孟 然，楊雅華，李趙嘉，王秀萍，薛志忠

（河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所，唐山市植物耐鹽研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山 063200）

隨著生態(tài)環(huán)境的惡化，鹽漬化土壤成為農(nóng)業(yè)發(fā)展面臨的重要問(wèn)題之一，嚴(yán)重制約著農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成很大的威脅，導(dǎo)致土壤退化，土地利用率降低。鹽生植物是一類能夠在鹽堿化程度較高的土壤中生長(zhǎng)的植物，不僅對(duì)鹽堿地區(qū)的土壤、氣候等環(huán)境條件具備很強(qiáng)的適應(yīng)性，而且可對(duì)土壤起到積極的修復(fù)作用，增加土壤養(yǎng)分含量、降低土壤中重金屬含量等[1?2]。

鹽地堿蓬〔Suaeda salsa（L.）Pall.〕又名翅堿蓬，俗名黃須菜，為藜科堿蓬屬一年生草本鹽生植物[2]，一般生于鹽堿荒地上，耐鹽性極強(qiáng)，是鹽堿地的典型指示植物[3]。鹽地堿蓬幼芽鮮嫩可以食用，含有蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維、脂肪酸、礦物質(zhì)、黃酮類化合物等化學(xué)成分[4]，其中維生素尤以抗壞血酸含量最為突出，最高可達(dá)到822 μg/g，與蔬菜中含量較高的辣椒幾乎相當(dāng)，可作為野生蔬菜中較好的抗壞血酸來(lái)源[5]；蛋白質(zhì)與膳食纖維共同占干物質(zhì)總量的30%以上[4]；氨基酸含量豐富，種類齊全，必需氨基酸構(gòu)成合理[6]，是一種極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的野菜，被譽(yù)為“菜中靈芝”[7]，也是鹽堿地區(qū)家家戶戶常食野菜之一。

亞硝酸鹽超標(biāo)已經(jīng)成為影響食品安全的重要原因之一，由于生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性，鹽地堿蓬等野菜中亞硝酸鹽含量顯然成為一項(xiàng)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。現(xiàn)有文獻(xiàn)多記載山東鹽城、東營(yíng)及山西汾河灘地區(qū)堿蓬亞硝酸鹽情況，不同地區(qū)堿蓬亞硝酸鹽含量存在較大差異，部分亞硝酸鹽含量超過(guò)了聯(lián)合國(guó)糧食農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織規(guī)定和中國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（亞硝酸鹽含量≤20 mg/kg）[8]。當(dāng)前，隨著對(duì)鹽地堿蓬作為優(yōu)質(zhì)的蔬菜、經(jīng)濟(jì)作物和具有醫(yī)療保健價(jià)值屬性的充分認(rèn)識(shí)，鹽地堿蓬資源的開(kāi)發(fā)引起人們的重視，但缺少對(duì)品質(zhì)控制較為系統(tǒng)的研究。

本試驗(yàn)以鹽地堿蓬為研究對(duì)象，考察了不同濃度鹽脅迫處理對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的鹽地堿蓬水分、蛋白質(zhì)、氨基酸、抗壞血酸、亞硝酸鹽和總黃酮含量的影響，了解鹽地堿蓬的耐鹽性；利用優(yōu)化后的鹽地堿蓬總黃酮提取方法對(duì)鹽地堿蓬總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，以期為鹽地堿蓬栽培提供技術(shù)支撐，為其總黃酮的提取及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曹妃甸沿海地區(qū)野生的鹽地堿蓬〔Suaeda salsa（L.）Pall.〕 2019年3月17日播種，于苗期、花期、結(jié)果期（每段時(shí)期的第10 d分別取樣）選取生長(zhǎng)良好的植株采集地上部分10 cm作為待測(cè)樣本；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：R701800） 德國(guó)Dr.Chemical有限公司；纖維素酶（貨號(hào)：C805042，10000 U/g）、果膠酶（貨號(hào)：P816736，30000 U/g） 上海麥克林生化科技有限公司；磷酸、甲醇色譜醇 Fisher Chemical公司；無(wú)水乙醇、草酸、抗壞血酸、碳酸氫鈉、2,6-二氯酚靛酚 分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；氨基酸含量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC1570）、亞硝酸鹽含量測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：BC1490）、雙縮脲法蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC3180） 北京Solaibio科技有限公司；水為屈臣氏純凈水。

