梁竟一，胡子毅，王偉軍，陳 波，劉建新，任大喜,

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310058；2.浙江一鳴食品股份有限公司，浙江溫州 325000）

幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，HP）可定植在人的胃部，長期感染還會引起慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍甚至是胃癌[1]。幽門螺旋桿菌傳染性高，并能在人體中長期存活[2]。目前，市面上還沒有預(yù)防幽門螺旋桿菌感染的疫苗，臨床上治療幽門螺旋桿菌感染的方法主要有標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)法和標(biāo)準(zhǔn)四聯(lián)法兩種[3]，但使用抗生素可能會增加幽門螺旋桿菌耐藥性并引起胃腸道菌群失調(diào)等藥物反應(yīng)。

研究表明，使用益生菌輔助三聯(lián)/四聯(lián)法能顯著提高三聯(lián)/四聯(lián)法對幽門螺旋桿菌的根除率[4]，服用乳酸菌及其相關(guān)制品可以減少胃內(nèi)幽門螺旋桿菌的數(shù)量，緩解胃部炎癥和損傷，提高幽門螺旋桿菌的根除率[5?6]。部分益生菌可通過產(chǎn)細(xì)菌素、有機(jī)酸及競爭粘附等抑制幽門螺旋桿菌的生長。Shiro等[7]分離到一株副干酪乳桿菌06TCa19產(chǎn)生大量的乳酸抑制幽門螺旋桿菌的生長，并可以顯著減小鼠胃內(nèi)定植的幽門螺旋桿菌的數(shù)目。Maleki等[8]證明了植物乳桿菌可以通過一些特定的免疫細(xì)胞信號通路來抑制幽門螺旋桿菌引發(fā)的胃癌。譚曉林等[9]使用復(fù)合乳酸菌聯(lián)合抗生素三聯(lián)、四聯(lián)治療幽門螺旋桿菌感染，與單純的使用抗生素治療組相比，既降低了不良藥物反應(yīng)的發(fā)生，同時也提高了幽門螺旋桿菌的根除率。然而，目前相關(guān)菌株的功效及機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[10?11]，開發(fā)具有抗幽門螺旋桿菌活性的新型乳酸菌株，對于預(yù)防和治療幽門螺旋感染意義重大?？褂拈T螺旋桿菌體外篩選，主要以體外抑菌試驗(yàn)（如采用牛津杯法測抑菌圈）結(jié)果為依據(jù)，結(jié)合尿素酶活性抑制及對胃酸及胃蛋白酶的抵抗力進(jìn)一步篩選。此外，益生菌的益生特性如疏水作用力、自凝集率[12]、交互凝集率以及乳酸菌耐受性[13]（如耐酸、耐膽鹽）等對益生菌能否到達(dá)和定植腸道并改善腸道菌群，從而進(jìn)一步發(fā)揮其他益生功效至關(guān)重要。

本研究從發(fā)酵食品、乳制品和嬰兒糞便中篩選具有拮抗幽門螺旋桿菌活性且益生特性良好的乳酸菌，旨在為后續(xù)動物試驗(yàn)和臨床研究，及相關(guān)功能性乳制品的開發(fā)提供菌株和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

供試菌株 本實(shí)驗(yàn)室篩選的各地自釀發(fā)酵蔬菜、甘南青海地區(qū)乳制品、杭州地區(qū)新生嬰兒糞便的遺傳穩(wěn)定性優(yōu)良的疑似乳酸菌菌株39株；指示菌株：幽門螺旋桿菌（Helicobacter Pylori）ATCC43504，大腸桿菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）ATCC 25922、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 13311 美國典型培養(yǎng)物保藏中心；單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）CMCC 54007、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003 中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；甲硝唑、尿素酶、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、幽門螺旋桿菌液體培養(yǎng)基、胃蛋白酶（≥2500 U/mg） 生工生物工程（上海）有限公司；脫脂棉羊血、膽鹽、幽門螺旋桿菌抑菌劑、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；抗生素藥敏試紙 杭州微生物試劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基賽默飛世爾科技公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。TGL-16M低溫高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ES-315高壓滅菌鍋 日本TOMY公司；YS100光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司；WXJFTFG/1200QG標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)櫥 無錫聚峰實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；SW-CJ-IF超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌發(fā)酵上清液與菌懸液的制備 將39株疑似乳酸菌分別接于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后取出，8000 r/min，15 min，4 ℃離心，分別收集上清液和沉淀。上清液采用0.22 μm的濾器除菌，菌體沉淀用無菌PBS洗滌兩次并重懸，使活菌數(shù)達(dá)到108CFU/mL。

