王思溥，朱 丹，寧志雪，朱立斌，牛廣財, ，魏文毅，苗欣月

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶 163319）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa（Michx.）Elliott）為薔薇科腺肋花楸屬灌木漿果，又稱野櫻莓、不老莓，在遼寧、吉林、黑龍江、江蘇、浙江等多省種植。黑果腺肋花楸果實富含多酚、膳食纖維、蛋白質、脂肪、有機酸、碳水化合物、維生素和礦物質等多種營養(yǎng)物質，其中，多酚類物質具有非常重要的保健作用[1?2]。黑果腺肋花楸的生物活性顯著，具有良好的抗氧化和抗炎抑菌活性，可以提高人體免疫力，保肝明目，預防糖尿病與心腦血管等疾病[3?8]。李美蘭等[9]連續(xù)8周給小鼠投喂?jié)舛葹?%的黑果腺肋花楸溶液發(fā)現(xiàn)，試驗組小鼠肝臟組織中的超氧化物歧化酶（SOD）活力升高，腎臟組織中丙二醛（MDA）含量明顯降低，谷胱甘肽（GSH）相對含量增加，說明黑果腺肋花楸具有一定抗氧化性。國家衛(wèi)生健康委員會于2018年根據《食品安全法》有關規(guī)定，將黑果腺肋花楸果實正式列為新食品原料（2018年第10號）[10]。這為該果實作為一種新食品原料提供了法規(guī)支持，也為其深度開發(fā)奠定了基礎。

近年來，國內外對黑果腺肋花楸的栽培、果實成分分析與功能作用的研究較多[11?13]。盡管該果實有很強的生理活性，但由于其本身具有澀味等原因，大眾對黑果腺肋花楸果實的鮮食接受度不高。因此，果實的深加工就顯得尤為重要。目前，市場上黑果腺肋花楸主要以果酒為主，其他果汁、果粉、果凍、果醬、果干等產品較少[14?15]，尚處于起步階段，而國外黑果腺肋花楸果汁類產品已經商業(yè)化。由于黑果腺肋花楸果實中的原花青素等物質，使果汁具有很明顯的澀味和收斂性。為解決這一問題，本實驗中采用β-環(huán)糊精改善原果汁的澀味，輔以蔗糖、檸檬酸等原料，提高產品整體風味，并對其抗氧化活性和主要理化指標進行測定，以期為黑果腺肋花楸新食品原料的開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果腺肋花楸果 鮮果，延邊黑果科技發(fā)展有限公司；檸檬酸 連云港龍?zhí)┩称放淞嫌邢薰?；果膠酶（40 U/mg）、纖維素酶（30 U/mg） 泰興一鳴生物制品有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ABTS法總抗氧化能力檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；原花青素標準品（UV≥95%） 上海源葉生物科技有限公司；過氧化氫、無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、磷酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、β-環(huán)糊精、VC、香草醛、無水甲醇等 分析純，天津大茂化學試劑廠。

WBL1021S打漿機 美的生活電器制造有限公司；恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；WS108型手持糖度計 上海測維光電技術有限責任公司；HY-4T調速振蕩器 上海力辰儀器科技有限公司；GYB1003高壓均質機 上海東華均質機廠；EX324電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；TG16-WS離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計 上海凌析達儀器公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司（HITACHI）；pHS-25酸度儀 上海平軒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑果腺肋花楸果汁飲料制備