AP124W電子天平 島津公司；JT-1027HTD機(jī)械超聲波清洗機(jī) 深圳市潔拓超聲波清洗設(shè)備有限公司；D-37520 osterode臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Biofagestratos公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海力辰邦儀器科技有限公司；SCIENTZ-48組織研磨機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；1200型高效液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹽脅迫處理方法 試驗(yàn)在河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所濱海農(nóng)業(yè)綜合試驗(yàn)基地地下式水泥池內(nèi)進(jìn)行。為保證鹽脅迫后各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用寧亞茹和李趙嘉等[9?10]的自吸水裝置進(jìn)行鹽脅迫處理，土壤鹽度梯度分別設(shè)定為0.30%、0.60%、0.90%、1.20%共4個(gè)處理，以低鹽漬土（含鹽量為0.10%）為對(duì)照CK。每個(gè)處理設(shè)6盆重復(fù)，每盆8株。經(jīng)鹽脅迫處理后于苗期、花期、結(jié)果期分別取樣測(cè)定各組分含量。

1.2.2 組分測(cè)定 將每一份鹽地堿蓬樣本分成兩部分，一部分留用鮮樣待測(cè)，一部分用流動(dòng)水洗去表面泥沙，再用蒸餾水沖洗3~4次，自然陰干，烘干后粉碎過(guò)100目篩，粉末備用。

1.2.2.1 基本營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定 水分、抗壞血酸、蛋白質(zhì)、氨基酸含量采用鮮樣測(cè)定。水分含量測(cè)定：參照GB 5009.3-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定——直接干燥法[11]；抗壞血酸含量測(cè)定：參照GB 5009.86-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-抗壞血酸的測(cè)定》——2,6-二氯酚靛酚滴定法[12]。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：雙縮脲法蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒法。蛋白質(zhì)（mg/g 質(zhì)量）=C標(biāo)準(zhǔn)管/（A標(biāo)準(zhǔn)管?A空白管）×（A測(cè)定管?A空白管）×V樣總/W。式中，C標(biāo)準(zhǔn)管：5 mg/mL；A標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管的吸光值；A空白管：空白管的吸光值；V樣總：樣本總體積，1 mL；W：樣本質(zhì)量，g。

氨基酸含量測(cè)定：氨基酸（AA）含量檢測(cè)試劑盒法。氨基酸含量（μmol/g 質(zhì)量）=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)管×△A測(cè)定管/△A標(biāo)準(zhǔn)管]×（V樣總/V樣）/W。式中，C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，10 μmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)管：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.05 mL；V樣總：樣本總體積，1 mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.05 mL；W：樣本質(zhì)量，g。

1.2.2.2 亞硝酸鹽含量的測(cè)定 亞硝酸鹽含量測(cè)定：食品中亞硝酸鹽含量檢測(cè)試劑盒法，采用鮮樣測(cè)定。亞硝酸鹽含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.12×[（A樣品?A空白）/（A標(biāo)準(zhǔn)?A空白）]/W。式中，A樣品：測(cè)定管的吸光值；A空白：空白管的吸光值；A標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管的吸光值；W：樣本質(zhì)量，g。

