王晨鈺，韓 涵，郭 磊，劉同祥，唐 麗

(1.民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中央民族大學(xué)），中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081;2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所 抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850;3.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院京中醫(yī)療區(qū)禮士路門診部，北京 100045)

0 引 言

新型冠狀病毒肺炎（novel coronavirus pneumonia，COVID-19）是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染導(dǎo)致的急性呼吸道傳染病。2019 年12 月首次報(bào)道，至2021 年3月3 日15 時(shí)，COVID-19 感染已涉及到全球222 個(gè)國(guó)家和地區(qū)，累計(jì)確診新型冠狀病毒肺炎患者1.14 億余例，累計(jì)死亡已超過254 萬例[1]。自2020年10 月中旬，歐美國(guó)家出現(xiàn)第二輪反彈，截至2021 年3 月4 日，美國(guó)確診人數(shù)達(dá)5082 萬余例。目前，我國(guó)多地發(fā)生零星散發(fā)病例和局部聚集性疫情，疫情防控形勢(shì)復(fù)雜嚴(yán)峻。病毒感染可觸發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，初期多伴有發(fā)熱、乏力等臨床表現(xiàn)，重癥患者可出現(xiàn)呼吸困難與低氧血癥，甚至?xí)橛屑毙苑螕p傷、急性呼吸窘迫綜合征，更嚴(yán)重的則會(huì)有死亡風(fēng)險(xiǎn)。

傣族居住區(qū)大多屬于“瘴疬之區(qū)”，在與傳染病長(zhǎng)期斗爭(zhēng)的過程中，傣醫(yī)積累了對(duì)各類傳染病發(fā)生與防治等方面的認(rèn)識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。據(jù)云南西雙版納傣族自治州衛(wèi)生健康委文件顯示，傣藥方參與治療確診新冠肺炎病例13 例，疑似病例1 例，中傣西醫(yī)結(jié)合治療促進(jìn)病例癥狀改善，通過綜合施策，治愈率達(dá)98.85%。傣醫(yī)根據(jù) COVID-19 感染的臨床特征和易感人群的體質(zhì)特點(diǎn)，將其分為三種類型并針對(duì)不同的臨床表現(xiàn)，分別采用相應(yīng)的傣醫(yī)特色藥方進(jìn)行防治（見表1[2-4]）。

表1 傣醫(yī)藥對(duì) COVID-19 的治療方案

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[5]通過網(wǎng)絡(luò)分析理論從整體角度研究藥物的作用機(jī)制，為中藥多成分、多靶點(diǎn)的藥物作用機(jī)制闡釋提供了一種新的研究策略。本工作利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法[6]首次分析傣藥方治療COVID-19 中發(fā)揮作用的活性成分和作用機(jī)制，有助于闡釋傣族醫(yī)藥藥方的作用機(jī)制和特點(diǎn)，為發(fā)揮民族醫(yī)藥、中醫(yī)藥在COVID-19 防治中的積極作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 傣藥方主要成分及靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

根據(jù)復(fù)方所含中藥的名稱，從中藥與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/main/tcm_introduce.asp）查詢包含的化學(xué)成分，對(duì)數(shù)據(jù)庫中不包含的中藥，通過文獻(xiàn)搜索查詢對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分。

對(duì)所有化合物借助中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，篩選出具有活性成分的化合物。對(duì)于TCMSP 數(shù)據(jù)庫不包含的化合物，繪制結(jié)構(gòu)式，保存為“*.sdf”格式文件，利用ADME 篩選，根據(jù)指標(biāo)（PK 中GI tools 為High；Druglikeness前5個(gè)條件Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 至少有兩個(gè)為yes）篩選出符合要求的活性成分納入表中。

再利用Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)活性成分驗(yàn)證，結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為“*.sdf”格式的文件，設(shè)置為“Homo sapiens”后進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)（Swiss target prediction，http://www.swisstargetprediction.ch/），構(gòu)建活性成分靶點(diǎn)庫。

1.2 COVID-19 靶基因數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

在數(shù)據(jù)庫GenCLiP 3（http://ci.smu.edu.cn/gen clip3/analysis.php）和GeneCard 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中以“Novel Coronavirus”，“Corona Virus Disease”作為關(guān)鍵詞檢索以構(gòu)建疾病靶點(diǎn)庫。

