李飛 李兵航 郭悅承 沈波 顧天翊 曲穎 張啟迪 蔡曉波 陸倫根

Y-box結(jié)合蛋白(YB-1)是一種廣泛存在于細(xì)菌和人類的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，能特異性結(jié)合目的基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子內(nèi)部Y-box序列(CTGATTGGCCAA)，發(fā)揮多種重要的生物學(xué)功能，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等[1-4]。Didier等[5]發(fā)現(xiàn)，YB-1可以與人MHC II基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)含有CCAAT序列的順式作用原件Y-box特異性結(jié)合，并抑制MHC II的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，YB-1可以與多種基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子結(jié)合，調(diào)控相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控各種生物學(xué)功能[1]。Okamota等[6]發(fā)現(xiàn)，YB-1能與p53直接結(jié)合，并且在人表皮癌細(xì)胞中降低YB-1的表達(dá)促進(jìn)p53的轉(zhuǎn)錄。因此，YB-1能通過調(diào)控多種基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性抑制或促進(jìn)相應(yīng)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖。

研究發(fā)現(xiàn)，慢加急性暴發(fā)型肝炎患者的YB-1主要在肝臟膽管細(xì)胞、肝癌細(xì)胞(HPC)細(xì)胞和肝細(xì)胞中高表達(dá)。在誘導(dǎo)HPC增殖的小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)YB-1主要在肝臟HPC中表達(dá)。因此，YB-1可能參與調(diào)控HPC增殖和肝再生。本研究擬在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中探索YB-1對(duì)HPC增殖的影響及其作用機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

(一)動(dòng)物 雄性C57BL/6J 小鼠，4周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)于上海市第一人民醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

(二)試劑 William′s E培養(yǎng)基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰島素樣生長(zhǎng)因子-II、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；Trizol購(gòu)自日本Takara公司；抗YB-1、抗Gli1、抗Gli2、抗Shh、抗C-myc、抗GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；抗Cyclin D1抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；GANT61購(gòu)自美國(guó)Selleck公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)肝祖細(xì)胞分離與培養(yǎng) 4周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠予50%膽堿缺乏飼料+0.1%乙硫氨酸喂養(yǎng)3周，制備肝損傷模型，采用膠原酶兩步灌注法分離HPC，分離方法見文獻(xiàn)[7]。采用William′s E完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、20 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子、10 μg/mL胰島素和30 ng/mL胰島素樣生長(zhǎng)因子-II)，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

(二)慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 攜帶有特異性干擾YB-1表達(dá)的慢病毒載體系統(tǒng)由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司構(gòu)建制備。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組干擾序列如下：對(duì)照組：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′、shYB-1#1：5′-GAGAGCAAGGTAGACCAGTG-A-3′、shYB-1#2：5′- GTCAAATGGTTCAATGTA-AGG -3′。轉(zhuǎn)染前，用完全培養(yǎng)基重懸肝祖細(xì)胞，調(diào)整密度至2×104cell/mL，取0.5 mL接種于24孔板，共3孔，培養(yǎng)過夜；待細(xì)胞匯合至50%，更換培養(yǎng)基，分別加入20 μL病毒液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，1∶5傳代培養(yǎng)。通常在轉(zhuǎn)染后第9天觀察到Y(jié)B-1干擾組細(xì)胞數(shù)顯著減少，然后收集細(xì)胞提取蛋白和RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(三)細(xì)胞增殖檢測(cè) CCK-8實(shí)驗(yàn)：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，在96孔板加入100 μL HPC細(xì)胞懸液(2×104/mL)，每組6個(gè)復(fù)孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育72 h；每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值(A)。

(四)流式細(xì)胞術(shù) 按照美國(guó)BD公司細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作，制備單細(xì)胞懸液，PBS洗滌一次，預(yù)冷95%酒精冰上固定過夜，PBS洗滌后加入PI/RNase Staining Buffer 0.5 mL室溫孵育30 min，PBS重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。

(五)實(shí)時(shí)PCR 用Trizol提取總RNA，采用Nanodrop測(cè)定RNA濃度。按照Takara公司第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR036A)說明書提供的操作步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照日本Takara公司SYBR Green PCR熒光定量PCR試劑盒(RR820)說明操作。PCR條件為：95 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次 。各靶基因引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)PCR 引物序列