1.2.2.3 總黃酮含量的測(cè)定 采用超聲波輔助甲醇提取法提取鹽地堿蓬總黃酮[13]，稱取0.25 g鹽地堿蓬莖葉干燥樣品（料液比1:100 g/mL）置于容量瓶中，加入5 mL混合酶（0.1%纖維素酶+0.1%果膠酶）溶液；于60 ℃水浴30 min，容量瓶中根據(jù)甲醇濃度計(jì)算用量，加入無(wú)水甲醇將醇濃度調(diào)至70%，最后用70%甲醇溶液定容；超聲120 min，超聲功率360 W，水溫60 ℃；利用一次性注射器和一次性0.45 μm針頭式過(guò)濾器將最終提取液注入至進(jìn)樣瓶中備用，待進(jìn)樣檢測(cè)。

選取超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C）、料液比（D）為主要評(píng)定因素進(jìn)行考察，各因素的水平設(shè)定如表1。

表1 L16（44）正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 L16(44) level table of orthogonal test factor

參考郭麗霞[14]的方法并有所修改，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積定量，對(duì)不同鹽濃度脅迫處理、不同生長(zhǎng)時(shí)期的鹽地堿蓬提取液進(jìn)行HPLC分析，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，通過(guò)回歸方程對(duì)樣品中的總黃酮（以蘆丁計(jì)）進(jìn)行定量分析。HPLC條件：色譜柱：Dikma C18柱（4.6 mm×250 nm，5 μm）；流動(dòng)相：A（體積分?jǐn)?shù)0.2%的磷酸水溶液）：B（甲醇）=50:50；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相均經(jīng)真空泵過(guò)濾除雜和超聲清洗機(jī)脫氣。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行描述性分析，分析各指標(biāo)的均值、極值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，并進(jìn)行one-way ANOVA方差分析，運(yùn)用Duncan檢驗(yàn)法對(duì)品質(zhì)指標(biāo)含量分別進(jìn)行顯著性評(píng)價(jià)，P<0.05認(rèn)為結(jié)果差異顯著。

變異系數(shù)（CV）=（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）×100%。標(biāo)準(zhǔn)差=其中xˉ=樣本的平均值，n=樣本的數(shù)量，xi=樣本的個(gè)體（i=1,2···n）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)鹽地堿蓬各組分變異程度的影響

圖1 為不同生長(zhǎng)時(shí)期不同鹽脅迫的鹽地堿蓬各組分變異系數(shù)比較，由圖1可知，水分含量變異系數(shù)最低，亞硝酸鹽變異系數(shù)處于最高值。說(shuō)明水分含量差異性最小，亞硝酸鹽差異性最大，鹽脅迫對(duì)水分含量影響不明顯，對(duì)亞硝酸鹽含量具有明顯影響。苗期、花期和結(jié)果期水分含量的變異系數(shù)分別為5.58%、4.33%和2.30%，其中苗期水分含量變異系數(shù)最大，結(jié)果期變異系數(shù)最小，說(shuō)明水分含量變化在苗期比結(jié)果期更明顯。亞硝酸鹽含量在三個(gè)時(shí)期中變異系數(shù)大小排名為：苗期、結(jié)果期、花期，其中苗期變異系數(shù)最大，達(dá)95.76%，花期變異系數(shù)最小，說(shuō)明亞硝酸含量在苗期變化比花期更明顯。同樣，苗期抗壞血酸和黃酮含量的變異系數(shù)最高，結(jié)果期氨基酸和蛋白質(zhì)含量變異系數(shù)顯示最高值。綜上，鹽分對(duì)苗期鹽地堿蓬水分、亞硝酸鹽、抗壞血酸和黃酮含量影響較大，對(duì)結(jié)果期氨基酸和蛋白質(zhì)含量影響較大。

圖1 不同生長(zhǎng)時(shí)期鹽脅迫下鹽地堿蓬指標(biāo)變異系數(shù)Fig.1 Coefficient of variation of the indicators of Suaeda salsaunder salt stress in different growth periods