1.2.2 幽門螺旋桿菌菌懸液的制備 取100 μL幽門螺旋桿菌涂布于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基中，微需氧環(huán)境中（7%氧氣、10%二氧化碳、83%氮?dú)猓?7 ℃培養(yǎng)72~96 h，挑取純化培養(yǎng)三代后的單菌落接入幽門螺旋桿菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。液體培養(yǎng)后的混合液于8000 r/min，15 min，4 ℃條件下離心，分別收集上清液和菌體沉淀，菌體沉淀用干凈的幽門螺旋桿菌液體培養(yǎng)基洗滌兩次并重懸，使活菌數(shù)達(dá)到107CFU/mL。

1.2.3 乳酸菌對幽門螺旋桿菌抑制率的測定 采用瓊脂擴(kuò)散法來測量菌株對幽門螺旋桿菌的抑菌活性[14]。本試驗(yàn)以濃度為0.05 mg/mL的甲硝唑溶液為陽性對照，MRS液體培養(yǎng)基作為空白對照。

取100 μL幽門螺旋桿菌的菌懸液均勻涂布于不含抗生素的哥倫比亞血瓊脂平板上，每孔加入待測液體100 μL（待測液體分別為乳酸菌發(fā)酵上清液、乳酸菌菌懸液、陽性對照和空白對照）。將接好發(fā)酵液的平板置于37 ℃、微需氧環(huán)境下培養(yǎng)72~96 h，培養(yǎng)結(jié)束后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

乳酸菌對幽門螺旋桿菌的抑制率計(jì)算公式如下：

式中：Rx表示乳酸菌對幽門螺旋桿菌的抑菌圈直徑，cm；Ry表示陽性對照對幽門螺旋桿菌的抑菌圈直徑，cm。

1.2.4 尿素酶活性的測定 采用比色法測定樣品的尿素酶活性[15]，取40 μL幽門螺旋桿菌菌懸液分別與10 μL乳酸菌的發(fā)酵上清液或菌懸液混勻，以10 μL的無菌幽門螺旋桿菌液體培養(yǎng)基為對照?；旌弦杭尤胫粮蓛魺o菌的96孔板中，37 ℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)好的混合液體取出，每個孔內(nèi)加入150 μL的尿素酶試劑（0.9% NaCl，20 mmol/L尿素，14 μg/mL苯酚紅，用HCl調(diào)至pH為6.8），觀察顏色變化并測定其OD550的數(shù)值。

1.2.5 乳酸菌的鑒定 將篩選到的疑似乳酸菌在MRS平板上傳代，記錄平板上的菌落大小及形態(tài)，用革蘭氏染色法處理菌株并與光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。采用試劑盒提取基因組DNA，并采用細(xì)菌通用引物（Forward primer（27f）：AGTTTGATCMTGG CTCAG；Reverse primer（1492r）：GGTTACCTTGTT ACGACT）進(jìn)行PCR，PCR程序見表1。取PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序，將所得到的序列于NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLAST進(jìn)行同源性比較確定菌株。通過MEGA軟件對兩株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行構(gòu)建，采用鄰接法（Neighbor-joining），自展分析1000次重復(fù)構(gòu)建兩株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 PCR程序Table 1 PCR program

1.2.6 乳酸菌酸對模擬胃液的耐受性 以10%（v/v）的量將活菌數(shù)為108CFU/mL的乳酸菌菌懸液接種于pH為1.5的模擬胃液中[16]（0.2% NaCl，胃蛋白酶0.35%，用HCl調(diào)至pH為1.5，0.22 μm過濾除菌備用），并分別在試驗(yàn)進(jìn)行的0、3 h采樣。為保證數(shù)值準(zhǔn)確，使用傾注法進(jìn)行活菌數(shù)的計(jì)數(shù)，取100 μL的乳酸菌菌懸液注入15 mL的55 ℃左右MRS固體培養(yǎng)基內(nèi)，冷卻至平皿內(nèi)培養(yǎng)基定型，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，并基于所得數(shù)值分別計(jì)算兩株乳酸菌3 h后在模擬胃液中的存活率，計(jì)算公式如下：