1.2.1.1 工藝流程

1.2.1.2 操作要點 打漿與酶解：對新鮮的黑果腺肋花楸果實進行挑選，剔除腐爛傷病的果實，選擇顆粒飽滿的作為原料。經除梗、清洗后，按照黑果果實與純凈水1:2的比例添加純凈水，用打漿機破碎成果漿，并進行酶解。纖維素酶與果膠酶的比例為5:4，酶的添加量控制在原料的0.06%左右，于45 ℃恒溫水浴條件下，酶解3.5 h[16]；過濾：將酶解后的黑果果漿在60目絹布下進行過濾，濾去果渣后，得到黑果腺肋花楸浸提汁備用；調配：將白砂糖溶解于純凈水中，加熱溶化，過濾后制成60%的蔗糖糖漿；檸檬酸、β-環(huán)糊精分別配成2%的檸檬酸溶液和1%的β-環(huán)糊精，并按照配方劑量將這些輔料添加至黑果腺肋花楸浸提汁中，加入純凈水后混合均勻，調配制成黑果腺肋花楸果汁飲料；均質與脫氣：使用高壓均質機將經過調配的飲料進行均質，在25 MPa下均質10 min[17]，然后于0.05 MPa的真空條件下脫氣15 min；灌裝與殺菌：將均質脫氣后的飲料灌裝到滅菌的玻璃瓶中并封蓋，在85 ℃下殺菌30 min，冷卻至室溫后得到黑果腺肋花楸果汁飲料成品。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 黑果腺肋花楸浸提汁用量對飲料感官評分的影響 在蔗糖糖漿添加量為10%，檸檬酸添加量2%，β-環(huán)糊精添加量4%的條件下，考察黑果腺肋花楸浸提汁用量（45%、50%、55%、60%、65%）對黑果腺肋花楸果汁飲料感官評分的影響。

1.2.2.2 蔗糖糖漿添加量對飲料感官評分的影響在黑果腺肋花楸浸提汁用量為55%，檸檬酸添加量2%，β-環(huán)糊精添加量4%的條件下，考察蔗糖糖漿添加量（6%、8%、10%、12%、14%）對黑果腺肋花楸果汁飲料感官評分的影響。

1.2.2.3 檸檬酸添加量對飲料感官評分的影響 在黑果腺肋花楸浸提汁用量為55%，蔗糖糖漿添加量10%，β-環(huán)糊精添加量4%的條件下，考察檸檬酸添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）對黑果腺肋花楸果汁飲料感官評分的影響。

1.2.2.4β-環(huán)糊精添加量對飲料感官評分的影響 在黑果腺肋花楸浸提汁用量為55%，蔗糖糖漿添加量10%，檸檬酸添加量2%的條件下，考察β-環(huán)糊精添加量（2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%）對黑果腺肋花楸果汁飲料感官評分的影響。

1.2.3 正交試驗 通過單因素實驗確定黑果腺肋花楸浸提汁、蔗糖糖漿、檸檬酸以及β-環(huán)糊精四個影響因素的添加量范圍，為該黑果腺肋花楸果汁飲料的配方設計四因素三水平L9（34）的正交試驗，其因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of the orthogonal experiment

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 感官指標 隨機選擇10位經過食品感官評價培訓的人員，對調配的飲料進行感官品評，滿分100分。根據所調配飲料的口味（40%）、香氣（30%）、色澤（15%）、組織狀態(tài)（15%）四方面因素的綜合感官特性，在參考劉艷懷等[18]評分標準的基礎上進行修改，依據表2所示的感官評分標準給出相應分數，最終評分取平均值。

表2 黑果腺肋花楸飲料感官評分標準（分）Table 2 Sensory evaluation standard of black chokeberry beverage(scores)

1.2.4.2 理化指標測定 總酸含量測定：參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》的方法測定[19]；可溶性固形物含量測定：參照GB/T 12143-2008《飲料通用分析方法》中折光計法測定[20]；pH：使用酸度計在室溫下進行測定；氨基酸測定：采用全自動氨基酸分析儀[21]；原花青素含量的測定：參照徐杰等[16]方法。

1.2.4.3 微生物指標測定 菌落總數檢測：參照GB 4789.2-2016規(guī)定的方法[22]；大腸菌群檢測：參照GB 4789.3-2016規(guī)定的方法[23]；沙門氏菌檢測：參照GB 4789.4-2016規(guī)定的方法[24]；金黃色葡萄球菌檢測：參照GB 4789.10-2016規(guī)定的方法進行檢測[25]。

1.2.4.4 DPPH自由基清除能力的測定 參考文獻[26?27]方法，取稀釋后的樣液2 mL于試管中，加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，搖勻，在25 ℃水浴中保溫20 min；無水乙醇溶液調零，于517 nm處測定吸光度值A1；用無水乙醇溶液替代樣液為空白對照，測其吸光度值A0；然后用無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測定吸光度值A2。按照公式（1）計算。