2.2 鹽脅迫對(duì)不同時(shí)期鹽地堿蓬水分含量的影響

一般情況下，鹽脅迫會(huì)影響植物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)變化，但因種類、鹽脅迫程度和生長(zhǎng)時(shí)期不同，影響有所差異。由圖2可知，三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期相比較，苗期鹽地堿蓬水分含量最高，除0.30%組外，與花期、結(jié)果期結(jié)果差異顯著（P<0.05）；且在0.30%和0.60% NaCl濃度時(shí)，花期與結(jié)果期水分含量差異顯著（P<0.05）。隨土壤NaCl濃度增加，苗期鹽地堿蓬水分含量呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，當(dāng)NaCl濃度為1.20%時(shí)，水分含量達(dá)到最大值93.71%，較對(duì)照差異顯著（P<0.05），增加了13.30%。由此可知，在試驗(yàn)所設(shè)定的土壤NaCl濃度下，促進(jìn)了其莖葉含水量的增加，植株細(xì)胞內(nèi)水分存在狀態(tài)相對(duì)平衡穩(wěn)定，生命活動(dòng)正常。因此，鹽脅迫有利于提升苗期鹽地堿蓬水分含量。在0.30% NaCl濃度時(shí)，花期鹽地堿蓬水分含量達(dá)最大值80.22%，與對(duì)照組及其他濃度相比具有顯著性差異（P<0.05），而其他四組之間并無(wú)顯著差異（P>0.05）。這說(shuō)明施加一定濃度的鹽處理更有利于花期鹽地堿蓬水分含量的增加，提高其保水能力，而鹽脅迫濃度過(guò)高（大于0.30%），水分吸收和葉片保水能力都會(huì)減弱，從而抑制了水分含量的增加。隨土壤NaCl濃度增加，結(jié)果期鹽地堿蓬水分含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，在0.90% NaCl濃度時(shí)水分含量最低，為68.68%，與對(duì)照組呈顯著差異（P<0.05），降低了5.43%；1.20%NaCl濃度時(shí)水分含量略有上升，但與對(duì)照組、最低值差異均不顯著（P>0.05），也就是說(shuō)鹽脅迫對(duì)結(jié)果期的鹽地堿蓬水分含量影響不明顯。

圖2 鹽脅迫對(duì)鹽地堿蓬水分含量的影響Fig.2 Effect of salt stress on thecontent of water of Suaeda salsa

2.3 鹽脅迫對(duì)不同時(shí)期鹽地堿蓬抗壞血酸含量的影響

如圖3所示，抗壞血酸含量隨鹽分梯度增加呈總體下降趨勢(shì)，低濃度（小于0.60%）鹽脅迫處理下，苗期鹽地堿蓬抗壞血酸含量高于其他生長(zhǎng)時(shí)期。在0.90% NaCl處理下，苗期鹽地堿蓬抗壞血酸含量具有最低含量值，為2.55 mg/100 g FW，較對(duì)照組差異顯著（P<0.05），降低了45.40%。大于0.30% NaCl濃度時(shí)，花期鹽地堿蓬抗壞血酸含量與對(duì)照組具有顯著差異（P<0.05），說(shuō)明苗期和花期鹽地堿蓬抗壞血酸含量對(duì)鹽脅迫較敏感。在0.90%與1.20% NaCl處理下，結(jié)果期鹽地堿蓬抗壞血酸含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），分別下降了17.21%和26.23%。是由于鹽脅迫等逆境加速活性氧的生成，并在體內(nèi)積累造成氧化傷害，植物體內(nèi)的抗壞血酸參與活性氧代謝，增強(qiáng)抗逆能力[15]，因此，隨鹽脅迫程度增加，抗壞血酸含量有所減少。

圖3 鹽脅迫對(duì)鹽地堿蓬抗壞血酸含量的影響Fig.3 Effect of salt stress on the content of ascorbic acid of Suaeda salsa