1.3 靶點(diǎn)篩選

使用R 語言（3.6.3）Venn Diagram 數(shù)據(jù)包，依據(jù)藥物靶點(diǎn)與COVID-19 靶基因數(shù)據(jù)庫，對(duì)靶點(diǎn)取交集，得到藥方潛在靶點(diǎn)。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/，version 11.0），輸入潛在靶點(diǎn)，在organism 項(xiàng)設(shè)置物種為“Homo sapiens (Human)”，最小相互作用要求得分（minimum required interaction score）設(shè)置為0.90，隱藏單獨(dú)靶點(diǎn)得到PPI 網(wǎng)絡(luò)。將 PPI 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，利用MCODE 篩選連接最為緊密的功能模塊。

1.5 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將Drug disease（藥物與疾病的靶基因交集）、mollists（藥物的有效成分）文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。同時(shí)通過軟件的Network Analyzer 分析藥方治療COVID-19 拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到核心成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 基因富集分析和通路注釋研究

基因本體論（gene ontology，GO）是注釋基因及其表達(dá)產(chǎn)物的常用方法，京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）可對(duì)藥物作用靶點(diǎn)或差異表達(dá)基因進(jìn)行信號(hào)通路分析。將藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)，使用R 語言，引用Stringi 包，利用cluster Profiler，enrichplot，ggplot 2進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，設(shè)定閾值P路富集分析，篩選具有顯著性差異的生物過程和可靠靶點(diǎn)通路，P值越小，富集顯著程度越高。

1.7 分子對(duì)接

從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載SARS-CoV-2 3CL 水解酶（PDB ID：6LU7）[7]和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）（PDB ID：1R42）[8]的3D 結(jié)構(gòu)PDB 格式文件，使用AutoDock Tools 1.5.6 軟件，以6LU7 和ACE2 作為受體，將復(fù)方網(wǎng)絡(luò)中藥方中節(jié)點(diǎn)排名前十的化合物作為配體，根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中配體的坐標(biāo)確定活性位點(diǎn)，設(shè)置活性口袋，運(yùn)行AutoDockVina 進(jìn)行對(duì)接，用pymol 2.2.0 和ligplot+2.2 進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié) 果

2.1 三種傣藥方中各中藥包含的化合物和對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)

傣藥方中各中藥包含的化合物和潛在靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)見表2，依據(jù)中藥與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，得到了馬蓮鞍、羊耳菊、洗碗葉根、藤甘草、圓錐南蛇藤、野柿根、生藤的化合物數(shù)；依據(jù)已有文獻(xiàn)[9-21]得到了馬蘭、百樣解、葫蘆茶、山大黃的化合物數(shù)。需要說明的是，藥方2 中的毛翼核果藤、勐臘大解藥兩味中藥，藥方3 中的長(zhǎng)柱山丹、人字樹、茴香豆蔻三味中藥，未查詢到活性成分，因此僅在表中給出各自的藥理作用特點(diǎn)[22]。后續(xù)分析中，暫未考慮這五味中藥對(duì)于藥方整體的活性靶點(diǎn)及作用通路的影響。

表2 3種傣藥方的中藥包含的化合物和對(duì)應(yīng)的潛在靶標(biāo)個(gè)數(shù)

再根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18，得到各藥方活性成分，繪制分子式，經(jīng)過ADME 篩選與PubChem 驗(yàn)證，藥方1、2、3 分別得到化合物311、243、289 個(gè)，活性成分53、43、49 個(gè)。將活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)后得到藥方1、2、3 靶點(diǎn)數(shù)目分別為600、564、473 個(gè)。

2.2 各傣藥方的主要成分的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 活性成分治療疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

在數(shù)據(jù)庫GenCLiP 3 和GeneCard 數(shù)據(jù)庫中得到COVID-19 相關(guān)的疾病靶點(diǎn)共900 個(gè)，再利用Venn 圖（見圖1）得到各藥方治療COVID-19 的作用靶點(diǎn)。

圖1 傣藥方1(A)、2(B)、3(C)藥物靶點(diǎn)與COVID-19 相關(guān)靶點(diǎn)的Venn 圖

續(xù)表 23種傣藥方的中藥包含的化合物和對(duì)應(yīng)的潛在靶標(biāo)個(gè)數(shù)