式中：A3表示乳酸菌株3 h的活菌數(shù)，CFU；A0表示乳酸菌株初始溶液的活菌數(shù)，CFU。

1.2.7 乳酸菌酸耐受性能測定 以10%（v/v）的量將活菌數(shù)為108CFU/mL的乳酸菌菌懸液接種于pH為3.0的MRS液體培養(yǎng)基中（液體培養(yǎng)基pH使用1 mol/L的NaOH與HCl調(diào)節(jié)），分別在0、3 h采樣。為保證數(shù)值準(zhǔn)確，使用傾注法進(jìn)行活菌數(shù)的計(jì)數(shù)，取100 μL的乳酸菌菌懸液注入15 mL的55 ℃左右MRS固體培養(yǎng)基內(nèi)，冷卻后37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，并基于所得數(shù)值分別計(jì)算兩株乳酸菌3 h后的酸耐受率[17]，酸耐受率計(jì)算公式如下：

式中：A3為乳酸菌株3 h的活菌數(shù)，CFU/mL；A0為乳酸菌株初始溶液的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.8 乳酸菌膽鹽耐受性能測定 以10%（v/v）的量將活菌數(shù)為108CFU/mL的乳酸菌菌懸液接種于0.3%牛膽鹽（v/v）的MRS液體培養(yǎng)基中，在0、3 h采樣。為保證數(shù)值準(zhǔn)確，使用傾注法分別計(jì)數(shù)，取100 μL的乳酸菌菌懸液注入15 mL的55 ℃左右MRS固體培養(yǎng)基內(nèi)，冷卻后37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，并基于所得數(shù)值計(jì)算3 h后的膽鹽耐受率[18]，膽鹽耐受率計(jì)算公式如下：

式中：T3為膽鹽處理3 h時的乳酸菌株的活菌數(shù)，CFU；T0為未被膽鹽處理的乳酸菌株的活菌數(shù)，CFU。

1.2.9 乳酸菌疏水性能測定 取2 mL乳酸菌和2 mL二甲苯徹底混合，37 ℃水浴充分振蕩5 min后，并在2 h后測量水相的吸光值[19]，乳酸菌疏水性計(jì)算公式如下：

式中：A0代表乳酸菌株0 h的吸光值；At代表乳酸菌株t h的吸光值。

1.2.10 乳酸菌自凝集性能測定 選取活菌數(shù)為108CFU/mL的乳酸菌發(fā)酵液，8000 r/min，15 min離心收集沉淀，用干凈的PBS洗滌兩次后加入PBS調(diào)至與原發(fā)酵液相同體積。渦旋振蕩器混合均勻后置混合液體于37 ℃培養(yǎng)，測試24 h內(nèi)的OD620nm處的吸光值[17]，乳酸菌自凝集率計(jì)算公式如下：

式中：A0為乳酸菌株0 h的吸光值；At為乳酸菌株t h的吸光值。

1.2.11 乳酸菌與幽門螺旋桿菌交互凝集性能測定幽門螺旋桿菌和乳酸菌的培養(yǎng)和收集同1.2.1，選取活菌數(shù)為108CFU/mL的乳酸菌發(fā)酵液，8000 r/min，15 min離心收集沉淀，用干凈的PBS洗滌兩次后加入PBS調(diào)至與原發(fā)酵液相同體積。渦旋振蕩器混合均勻后置混合液體，加入等體積的幽門螺旋桿菌菌懸液混合，上下顛倒溫和混勻后置于微需氧環(huán)境于37 ℃培養(yǎng)，測試24 h內(nèi)的OD620處的吸光值[17]，乳酸菌與幽門螺旋桿菌交互凝集率計(jì)算公式如下：