2.4 鹽脅迫對(duì)不同時(shí)期鹽地堿蓬蛋白質(zhì)含量的影響

圖4 為不同鹽分處理下不同生長(zhǎng)時(shí)期鹽地堿蓬蛋白質(zhì)含量變化情況，由圖可知，不同鹽分組的苗期、花期及結(jié)果期堿蓬蛋白質(zhì)含量均差異顯著（P<0.05），花期的鹽地堿蓬中蛋白質(zhì)含量最高，結(jié)果期含量最低。

圖4 鹽脅迫對(duì)鹽地堿蓬蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of salt stress on the content of protein of Suaeda salsa

鹽地堿蓬蛋白質(zhì)含量在不同生長(zhǎng)時(shí)期隨鹽分梯度增加呈現(xiàn)總體波動(dòng)下降的趨勢(shì)。在0.60% NaCl處理下，苗期、花期和結(jié)果期鹽地堿蓬蛋白質(zhì)含量均為最高，分別為27.95、45.58和19.34 mg/g鮮重（FW），較對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）；當(dāng)NaCl濃度大于0.60%時(shí)蛋白質(zhì)含量下降，在1.20% NaCl濃度時(shí)顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。一般認(rèn)為，鹽脅迫會(huì)增強(qiáng)植物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成代謝活動(dòng)，從而增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)，促進(jìn)植物適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境[16]，當(dāng)鹽脅迫超過(guò)一定水平會(huì)影響到細(xì)胞膜的保護(hù)作用，進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)正常的生理反應(yīng)，改變植物體自身的滲透脅迫和離子效應(yīng)功能[17]。王昊等[18]的研究表明，隨著NaCl濃度的升高翅堿蓬中蛋白質(zhì)和抗壞血酸含量呈先增加后減少的趨勢(shì)。與本研究結(jié)果大致相同，因此，當(dāng)高濃度（大于0.60%）鹽脅迫時(shí)，會(huì)通過(guò)抑制蛋白質(zhì)的合成和積累來(lái)適應(yīng)逆境。

2.5 鹽脅迫對(duì)不同時(shí)期鹽地堿蓬氨基酸含量的影響

鹽脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物啟動(dòng)自身物質(zhì)代謝的變化調(diào)節(jié)，其中氨基酸的滲透調(diào)節(jié)作用在提高植物耐鹽性中起重要作用[19]。如圖5所示，結(jié)果期的鹽地堿蓬氨基酸含量最高，除0.60% NaCl濃度組以外，與其他生長(zhǎng)時(shí)期差異顯著（P<0.05）。

圖5 鹽脅迫對(duì)鹽地堿蓬氨基酸含量的影響Fig.5 Effect of salt stress on the content of amino acid of Suaeda salsa

苗期與花期鹽地堿蓬氨基酸含量在受到鹽脅迫后的響應(yīng)趨勢(shì)基本一致，在NaCl濃度為0.30%時(shí)，苗期和花期的鹽地堿蓬氨基酸含量最低，均較對(duì)照組差異顯著（P<0.05），分別降低了51.27%和32.03%；在NaCl濃度為0.60%時(shí)，花期鹽地堿蓬氨基酸含量最高，為134.26 μmol/g FW，顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

隨NaCl濃度增加，結(jié)果期鹽地堿蓬氨基酸含量先下降再上升，當(dāng)NaCl濃度在0.60%時(shí)，結(jié)果期的鹽地堿蓬氨基酸含量具有最低值，顯著低于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組（P<0.05），當(dāng)NaCl濃度在1.20%時(shí)達(dá)到最高值，為312.96 μmol/g FW，顯著高于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組（P<0.05），試驗(yàn)結(jié)果與鹽處理下番茄嫁接苗葉片和根系中總氨基酸含量顯著提升[20]的研究結(jié)果一致，表明鹽分在一定程度上可促進(jìn)鹽地堿蓬氨基酸的形成和積累，在緩解鹽脅迫傷害中起重要的滲透調(diào)節(jié)作用。