式中：A0—空白吸光度值；A1—樣品吸光度值；A2—樣品在體系中吸光度值。

1.2.4.5 羥自由基清除能力的測定 參考文獻[28]方法，取2 mL樣液于試管中，分別加入6 mmol/L H2O2溶液和6 mmol/L FeSO4溶液各2 mL，搖勻后靜置10 min，再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻后置于37 ℃保溫1 h，于510 nm處測定吸光度值A1；以去離子水為參比溶液，測定其吸光度值A0，再以蒸餾水替代水楊酸溶液，測定其吸光度值A2。按照公式（2）計算。

式中：A0—參比吸光度值；A1—樣液吸光度值；A2—樣液在體系中吸光度值。

1.2.4.6 ABTS+自由基清除能力的測定 采用總抗氧化能力檢測試劑盒測定，參照盒中說明書的方法，根據ABTS+自由基清除能力的標準曲線方程：y=?1.1214x+1.1262（R2=0.9957）進行計算。其中，x表示吸光度值，y為ABTS+自由基清除能力。

1.2.4.7 總還原能力的測定 參考文獻[29]方法，取1 mL樣液于試管中，加入pH6.6的磷酸緩沖液和1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，于50 ℃水浴中保溫20 min，再加入10 g/100 mL的三氯乙酸溶液2.5 mL，充分震蕩后離心，取2.5 mL上清液，加入蒸餾水和1 g/100 mL的鐵氰化鉀各2.5 mL，混勻后靜置10 min，于700 nm處測定其吸光度（OD）值，OD值越大，反應所測樣液的總還原力越強。

1.3 數據處理

本實驗采用Excel2010軟件和SPSS25.0軟件進行作圖和統(tǒng)計分析，實驗結果均采用平均值±標準差（xˉ±s）表示。

2 結果與分析

2.1 黑果腺肋花楸浸提汁用量的選擇

黑果腺肋花楸果汁呈誘人的紫黑色，色澤明亮，果香濃郁，能夠賦予飲料鮮亮的顏色和良好的風味。黑果腺肋花楸浸提汁用量對感官評分的影響較大，如圖1所示，當浸提汁添加量在55%~60%的范圍時，所調配飲料的口味、香氣、色澤和組織狀態(tài)等方面的感官特性較好，評分能達到90分左右，這與毛曉峰等[30]研究黑果腺肋花楸藍莓復合果汁的果汁總添加量54%（黑果腺肋花楸汁22%，藍莓汁32%）以及劉艷懷等[18]研制的黑果腺肋花楸黑枸杞復合飲料配方中果漿添加量60%（黑果腺肋花楸漿20%，黑枸杞漿40%）的比例范圍一致。當浸提汁用量低于50%時，飲料的色澤和風味相對較差，感官評分低于80分；當浸提汁用量高于60%時，雖然飲料的風味較好，但其糖酸比嚴重失調，評分較低。由此可見，黑果腺肋花楸浸提汁的用量控制在50%~60%較為合適，因此，選擇50%、55%、60%三個水平進行正交試驗。

圖1 黑果腺肋花楸浸提汁用量對飲料感官評分的影響Fig.1 Effect of black chokeberry extract content on sensory score of the beverage

2.2 蔗糖糖漿添加量的選擇

添加蔗糖能夠改善果汁飲料的糖酸比，使其風味協(xié)調，酸甜可口。將白砂糖在加熱的條件下溶解于純凈水中，配制濃度為60%的蔗糖糖漿，可以使蔗糖溶解均勻，提高飲料的澄清度。從圖2中可以看出，當蔗糖糖漿添加量為10%時，飲料整體風味協(xié)調，酸甜爽口，感官評分達到90.5分，這與王雪松等[31]在黑果腺肋花楸酵素飲料中6%蔗糖的添加量相一致。但是，當蔗糖量添加過多或過少時，感官評分下降至85分以下，飲料的酸甜比例失調，對感官特性產生不利影響。因此，60%蔗糖糖漿的添加量應控制在8%~12%的范圍內，即選擇8%、10%、12%三個水平進行正交試驗。

圖2 蔗糖糖漿添加量對黑果飲料感官評分的影響Fig.2 Effect of sugar syrup content on sensory score of blackchokeberry beverage