2.2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

String 分析結(jié)果表明，藥方1、2、3 分別有91、71、77 個(gè)靶蛋白，254、144、206 條互作邊，得到的靶點(diǎn)間互作強(qiáng)度，以PPI 表示，邊越多表示關(guān)聯(lián)度越高，如（圖2）所示。三個(gè)藥方中的功能模塊中包括的核心基因有炎癥因子、MAPK1、3、8、14；絲氨酸和蘇氨酸特異性蛋白激酶C（PRKC）系列的PRKCA、非受體型酪氨酸激酶（JAK1）等。

圖2 傣藥方1(A)、2(B)、3(C)與COVID-19 交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，邊代表PPI

2.2.3 靶點(diǎn)的GO 生物功能注釋

GO 富集分析主要包括3 個(gè)方面：細(xì)胞組成（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF）。將藥方1 與疾病的73 個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，得到41 項(xiàng)CC 相關(guān)，1865 條BP，111 項(xiàng)MF 相關(guān)，將最顯著的前10 條進(jìn)行柱狀圖和氣泡圖展示（圖3）。在CC 中，藥方1 作用靶點(diǎn)富集條目分布于膜筏（membrane raft）、膜上結(jié)構(gòu)域（membrane microdomain），分別各占據(jù)總富集數(shù)目的18.7%與17.6%。BP 包括在生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程、免疫系統(tǒng)過程、細(xì)胞定位、多細(xì)胞生物過程、應(yīng)激反應(yīng)等主要生物過程，主要富集條目為肽段絲氨酸殘基修飾（peptidyl-serine modification），占總富集數(shù)目的24.2%，以及氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress），占總富集數(shù)目的25.3%。MF 中，條目包括蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）等，其富集數(shù)目占總富集數(shù)目的17.6%。藥方2 富集到38 項(xiàng)CC 相關(guān)，1709條BP，85 項(xiàng)MF 相關(guān)。部分條目和藥方1 有重合，然而在某一相同條目下的基因數(shù)量存在差異，反映出藥方2 治療COVID-19 參與的BP 與藥方1 的區(qū)別，推測(cè)這一區(qū)別可能是兩者對(duì)應(yīng)治療不同癥狀的COVID-19 的原因之一。藥方3 富集到39 項(xiàng)CC相關(guān)，1422 條BP，70 項(xiàng)MF 相關(guān)。

圖3 傣藥方與COVID-19 交集靶基因的GO 富集分析圖

2.2.4 KEGG 通路富集分析

KEGG 通路富集分析表明藥方1、2、3 分別富集到168、170、151 條生物通路，發(fā)現(xiàn)75%左右的通路集中在免疫、炎癥、內(nèi)分泌相關(guān)，對(duì)上述三種相關(guān)富集條目較多的生物通路進(jìn)行可視化分析（見圖4），藥方1 中，免疫相關(guān)通路如B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路最為顯著，其中TNF 信號(hào)通路可以激活半胱氨酸蛋白酶、應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK）、NF-κB 三條信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)抗病毒、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)控功能；PI3K-Akt 信號(hào)通路可參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。

圖4 傣藥方富集到的免疫、炎癥、內(nèi)分泌通路的KEGG 通路分析

藥方2 主要富集于細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路以及晚期糖基化終末產(chǎn)物—晚期糖基化受體（AGE-RAGE）信號(hào)通路等，HIF-1 信號(hào)通路是參與調(diào)解人體缺氧的重要通路，調(diào)節(jié)該通路可能有助于改善COVID-19 患者臨床缺氧癥狀。AGE-RAGE 信號(hào)通路可促進(jìn)NF-κB 通路、HIF-1α、JAK-STAT 通路等激活，也可引起大量黏附分子、生長(zhǎng)因子、促炎細(xì)胞因子如白介素6（IL-6）、IL-8 等的表達(dá)和釋放，最終引起慢性細(xì)胞活化和組織損傷。例如可以通過HIF-1α 信號(hào)通路抑制炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮抗炎作用。另外，AGERAGE 通路中，AGEs 的堆積能激活NF-κB 信號(hào)通路，AGEs 與受體RAGE 結(jié)合可激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)，如 JAK-STAT，從而使炎癥信號(hào)持續(xù)存在，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡使出現(xiàn)肺組織損傷等癥狀。