2.6 鹽脅迫對(duì)不同時(shí)期鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量的影響

亞硝酸鹽作為蔬菜食用安全性的重要指標(biāo)，根據(jù)國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)（GB 2762-2017），含量應(yīng)該在20 mg/kg[8]范圍以內(nèi)。由圖6可知，所有鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其中花期鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量最低，均低于1.20 mg/kg FW，而且隨NaCl濃度的增加變化幅度不明顯。隨NaCl濃度增加，苗期鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量呈先上升再下降的趨勢(shì)，在0.30% NaCl濃度時(shí)，亞硝酸鹽含量上升幅度極小，較對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）；在0.90% NaCl濃度時(shí)含量最高，為7.09 mg/kg FW，顯著高于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組（P<0.05），當(dāng)NaCl濃度在高于0.90%后，亞硝酸鹽含量隨NaCl濃度增加有所減少。結(jié)果期的鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量隨NaCl濃度增加總體有下降的趨勢(shì)，在NaCl濃度為1.20%時(shí)亞硝酸鹽含量最低，較對(duì)照組及其他試驗(yàn)組差異顯著（P<0.05）。不同生長(zhǎng)階段鹽地堿蓬中亞硝酸鹽的差異性可能受到植物在不同生長(zhǎng)期對(duì)氮元素吸收能力的內(nèi)部因素以及溫度、水分等外部環(huán)境的影響。

圖6 鹽脅迫對(duì)鹽地堿蓬亞硝酸鹽含量的影響Fig.6 Effect of salt stress on the content of nitrite of Suaeda salsa

2.7 鹽脅迫與鹽地堿蓬總黃酮含量

2.7.1 鹽地堿蓬總黃酮提取工藝優(yōu)化 總黃酮提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，可以看出提取總黃酮的最佳工藝有兩個(gè)，分別是理論最優(yōu)方案為A2B3C2D4和實(shí)際最優(yōu)方案試驗(yàn)號(hào)6（A2B2C1D4）。A2B2C1D4提取方法得到總黃酮含量為2.35%，其提取含量大于方案A2B3C2D4的提取含量（2.27%）。因此，最優(yōu)方案A2B2C1D4總黃酮的提取含量最高，即超聲功率500 W，超聲溫度70 ℃，超聲時(shí)間25 min，料液比1:60 g/mL。

表2 L16（44）正交試驗(yàn)回歸結(jié)果Table 2 L16(44) The results of orthogonal test regression

2.7.2 HPLC法測(cè)定總黃酮含量 HPLC法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，同時(shí)蘆丁和總黃酮含量作為指標(biāo)具有直線相關(guān)性，鋁鹽絡(luò)合比色法測(cè)定總黃酮含量與HPLC法測(cè)定蘆丁含量均可單獨(dú)應(yīng)用于成分提取的過(guò)程監(jiān)測(cè)[21]。本研究采用HPLC法，測(cè)定鹽脅迫下鹽地堿蓬總黃酮含量，并且以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出計(jì)算方程，以便于定量分析鹽地堿蓬中總黃酮含量?；貧w方程為y=15467x+1.9（R2=0.997），其中y是總峰面積，x是樣品中總黃酮濃度（以蘆丁計(jì)），mg/mL。HPLC法得到鹽地堿蓬的液相出峰圖譜（以CK苗期樣品為例）見(jiàn)圖7。

圖7 CK苗期鹽地堿蓬總黃酮峰圖Fig.7 Peak diagram of total flavonoids of Suaeda salsa at CK seedling stage