式中：Ax為乳酸菌株0 h吸光值；Ay為幽門螺旋桿菌0 h的吸光值；Amix為乳酸菌株與幽門螺旋桿菌t h后的混合吸光值。

1.2.12 乳酸菌對常見致病菌的抑菌活性研究 將四種指示菌株從?80 ℃冰箱取出，放置室溫中解凍，分別挑取少量大腸桿菌和沙門氏菌的菌液于LB固體培養(yǎng)基上活化[20]，挑取少量金黃葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌液于營養(yǎng)瓊脂平板上活化[21]，24 h后挑取固體培養(yǎng)機(jī)上的指示菌株單菌落劃線傳代3次，將最后一次活化的單菌落接于對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后取出，8000 r/min，15 min，4 ℃離心，棄去上清液保留下層菌體沉淀并重懸，使活菌數(shù)達(dá)到108CFU/mL。

使用傾注法測試不同濃度的指示菌懸液的活菌數(shù)，操作方法如下：吸取不同濃度的菌懸液100 μL注入55 ℃液體狀未凝固的LB固體培養(yǎng)基，搖晃至混合均勻，靜置待混合培養(yǎng)基凝固后，37 ℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。選取活菌數(shù)為108CFU/mL的混合液體并測試其OD620nm的吸光值，以此作為初始參照數(shù)值進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)結(jié)果的處理。

1.2.13 抗生素敏感性研究 采用紙片擴(kuò)散法測量乳酸菌株的抗生素敏感性[22]，本研究方法參考臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所技術(shù)指南（CLSI）。10種抗生素分別為諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP）、復(fù)方新諾明（SXT）、慶大霉素（GM）、氯霉素（C）、青霉素（P）、紅霉素（E）、氨芐青霉素（AM）、丁胺卡那（AK）和頭孢唑林（CZ）。

使用廣口錐形瓶配制MRS固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基滅菌后置于55 ℃水浴保溫，待溫度降下來取出置于滅菌后的超凈臺中，將乳酸菌菌懸液（108CFU/mL）按照1%的量接入錐形瓶中，搖晃至混合均勻，將乳酸菌菌懸液與MRS固體培養(yǎng)基混合好后倒入無菌平皿中制成15 mL/皿的LB平板。待MRS平板凝固后，每個平板上均勻的用鑷子輕輕貼上兩只抗生素紙片。將貼好抗生素紙片的平板置于37 ℃，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑（cm）并記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)中每個處理都重復(fù)三次。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及顯著性分析（oneway ANOVA），使用Tukey進(jìn)行多重比較，以P<0.05被認(rèn)為是差異性顯著，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，作圖軟件為Origin9.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌抑制幽門螺旋桿菌生長的測定

將本試驗(yàn)中篩選到的39株疑似乳酸菌逐一進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，通過比較抑菌圈直徑的大小篩選具有抑制幽門螺旋桿菌功能的乳酸菌。本試驗(yàn)以乳酸菌菌懸液與發(fā)酵上清液的抑菌圈大小與陽性對照的比值百分?jǐn)?shù)作為抑菌率，最終篩選到具有抑菌效果的9株乳酸菌，其抑菌結(jié)果見表2。其中菌株D1與GQ1702的乳酸菌菌懸液對幽門螺旋桿菌的抑制率顯著（P<0.05）高于其他乳酸菌，這兩株菌的發(fā)酵上清液對幽門螺旋桿菌的抑制率與菌株YF0101不顯著。

表2 乳酸菌對幽門螺旋桿菌的抑制率和尿素酶活力Table 2 Anti-Helicobacter pylori activity of LAB and urease activity

多數(shù)菌株的菌懸液抑制率高于上清液，其中，D1、GQ1702的菌懸液和YF0101上清液對幽門螺旋桿菌抑制率最高，這三株菌的抑菌圈效果如圖1。

圖1 乳酸菌株對幽門螺旋桿菌的抑菌圈效果圖Fig.1 Inhibitory zone of lactic acid strains against Helicobacter pylori

通過乳酸菌對幽門螺旋桿菌的抑菌圈效果的觀察，發(fā)現(xiàn)MRS液體培養(yǎng)基也具有對幽門螺旋桿菌生長的抑制效果，但這種抑制效果要遠(yuǎn)低于乳酸菌的菌懸液和上清液。乳酸菌的菌懸液與上清液對幽門螺旋桿菌的抑制效果低于陽性對照，植物乳桿菌D1的菌懸液對幽門螺旋桿菌的抑制作用與陽性對照持平。