藥方3 富集于大量的炎癥相關(guān)通路，例如瞬時(shí)感受器電位（TRP 通道）的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、Toll 樣受體（TLR）通路、MAPK 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、花生四烯酸代謝通路等，其中對(duì)JAK-STAT 信號(hào)通路的激活可改善氣體交換功能，從而抑制炎性介質(zhì)的釋放、減輕LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷。

2.2.5 中藥活性成分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖分析

構(gòu)建了藥物-成分-靶基因-疾病的中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，得到各藥方中每個(gè)藥物的靶點(diǎn)調(diào)控重要程度，以節(jié)點(diǎn)度來反映節(jié)點(diǎn)的重要程度，節(jié)點(diǎn)度數(shù)值越高，越可能是核心成分或靶點(diǎn)。

藥方1 網(wǎng)絡(luò)圖中總共包含147 個(gè)節(jié)點(diǎn)，534 條邊，平均度值為7.27；藥方2 網(wǎng)絡(luò)圖中總共包含137 個(gè)節(jié)點(diǎn)，425 條邊，平均度值為7.27；藥方3 的網(wǎng)絡(luò)圖中總共包含125 個(gè)節(jié)點(diǎn)，352 條邊，平均度值為5.63，各個(gè)藥方網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)度值排名前十位的化合物分別匯總于表3。選取節(jié)點(diǎn)度前10 位和作用靶點(diǎn)前10 位繪制中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（見圖5）。

圖5 傣藥方1 (A)、2(B)、3(C)的中藥復(fù)方-成分-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，圖中菱形為預(yù)測(cè)的排名前十的靶點(diǎn)，三角形為中藥(簡(jiǎn)稱)，圓形為藥物活性成分(簡(jiǎn)稱)

2.2.6 分子對(duì)接分析

針對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖拓?fù)浞治龅玫降墓?jié)點(diǎn)度值排名前十的活性化合物，匯總對(duì)接結(jié)果（表3）。一般認(rèn)為，化合物與受體所形成的構(gòu)象能量越低，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，結(jié)合活性較高。若結(jié)合能<0，表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能<–5.0 kcal/mol 時(shí)，表明結(jié)合性好，結(jié)合能越低，對(duì)接結(jié)果越佳。

表3 傣藥方1、2、3 排名前十的化合物分別與COVID-19 的SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 的對(duì)接參數(shù)

進(jìn)一步選擇結(jié)合能最低的構(gòu)象進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)于SARS-CoV-2 3CL 水解酶，選擇β-谷甾醇（與其最低結(jié)合能為–6.7 kcal/mol）、(-)-兒茶素（–6.8 kcal·mol–1）、槲皮素（–7.0 kcal/mol）。由ligplot 分析，β-谷甾醇與Met165 等氨基酸殘基間主要通過疏水作用力、與Cys145 等殘基通過氫鍵作用，作用距離為2.9?；(-)-兒茶素則與Tyr126 等殘基間產(chǎn)生疏水作用；槲皮素與6LU7 的Ile106 等殘基產(chǎn)生氫鍵或者鹽橋作用，另外也與Gly174 殘基發(fā)生疏水作用。在與ACE2 進(jìn)行對(duì)接，選擇β-谷甾醇（與其最低結(jié)合能–7.7 kcal/mol）、(-)-兒茶素（–8.0 kcal/mol）、槲皮素（–7.9 kcal/mol）（見表4）。

表4 β-谷甾醇、(-)-兒茶素、槲皮素分別與SARS-CoV-2 3CL 水解酶、ACE2 的對(duì)接模式圖及l(fā)igplot 分析

3 討 論

傣醫(yī)藥因特有的整體合參特點(diǎn)，其針對(duì)COVID-19 的治療藥方收錄為《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)》[23]。普遍認(rèn)為病毒先通過誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生失調(diào)、過度的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致患者體內(nèi)炎癥因子過度表達(dá)而出現(xiàn)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，從而間接造成肺炎及急性肺損傷[24]。我們?cè)诖烁鶕?jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接的結(jié)果，對(duì)其主要作用成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、通路分析展開討論。