(六)高通量測(cè)序 采用帶有Oligo(dT) 的磁珠(購(gòu)自澳大利亞Bioclone公司)捕獲帶有poly A尾的mRNA，將mRNA片段化為100～200 bp大小的核苷酸片段。cDNA純化后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、制備文庫(kù)。采用HiSeq2500 平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行高通量測(cè)序。所得數(shù)據(jù)與小鼠基因組進(jìn)行比對(duì)，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物本體學(xué)、信號(hào)通路分析。

(七)染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合高通量測(cè)序 采用Upstate公司提供的試劑盒(目錄號(hào)：17-375)進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀，實(shí)驗(yàn)步驟參見試劑說明書。所得染色質(zhì)經(jīng)片段化、末端修復(fù)、3′末端加A、連接、片段選擇及純化、PCR擴(kuò)增和純化、以及文庫(kù)質(zhì)檢等操作后，采用Illumina HiSeq2000平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)測(cè)序，數(shù)據(jù)經(jīng)去污染、去接頭等處理后使用SOAP軟件與Hgl9基因組序列進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行GO功能聚類分析KEGG生物通路富集分析。

(八)免疫印跡 采用RIPA裂解液提取胞質(zhì)蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒確定蛋白濃度。30 μg 細(xì)胞總蛋白與上樣緩沖液按比例混勻，煮沸變性5 min，經(jīng) 10%SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上。PVDF 膜以 5%脫脂牛奶室溫封閉 2 h，一抗 4°C孵育過夜。以 TBST 洗滌 3 次，每次5 min，加入HRP 標(biāo)記的二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育 2 h，用 TBST 洗滌 3 次，每次5 min。用 ECL 化學(xué)發(fā)光。

(九)熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn) 由上海齊合生物公司構(gòu)建含有小鼠Gli2基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，將其分別轉(zhuǎn)染至YB-1干擾組和對(duì)照組HPC，24 h 后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)觀察熒光素酶的表達(dá)活性。

結(jié) 果

一、YB-1調(diào)控HPC增殖

首先，通過慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染HPC并成功下調(diào)YB-1的表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，沉默YB-1顯著抑制HPC增殖。siYB-1#1和siYB-1#2對(duì)HPC中YB-1 mRNA的抑制率分別達(dá)到67%和75%；與此相應(yīng)，HPC增殖率分別下降了58%和70%。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期顯示，YB-1下調(diào)后G0/G1期細(xì)胞比例增加，表明沉默YB-1能阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，見圖1A-C。

二、YB-1調(diào)控HPC基因表達(dá)

為了進(jìn)一步研究YB-1調(diào)控HPC增殖的分子機(jī)制，RNA-sequence被用來分析YB-1對(duì)HPC表達(dá)譜的影響。與對(duì)照組相比，YB-1沉默組HPC有395個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，296個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，如圖2A?；虮倔w學(xué)分析(GO Analysis)表明差異基因參與多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞粘附等,如圖2B。KEGG分析表明差異基因參與多條重要的信號(hào)通路，包括TGF-β信號(hào)通路、ECM-receptor interaction、Hedgehog信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路以及MAPK信號(hào)通路,如圖2C。

注：A- C.與scramble組相比，沉默YB-1能將更多肝祖細(xì)胞阻滯在G0/G1期圖1 沉默YB-1抑制肝祖細(xì)胞增殖

注：A.YB-1調(diào)控基因表達(dá)；B.基因本體學(xué)(GO)分析；C 信號(hào)通路(KEGG)分析圖2 沉默YB-1改變肝祖細(xì)胞基因表達(dá)譜

四、YB-1在HPC內(nèi)靶基因分析

YB-1在HPC全基因組上有8524個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中3609(62%)和1821(31.5%)個(gè)結(jié)合位點(diǎn)分別位于間區(qū)和內(nèi)含子區(qū)，另外有202(3.4%)和192(3.1%)個(gè)分別位于外顯子區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)，如圖3A?；虮倔w學(xué)分析(GO Analysis)表明這些靶基因具有廣泛的生物學(xué)功能，如細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞粘附、信號(hào)通路調(diào)控等，如圖3B所示。KEGG分析表明YB-1在HPC中的靶基因參與細(xì)胞粘附、Wnt信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路等，如圖3C。Motif序列研究表明YB-1在HPC中的結(jié)合序列具有多樣性,如圖3D。