2.2 乳酸菌對尿素酶活性的抑制

幽門螺旋桿菌的尿素酶活性是通過測定尿素酶分解尿素溶液產(chǎn)生氨提高pH，從而使酚紅由黃色變?yōu)榧t色。乳酸菌對尿素酶活性抑制結(jié)果見表1，所有菌株菌懸液的抑制率均優(yōu)于發(fā)酵上清液，且菌株D1、GQ1702、GQ1501等菌懸液對尿素酶活性的抑制效果最佳。

基于上述結(jié)果，可知菌株D1和GQ1702抗幽門螺旋桿菌抑菌圈和尿素酶抑制效果均較好，因此選取這兩株菌進(jìn)行后續(xù)的研究。

2.3 菌株的鑒定

GQ1702與D1的菌落和菌株形態(tài)見圖2。傳代純化培養(yǎng)后的GQ1702單菌落表面光滑，邊緣不規(guī)則有輕微毛邊形狀，有很強(qiáng)烈的酸乳味道，經(jīng)過革蘭氏染色后該菌株在電子顯微鏡下觀察呈桿狀；D1菌落表面邊緣均光滑，有酸味，形狀規(guī)則呈圓形，中間凸起，該菌株在電子顯微鏡下觀察呈桿狀。

圖2 菌株的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)（400×）Fig.2 Colony morphology and cell morphology（400×）

分別對D1和GQ1702兩株乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)后，提取兩株乳酸菌的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳處理，將電泳檢測后的條帶進(jìn)行PCR處理，再次電泳后分別獲得兩條特異的擴(kuò)增條帶，大小為1.5 kb左右結(jié)果見圖3。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序，根據(jù)GQ1702與D1的測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4和圖5，并將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對。綜合16S rDNA和系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果可知，菌株GQ1702為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticusstrain），菌株D1為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumstrain）。

圖3 PCR擴(kuò)增片段電泳檢測圖Fig.3 Electrophoresis detection diagram of PCR amplified fragments

圖4 菌株GQ1702的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain GQ1702

圖5 菌株D1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain D1

2.4 乳酸菌在模擬胃液中的存活率、酸耐受率、膽鹽耐受率和疏水作用力

在本試驗(yàn)中，GQ1702和D1在模擬胃液中的存活率、酸耐受率、膽鹽耐受率和疏水作用力見表3。菌株D1在pH=1.5的模擬胃液中的存活率和對膽鹽的耐受性更高，但對酸的耐受性及疏水作用力低于GQ1702。

表3 乳酸菌的酸、膽鹽耐受率和疏水作用力Table 3 Acid and bile salt tolerance rate and hydrophobic force of lactic acid bacteria

2.5 乳酸菌株自凝集能力

本試驗(yàn)中分別對菌株D1和GQ1702的自凝集率進(jìn)行了測試，結(jié)果見圖6。在培養(yǎng)時間達(dá)到16 h時，菌株GQ1702的自凝集率高于D1，且兩者的自凝集率均達(dá)到最大值，分別為84.67%和71.79%，然而，20 h后兩株菌的自凝集率有下降趨勢且差異不顯著（P>0.05），在24 h時趨于穩(wěn)定，分別為75.53%和68.61%，說明20 h前后兩株乳酸菌具有最高的凝集成團(tuán)能力且穩(wěn)定聚集。

圖6 乳酸菌自凝集作用Fig.6 Self agglutination of lactic acid bacteria

2.6 乳酸菌與幽門螺旋桿菌的交互凝集力

本試驗(yàn)分別對D1和GQ1702與幽門螺旋桿菌的交互凝集率進(jìn)行了測試，試驗(yàn)結(jié)果見圖7。在培養(yǎng)期間，兩株菌交互凝集能力無顯著性差異。在培養(yǎng)時間達(dá)到16 h時，菌株GQ1702與菌株D1的交互凝集率均達(dá)到最大值，之后趨于穩(wěn)定。這說明這兩株菌與幽門螺旋桿菌在16 h前后結(jié)合最為緊密且不易松散。

圖7 乳酸菌交互凝集作用Fig.7 Cross agglutination of lactic acid bacteria

2.7 乳酸菌對其他致病菌的抗菌活性

在本試驗(yàn)中，采用4種腸道致病菌作為指示菌，分別檢測菌株D1和GQ1702的菌懸液與發(fā)酵上清液的抑菌活性，數(shù)據(jù)結(jié)果見表4。