2.3 檸檬酸添加量的選擇

檸檬酸具有溫和爽快的酸味，是一種良好的酸味劑。同時，添加檸檬酸能夠調節(jié)飲料的pH呈酸性，有利于抑菌和產品的保存[32]。由圖3可知，當檸檬酸的添加量在1.5%~2.5%時，所調配的飲料酸味適口，口感清爽，感官評分在87.8~89.8分之間；當添加量高于2.5%時，飲料的酸味過于突出，糖酸比不協(xié)調，掩蓋了其他的風味；當添加量低于1.5%時，則飲料的口味偏淡，感官評分較低。因此，2%檸檬酸添加范圍控制在1.5%~2.5%為宜，要稍低于黑果腺肋花楸藍莓復合飲料中0.08%的檸檬酸添加量[30]，目的是更好地保持黑果腺肋花楸果汁原有的風味。因此，選擇1.5%、2.0%、2.5%三個水平進行正交試驗。

圖3 檸檬酸添加量對黑果飲料感官評分的影響Fig.3 Effect of citric acid content on sensory score of black chokeberry beverage

2.4 β-環(huán)糊精添加量的選擇

黑果腺肋花楸果汁的澀味較明顯，在調配時會很大程度影響飲料的風味。β-環(huán)糊精常作為苦味物質的包埋劑，它易溶于水，可以在不影響果汁的營養(yǎng)成分情況下達到掩蓋苦味的效果[33]。由圖4可知，當β-環(huán)糊精的添加量為3%左右時，感官評分可達89.8分，制得的飲料具有較高評分，說明β-環(huán)糊精的包埋作用能夠有效減輕黑果腺肋花楸浸提汁的苦澀味[34]。但是，當添加量高于4%時，飲料口感不好，感官評分開始下降。因此，β-環(huán)糊精的用量范圍控制在2%~4%為宜，選擇2%、3%、4%三個水平進行正交試驗。

圖4 β-環(huán)糊精添加量對黑果飲料感官評分的影響Fig.4 Effect of β-cyclodextrin content on sensory score of black chokeberry beverage

2.5 正交試驗結果

對黑果腺肋花楸果汁飲料感官評分進行正交試驗的結果如表3所示，由極差分析的R值可知，對黑果腺肋花楸果汁飲料感官品質影響因素的主次順序為：A黑果腺肋花楸浸提汁用量>B蔗糖糖漿添加量>C檸檬酸添加量>Dβ-環(huán)糊精添加量。由表4的方差分析結果可知，因素A的差異性顯著（P<0.05），其他幾個因素的差異性不顯著，即黑果腺肋花楸浸提汁用量對該果汁飲料的感官評分影響最大，影響效果最為顯著（P<0.05）。根據表3中的k值，可以得到黑果腺肋花楸果汁飲料的最佳配方為A3B2C2D2，即黑果腺肋花楸浸提汁的用量為60%，60%蔗糖糖漿的添加量為10%，2%檸檬酸溶液的添加量2.0%，1%β-環(huán)糊精的添加量3.0%。按照此最佳配方進行3次驗證性實驗，所調配的黑果腺肋花楸果汁飲料感官評分為94.5分。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of the orthogonal experiment

表4 正交試驗方差分析表Table 4 Variance analysis for the orthogonal test

2.6 黑果腺肋花楸果汁飲料的品質評價

2.6.1 感官指標 黑果腺肋花楸果汁飲料的糖酸比例適中，整體風味協(xié)調，口感清爽；具有較濃郁的黑果腺肋花楸果實的特征香氣，香味協(xié)調柔和；色澤明亮均一，呈誘人的紫黑色；組織狀態(tài)均勻一致。

2.6.2 主要理化指標 黑果腺肋花楸果汁飲料中浸提汁含量為60%，原花青素含量為258.34 mg/100 g；可溶性固形物≥13%，pH為3.8~4.2。說明飲料的營養(yǎng)成分豐富，營養(yǎng)價值較高，飲料pH低于4.5有利于抑制微生物生長，且常壓殺菌就可達到殺菌效果。