2.7.3 鹽脅迫對(duì)不同時(shí)期鹽地堿蓬總黃酮含量的影響 黃酮類化合物是適應(yīng)性反應(yīng)系統(tǒng)，在植物代謝過(guò)程中參與植物生態(tài)防御，并擔(dān)當(dāng)生殖過(guò)程的信使，可以通過(guò)調(diào)節(jié)黃酮類化合物的合成和積累來(lái)應(yīng)對(duì)不同的逆境[22]。如圖8所示，花期的鹽地堿蓬總黃酮含量最高，達(dá)3.68%，在不同鹽脅迫處理下均與苗期差異顯著（P<0.05）。李巖等[23]的研究表明翅堿蓬總黃酮含量在花期達(dá)到最大（14.37 mg/g）。同時(shí)，Zhong[24]的試驗(yàn)也顯示鹽地堿蓬總黃酮的含量在9月最高（67.75 mg/g），不同月份的鹽地堿蓬中總黃酮含量差異顯著，與本研究結(jié)果一致。

圖8 鹽脅迫對(duì)鹽地堿蓬總黃酮含量的影響Fig.8 Effect of salt stress on the content of total flavonoid of Suaeda salsa

鹽地堿蓬總黃酮含量隨梯度鹽分增加呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，在0.90% NaCl處理下，苗期和花期鹽地堿蓬總黃酮含量為最高，分別為1.58%和3.68%，較對(duì)照組差異顯著（P<0.05）。在1.20% NaCl濃度時(shí)，結(jié)果期鹽地堿蓬總黃酮含量具有最高值3.16%，顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。在受到外界不利環(huán)境影響時(shí)，很多植物通過(guò)提高體內(nèi)抗氧化物質(zhì)含量來(lái)減輕脅迫引發(fā)的活性氧傷害，使其迅速適應(yīng)鹽脅迫，從而一定濃度鹽分脅迫促進(jìn)了黃酮化合物的合成[25]。本研究中鹽地堿蓬總黃酮含量與文獻(xiàn)中試驗(yàn)規(guī)律不完全相同[9,26]，其原因可能是植物的耐鹽機(jī)理不同從而展現(xiàn)出不同的規(guī)律。

3 結(jié)論

不同生長(zhǎng)時(shí)期的鹽地堿蓬組分含量存在明顯差異，其中水分含量差異性最小，亞硝酸鹽差異性最大。苗期鹽地堿蓬水分含量最高，且隨鹽脅迫程度增加呈上升趨勢(shì)，在1.20% NaCl處理下達(dá)最大值，且與對(duì)照間存在顯著差異（P<0.05）?？箟难岷侩S鹽脅迫程度增加總體呈下降趨勢(shì)，低濃度（小于0.60%）鹽脅迫處理下，苗期抗壞血酸含量最高。蛋白質(zhì)含量在不同生長(zhǎng)時(shí)期隨鹽脅迫程度增加呈總體波動(dòng)下降趨勢(shì)，花期鹽地堿蓬蛋白質(zhì)含量最高，在0.60% NaCl處理下為最大值?；ㄆ邴}地堿蓬亞硝酸鹽含量最低，在0.60% NaCl處理下顯著低于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組（P<0.05）。結(jié)果期鹽地堿蓬氨基酸含量最高，隨鹽脅迫增加先下降再上升，在1.20%NaCl處理下達(dá)最高值，顯著高于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組（P<0.05）。采用正交試驗(yàn)得到總黃酮優(yōu)化的提取條件：超聲功率500 W，超聲溫度70 ℃，超聲時(shí)間25 min，料液比1:60 g/mL，在0.90% NaCl處理下，花期的鹽地堿蓬總黃酮含量最高，達(dá)3.68%。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化形成了一套提取和檢測(cè)鹽地堿蓬總黃酮含量的方法，探究了不同濃度鹽脅迫對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的鹽地堿蓬組分含量的影響，明確了適宜發(fā)展優(yōu)質(zhì)安全鹽地堿蓬的土壤鹽分范圍，為鹽地堿蓬質(zhì)控栽培和合理開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。鹽地堿蓬為強(qiáng)耐鹽植物，可進(jìn)一步增加鹽脅迫的濃度，探究高鹽分對(duì)各組分的影響，對(duì)于不同鹽脅迫處理的不同時(shí)期鹽地堿蓬中黃酮類化合物的種類以及耐鹽性差異的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。