表4 結(jié)果表明GQ1702和D1對四種致病菌均有抑制作用，尤其是對革蘭氏陽性細(xì)菌單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制作用最強(qiáng)，但對鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用最小。 D1和GQ1702的上清液抑菌效果均高于其對應(yīng)的菌懸液的抑菌效果。

表4 乳酸菌GQ1702和D1的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of strain GQ1702 and D1

2.8 乳酸菌的抗生素敏感性

本試驗(yàn)中分別對D1和GQ1702的常見藥物的敏感性試驗(yàn)，結(jié)果見圖8。

圖8 乳酸菌的抗生素敏感性Fig.8 Antibiotic sensitivity of lactic acid bacteria

10種抗生素中，GQ1702對其中9種抗生素的敏感性大于D1，GQ1702和D1均對氯霉素、青霉素、紅霉素、氨芐青霉素和頭孢唑林都表現(xiàn)出極高的敏感性，對諾氟沙星、環(huán)丙沙星和丁胺卡那不敏感。這兩株乳酸菌對復(fù)方新諾明和慶大霉素具有不同的敏感性。

3 討論

乳酸菌抑制幽門螺旋桿菌生長研究受到越來越多的關(guān)注，研究表明某些乳酸菌的菌懸液或發(fā)酵上清液具有抑制幽門螺旋桿菌生長的作用。Techo等[23]對從泰國發(fā)酵米粉中篩選到的32株乳酸菌進(jìn)行幽門螺旋桿菌的抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明，其中15株菌對幽門螺旋桿菌具有抑制作用；Lactobacillus reuteriC234、Lactobacillus plantarum18和Lactobacillus caseiBD-II等乳酸菌的抑制效果相當(dāng)于0.05 mg/mL的甲硝唑抑菌效果的46.25%~100%[17]。本研究中瑞士乳桿菌GQ1702發(fā)酵上清液和菌懸液的抑制率分別為76.52%和85.01%，植物乳桿菌D1的發(fā)酵上清液和菌懸液的抑制率分別為72.39%和100.68%。研究表明乳酸菌在體外抑制幽門螺旋桿菌的生長可能與其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有關(guān)，這些物質(zhì)包括有機(jī)酸比如乳酸[24]和抗菌肽[25]等。本研究兩株菌的抑菌效果優(yōu)于其他菌株，可能是由于這兩株乳酸菌產(chǎn)生了較高的抑制幽門螺旋桿菌的物質(zhì)如抗菌肽所致。

幽門螺旋桿菌能夠產(chǎn)生尿素酶，提高胃內(nèi)環(huán)境中的pH，增加幽門螺旋桿菌在胃內(nèi)的存活率[26]。尿素酶還能影響幽門螺旋桿菌的能量代謝，使幽門螺旋桿菌更容易粘附于胃部，并持續(xù)性的對胃部細(xì)胞產(chǎn)生直接毒性效應(yīng)[27]。乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物可以抑制尿素酶的活性，從而對幽門螺旋桿菌的生長起到抑制作用[28?30]。在本研究中，乳酸菌菌懸液對尿素酶活性抑制效果并不明顯，與某些乳酸菌菌懸液的抑菌效果差異較大，這可能是由于乳桿菌起到抑制幽門螺旋桿菌作用的物質(zhì)全部處于發(fā)酵上清液中，如乳酸等[23]。

在人體中，胃酸能殺死大部分微生物，而胃液中的蛋白酶對微生物也有一定的影響。因此在模擬胃液中的存活率和耐酸性是乳酸菌停留或通過胃液的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中的兩株乳酸菌在模擬胃液中均能存活，其中植物乳桿菌D1的存活率要遠(yuǎn)高于瑞士乳桿菌GQ1702，說明菌株D1比GQ1702更容易在胃中存活。這兩株乳酸菌耐酸性極強(qiáng)，與嗜酸乳桿菌相當(dāng)[31]，這可能是由于乳酸菌本身復(fù)雜的耐酸機(jī)制，如細(xì)胞膜組成變化、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外pH[32]、自動調(diào)節(jié)雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)等[33]。膽鹽耐受性試驗(yàn)旨在測試乳酸菌是否能夠通過模擬人體腸道環(huán)境，從而提高存活的定植概率。大部分乳酸菌的在膽鹽中的存活率都處于0.2%~0.4%之間[34?36]，而本試驗(yàn)中的植物乳桿菌D1和瑞士乳桿菌GQ1702在膽鹽中的存活率都在1%左右，這說明GQ1702與D1比起大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的具有抗幽門螺旋桿菌活性的乳酸菌，更有可能在腸道中存活甚至定植。