2.6.3 氨基酸含量指標 黑果腺肋花楸果汁飲料氨基酸組成情況如表5所示。由表5可知，該飲料中共檢測出16種氨基酸，總量達到374.79 μg/mL，其中，亮氨酸、精氨酸和賴氨酸的含量位居前3位，分別為63.42、49.66和46.28 μg/mL；必需氨基酸含量為179.81 μg/mL，必需氨基酸/總氨基酸（essential amino acid/total amino acids，EAA/TAA）為47.98%，高于蛋白質理想模式（EAA/TAA ≈ 40%），其高于賈曉韓等[35]研究黑果腺肋花楸中必需氨基酸含量占總水解氨基酸的39.57%，這可能與原料本身的差異或工藝流程不同有關；本產品中必需氨基酸/非必需氨基酸（essential amino acid/nonessential amino acid，EAA/NEAA）為92.22%，遠高于蛋白質理想模式（EAA/NEAA≥60%），且高于沙棘、樹莓等漿果的EAA/NEAA指標[36?37]，這表明黑果腺肋花楸果汁飲料是理想的蛋白質來源，營養(yǎng)價值較高。此外，黑果腺肋花楸果汁飲料中還包含8種藥用氨基酸，占氨基酸總量的60.35%，具有一定的藥用價值。其中，含量較高的3種藥用氨基酸，例如，亮氨酸能分泌胰島素和胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）降低機體血糖[38]，精氨酸可以通過調節(jié)內分泌激素進行免疫調節(jié)，增強肌體免疫力[39]，賴氨酸常作為限制性氨基酸，對促進鈣吸收起到至關重要的作用[40]。同時，該果汁飲料中富含多種呈味氨基酸，其含量較高，占氨基酸總量的84.16%，不同的呈味氨基酸相互協(xié)調，構成了該果汁飲料特有的風味；支鏈氨基酸有保肝護肝、抑制癌細胞、降低膽固醇等功效[41]，黑果腺肋花楸果汁飲料中的支鏈氨基酸占氨基酸總量的28.43%。由此可見，該果汁飲料不僅氨基酸種類豐富，而且含量較高，具有重要的醫(yī)療保健價值，其開發(fā)前景廣闊。

表5 黑果腺肋花楸果汁飲料的氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of black chokeberry beverage

2.6.4 微生物指標指標 黑果腺肋花楸果汁飲料的菌落總數<100 CFU/mL，大腸桿菌未檢出，致病菌未檢出。該產品的上述指標，符合GB 7101-2015《食品安全國家標準 飲料》中菌落總數<104CFU/mL的要求[42]。

2.7 黑果腺肋花楸飲料的抗氧化能力

以4 mg/mL的維生素C溶液作為對照，分別對黑果腺肋花楸果汁飲料產品的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、ABTS自由基清除能力以及總還原能力進行測定。由表6可以看出，本研究所制得的黑果腺肋花楸果汁飲料的抗氧化能力雖然不及維生素C，但也具有一定的抗氧化活性，其對DPPH自由基清除率為36.42%，羥自由基清除率為32.58%，對ABTS自由基的清除能力為0.54 mmol/L，總還原能力為0.289。該結果略低于張海平等[43]研究中黑果腺肋花楸鮮榨果汁的DPPH自由基清除能力（52.25%）、羥自由基清除能力（49.69%）和總還原能力（0.372），這可能是由于黑果腺肋花楸鮮果汁中活性成分含量較高，因此其上述抗氧化指標的數值較高，而本研究中是經過調配的飲料，在口感和風味上具有更高的接受度。綜上，利用本實驗配方調配的黑果腺肋花楸果汁飲料不僅品質較佳，還具有一定程度的抗氧化能力，適宜生產具有保健作用的功能性飲料。

表6 黑果腺肋花楸果汁飲料的抗氧化能力Table 6 Antioxidant capacity of black chokeberry beverage

3 結論

本實驗以黑果腺肋花楸果實為主要原料，制備了具有營養(yǎng)保健功能的黑果腺肋花楸果汁飲料，并確定其最佳配方：黑果腺肋花楸浸提汁用量為60%，60%蔗糖糖漿添加量10%，2%的檸檬酸添加量2.0%，1%β-環(huán)糊精添加量3.0%。在此條件下調配的果汁飲料富含16種氨基酸，總量可達到374.79 μg/mL，具有濃郁的黑果腺肋花楸特征香氣，色澤均一明亮，整體風味協(xié)調爽口，質地均勻，感官評分可達94.5分?？寡趸钚越Y果顯示：該飲料產品對DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、ABTS自由基清除能力以及總還原能力分別為36.42%、32.58%、0.54 mmol/L和0.289。研制的黑果腺肋花楸果汁飲料具有較高的抗氧化活性，具有廣闊的市場前景和開發(fā)潛力。