注：A.ChIP-sequence表明，YB-1在肝祖細(xì)胞全基因組上共有8524個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；B.靶基因基因本體學(xué)分析；C.靶基因信號(hào)通路分析；D.YB-1在HPC中的結(jié)合序列具有多樣性圖3 YB-1在肝祖細(xì)胞全基因組上的靶基因

五、YB-1調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路

RNA-sequence和ChIP-sequence均表明YB-1能調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路，且ChIP-sequence 顯示YB-1在 Gli2啟動(dòng)子區(qū)有結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)時(shí)PCR表明沉默YB-1能下調(diào)Hedgehog信號(hào)通路的配體Shh和Ihh，受體Patched,中間信號(hào)分子Gli1和Gli2及其靶基因cyclin D1、cyclin D2、C-myc和N-myc。蛋白質(zhì)印跡法也獲得了相同的結(jié)果,如圖4A。ChIP-PCR表明YB-1能直接結(jié)合Gli2的啟動(dòng)子區(qū),如圖4B；熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步表明沉默YB-1能下調(diào)Gli2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,siYB-1#1和siYB-1#2對(duì)Gli2基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄抑制效率分別達(dá)到42%和57%。

注：A.沉默YB-1抑制Hedgehog信號(hào)通路;B.ChIP-PCR表明YB-1能與Gli2啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合圖4 YB-1調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路

六、Gli1/Gli2阻斷劑抑制肝祖細(xì)胞增殖

為進(jìn)一步驗(yàn)證Hedgehog信號(hào)通路能調(diào)控HPC增殖，Gli/Gli2抑制劑GANT61被用于阻斷Hedgehog信號(hào)通路。CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，GANT61能有效抑制HPC增殖并呈量-效關(guān)系,5 μm GANT61和10 μm GANT61對(duì)HPC的抑制效率分別為60%和87%。EdU細(xì)胞增殖試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組超過70% HPC 處于有絲分裂期，5 μm GANT61和10 μm GANT61處理組細(xì)胞處于有絲分裂期細(xì)胞數(shù)顯著減少，其比例分別為32%和17%，如圖5A-C。

注：A-C.EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，Gli1/Gli2的抑制劑GANT61處理肝臟細(xì)胞48 h，肝祖細(xì)胞增殖受到明顯抑制，進(jìn)入有絲分裂期的細(xì)胞顯著減少圖5 Gli1/Gli2阻斷劑抑制肝祖細(xì)胞增殖

討 論

HPC活化和增殖過程較為復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種因素能調(diào)控HPC的生物學(xué)行為。研究表明，腫瘤細(xì)胞因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑(TWEAK)[8]、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)[9]、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-7(FGF-7)、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子或炎癥因子能調(diào)節(jié)HPC的增殖和分化[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，YB-1能通過Hedgehog信號(hào)通路調(diào)控HPC的增殖。既往研究表明，YB-1能通過多種方式調(diào)控細(xì)胞增殖。Homer等[11]也發(fā)現(xiàn)YB-1能抑制p53的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞中p53的減少，抑制細(xì)胞凋亡的作用減弱，而腫瘤細(xì)胞增殖加速。Stratford等[12]發(fā)現(xiàn)，YB-1能通過促進(jìn)EGFR的表達(dá)而促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。此外YB-1還能促進(jìn)cyclin D1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的增殖[13]。本研究通過RNA-sequence和ChIP-sequence首次發(fā)現(xiàn)YB-1能夠調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路，而該通路被證實(shí)廣泛參與各種干/祖細(xì)胞的增殖以及胚胎發(fā)育，并且多項(xiàng)研究表明該通路亦參與肝損傷后肝再生過程[14-16]。同時(shí)，ChIP-sequence確定該通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子Gli2是YB-1的靶基因，并且結(jié)合位點(diǎn)位于啟動(dòng)子區(qū)，因此推測(cè)YB-1能通過Hedgehog信號(hào)通路調(diào)控HPC增殖。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，YB-1能與Gli2啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并正向調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，Gli1/Gli2的抑制劑GANT61能抑制HPC增殖，這些結(jié)果均表明YB-1能通過調(diào)控Gli2的表達(dá)影響Hedgehog信號(hào)通路的強(qiáng)度，進(jìn)而調(diào)節(jié)HPC的增殖。該研究結(jié)果有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)肝細(xì)胞和肝再生的調(diào)控機(jī)制，能為急性和亞急性肝衰竭開發(fā)新的治療方案提供理論基礎(chǔ)。