微生物的自凝集能力是指其在水溶液中自主聚集成團(tuán)的能力，且具有可逆性[37]。拮抗幽門螺旋桿菌的乳酸菌[17]和高粘附性乳酸菌[38]的自凝集率通常在45%~66%左右，而本試驗(yàn)中兩株乳酸菌的自凝集率為75.53%和68.61%，這說明本試驗(yàn)的兩株乳酸菌與幽門螺旋桿菌的結(jié)合更為緊密，探究可能的原因是菌體的靜電作用或者是疏水作用。研究發(fā)現(xiàn)某些乳酸菌的自凝集率與粘附性正相關(guān)，自凝集率高的菌株往往能聚集成膜，并通過競爭抑制阻礙了有害菌群在胃腸道上的定植以及對黏膜的侵害[19]。

交互凝集現(xiàn)象指的是不同菌株之間的凝集現(xiàn)象，乳酸菌與幽門螺旋桿菌之間的凝集作用被認(rèn)為與抑制幽門螺旋桿菌的能力相關(guān)[39]。靳彩娟[40]測定了乳酸菌與副溶血性弧菌、大腸桿菌和金黃葡萄球菌的交互凝集能力，發(fā)現(xiàn)交互凝集能力較好的乳酸菌的與致病菌的交互凝集率通常在35%~45%。陳曉華等[17]測試了16株乳酸菌與幽門螺旋桿菌的交互凝集率，交互凝集率在43.71%~59.25%之間。與上述菌株相比，本試驗(yàn)中瑞士乳桿菌GQ1702與植物乳桿菌D1的交互凝集率分別為61.18%和57.25%，都達(dá)到了較高的水平，猜測這兩株乳酸菌與幽門螺旋桿菌可能存在表面結(jié)合位點(diǎn)，可以在人體內(nèi)與幽門螺旋桿菌緊密結(jié)合，并促進(jìn)幽門螺旋桿菌排出體外。

綜上所述，本研究通過抗幽門螺旋桿菌和抑制尿素酶活性篩選到2株乳酸菌D1和GQ1702，結(jié)果表明，這兩株菌具有良好抑制幽門螺旋桿菌能力。此外，這兩株菌具有良好益生性能，比如耐酸、耐膽鹽，表明該菌株能夠到達(dá)腸道；良好的自凝集性和交互凝集性及抗菌特性表明這兩株菌能一定程度上抵御腸道有害菌的侵害；較好的表面疏水性表明該菌株可能在腸道粘附；抗生素敏感性結(jié)果表明該菌株安全性較好。因此，乳酸菌D1和GQ1702具有良好的抗幽門和益生性能，具有開發(fā)抗幽門螺旋桿菌產(chǎn)品的潛力。

4 結(jié)論

本研究通過幽門螺旋桿菌抑制率及尿素酶活性試驗(yàn)篩選到2株具有潛在拮抗幽門螺旋桿菌的功效的乳酸菌，瑞士乳桿菌GQ1702和植物乳桿菌D1。其發(fā)酵產(chǎn)物的抗幽門螺旋桿菌活性分別相當(dāng)于濃度為0.038和0.034 mg/mL甲硝唑的抑制率。菌株D1和GQ1702都能在模擬胃液中存活，并且D1的存活率（12.04%）要遠(yuǎn)高于GQ1702（0.11%）。菌株GQ1702和D1具有較好的酸耐受性和膽鹽耐受性，其中GQ1702的膽鹽耐受率為1.08%。這兩株菌均有較高的自凝集性和與幽門螺旋桿菌的交互凝集性，且對常見8種抗生素不耐受并有較好的抗菌活性。本研究篩選的瑞士乳桿菌GQ1702和植物乳桿菌D1具有良好的拮抗幽門螺旋桿菌的功效及益生性能，具有進(jìn)一步開發(fā)功能性乳制品潛力。