醇做空白對(duì)照,測(cè)其517nm 下的吸光值(A1);3mL 蒸餾水與3mLDPPH 所測(cè)吸光值為A2;3mL 多糖待測(cè)液與3mL 蒸餾水所測(cè)吸光值為A3;根據(jù)公式DPPH 自由基清除率=[1-(A3-A1)/A2]*100%計(jì)算香菇柄多糖的DPPH 清除率。1.4.4.2 香菇柄多糖ABTS 自由基抑制實(shí)驗(yàn)[11]。取3mL 多糖待測(cè)液與5mLABTS 工作液搖勻,放置5min,用蒸餾水做空白對(duì)照,測(cè)其734nm 下的吸光值(A1′);3mL 蒸餾水與5mL ABTS 工作液所測(cè)吸光值為A2′;3mL 蒸餾水與5mL 蒸餾水所測(cè)吸光值為A3′;根據(jù)公式抑制率=[1-(A3′-A1′)/A2′]*100%計(jì)算ABTS 自由基抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇柄多糖的提取結(jié)果。采用熱水提取對(duì)香菇柄中粗多糖進(jìn)行提取后按照1:4的體積比加入無(wú)水乙醇對(duì)粗多糖濃縮液進(jìn)行醇沉,可得到0.43g 多糖,得率為4.3%,即43mg/g。

2.2 香菇柄多糖的純化結(jié)果。2.2.1 DEAE-52 纖維素離子交換層析結(jié)果。將DEAE-52 纖維素離子交換層析收集到的各管洗脫液,在490nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值,以洗脫液體積為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線如圖1 所示??梢?jiàn)經(jīng)過(guò)不同的洗脫液洗脫后,可得到一個(gè)明顯的峰。收集該峰對(duì)應(yīng)的洗脫液,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至收集液原始體積的1/4 后醇沉后離心取下層沉淀,將沉淀干燥即得到經(jīng)DEAE-52 纖維素純化得到的多糖,稱重得其質(zhì)量為35mg,計(jì)算粗多糖經(jīng)初步純化得率為70%,即香菇柄多糖得率3.01%。2.2.2 G-150 葡聚糖凝膠層析結(jié)果。將G-150 葡聚糖凝膠層析收集到的各管洗脫液在490nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值并繪制洗脫曲線,結(jié)果如圖2 所示,經(jīng)洗脫可得到一個(gè)明顯的峰,收集該峰對(duì)應(yīng)的洗脫液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至收集液原始體積的1/4 后醇沉干燥即得到經(jīng)凝膠過(guò)濾層析純化得到的多糖,稱重得其質(zhì)量為15mg,計(jì)算初步純化的多糖經(jīng)二次純化后得率為75%。聯(lián)合使用DEAE-52 纖維素離子交換層析和G-150 凝膠過(guò)濾層析對(duì)粗多糖進(jìn)行純化結(jié)果可知每50mg 粗多糖純化后可獲得26.25mg的純多糖,最終多糖的純化得率為52.5%,即香菇柄多糖得率為2.26%。

圖1 DEAE-52 纖維素離子交換層析洗脫曲線

圖2 G-150 凝膠過(guò)濾層析洗脫曲線

2.3 香菇柄多糖抗氧化活性測(cè)定結(jié)果。2.3.1 香菇柄多糖對(duì)DPPH 自由基的清除效果。將純化所得多糖分別配制成濃度為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的 多 糖 溶液,測(cè)得的DPPH 自由基清除率如圖3 所示,由圖可知香菇柄多糖DPPH 自由基清除率同陽(yáng)性對(duì)照Vc 一樣均隨著待測(cè)樣本濃度的增加而逐漸增大,說(shuō)明該多糖與DPPH的清除率存在較好的量效關(guān)系。其中香菇柄多糖的DPPH 自由基清除能力由0.2mg/mL的23.21%增加至濃度為1mg/mL的39.24%。2.3.2 香菇柄多糖對(duì)ABTS 自由基的清除效果。香菇柄多糖對(duì)ABTS 自由基的清除效果如圖4 所示,由圖可知香菇柄多糖ABTS 自由基清除率同陽(yáng)性對(duì)照Vc 一樣均隨著待測(cè)樣本濃度的增加而逐漸增大,其中香菇柄多糖的ABTS 自由基清除能力由19.25%增加至33.45%。結(jié)合兩者之間清除率的具體數(shù)據(jù)可知雖然香菇柄中的多糖對(duì)DPPH的清除能力與Vc 存在一定差距,但仍表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。

圖3 香菇柄多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力

圖4 香菇柄多糖對(duì)ABTS+自由基的清除能力

3 結(jié)論

利用熱水提取法和柱層析法對(duì)香菇中多糖進(jìn)行提取純化,并對(duì)所得多糖的活性進(jìn)行初步探索,最終香菇柄多糖得率可達(dá)2.26%。文中香菇柄多糖的提取純化方法和數(shù)據(jù)為相關(guān)多糖的制備提供了參考。由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,純化所得多糖的具體結(jié)構(gòu)的解析是后續(xù)的研究方向之一。另外純化后的多糖表現(xiàn)出一定的DPPH 自由基和ABTS 自由基清除能力,且兩種自由基的清除效果與多糖濃度成較好的線性關(guān)系,可進(jìn)一步從生化、細(xì)胞、動(dòng)物多層次多水平綜合判斷建立香菇柄多糖抗氧化活性與結(jié)構(gòu)和量之間的關(guān)系,進(jìn)而為香菇柄多糖的相關(guān)研究提供指導(dǎo),為高附加值香菇產(chǎn)品的獲得提供支持。

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