3.1 重要成分

在各傣藥方對(duì)應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)圖中，共獲得了22 個(gè)重要成分，主要以黃酮類（11 個(gè)）、萜類（4 個(gè)）為主，其他7 個(gè)則屬于甾體皂苷類、脂肪酸類、香豆素類、甾醇類、苯丙素類、蒽醌類、酚酸類化合物，其中β-谷甾醇、(-)-兒茶素、槲皮素節(jié)點(diǎn)度值較高，同時(shí)在分子對(duì)接結(jié)果中相對(duì)較好。已有研究表明β-谷甾醇可以顯著減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺水腫和炎癥反應(yīng)；(-)-兒茶素歸屬于兒茶素類，其結(jié)構(gòu)相似化合物表兒茶素已呈現(xiàn)出較好的抗炎活性[24]；槲皮素作為一種天然黃酮，具有良好的抗炎作用。例如可以通過[25]降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和TNF-α 表達(dá)，從而抑制大鼠肺泡細(xì)胞凋亡，達(dá)到降低大鼠肺組織炎癥和纖維化損傷的目的。另外，近期相關(guān)研究表明[26]槲皮素等化合物參與多種階段COVID-19 的治療，可抑制 JAK2-STAT3 信號(hào)通路的激活，從而可下調(diào)肺臟炎癥反應(yīng)的應(yīng)答，同時(shí)還兼有抗病毒、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等作用[27]，本工作中的GO 富集、KEGG 通路結(jié)果也主要集中在這些通路中。

從3種成分與靶蛋白的分子對(duì)接相互作用圖和3D 空間構(gòu)象可以看出，β-谷甾醇、(-)-兒茶素、槲皮素等和SARS-CoV-2 3CL 水解酶、ACE2 結(jié)合活性均較高，通過疏水作用力、離子鍵、氫鍵等多種相互作用力促使復(fù)合物的形成（表4），有利于抑制病毒與核心蛋白的結(jié)合。其他主要活性成分則主要作用于與機(jī)體免疫功能相關(guān)、炎癥相關(guān)的信號(hào)通路，以促進(jìn)機(jī)體提高免疫力，阻斷病毒入侵。

3.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)及通路分析

3.2.1 關(guān)鍵靶點(diǎn)

從PPI 網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，靶點(diǎn)之間存在多種相互作用，其中度值排名前20 的靶點(diǎn)主要包括炎癥因子、絲裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C 等，其中炎癥因子的相關(guān)靶點(diǎn)包括IL-1β、IL-2、IL-6、JAK1、STAT3 等，目前研究表明IL-1β[28]可上調(diào)IL-1RI來增強(qiáng)肺部炎癥；IL-2[29]主要由CD4+Th1 分泌，通過結(jié)合對(duì)應(yīng)受體發(fā)揮炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)功能；IL-6[30]可通過趨化炎癥細(xì)胞聚集和促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，加速肺纖維化早期的肺泡炎癥反應(yīng)，從而介導(dǎo)特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生，造成肺損傷，已有研究確證了IL-6 等相關(guān)靶點(diǎn)的重要作用，例如 Xu[31]等使用先前用于治療各種類型的關(guān)節(jié)炎（包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和細(xì)胞因子釋放綜合征）的IL-6 的受體特異性抗體Tocilizumab，通過減輕肺纖維化損傷給出對(duì)重度COVID-19 的治療效果。考慮到SARS-CoV-2觸發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[32]，可能引起細(xì)胞因子風(fēng)暴綜合癥（CSS），其相關(guān)臨床特征[33]可以通過炎癥因子相關(guān)作用來解釋，所以用于抑制過度炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)劑可能是治療COVID-19 的潛在藥物。另外，JAK1[34]可以參與細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。STAT3[35]目前也已被證明在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)中起著重要作用。

3.2.2 共性通路分析

SARS-CoV-2 病毒感染會(huì)引起劇烈的免疫及炎癥反應(yīng)，并激活大量細(xì)胞因子。2020 年以來對(duì)中藥成分與COVID-19 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的相關(guān)文獻(xiàn)亦表明[36-43]，黃酮類可通過調(diào)控IL-17、TNF、T 細(xì)胞受體、Th1 細(xì)胞分化、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等信號(hào)通路來減少IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎性因子的分泌，上調(diào)IL-10 等抗炎因子來抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)分化和肺血管生成，減輕肺損傷進(jìn)而發(fā)揮防治COVID-19 的作用。萜類活性成分則可通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞受體、IL-17、VEGF 等信號(hào)通路，發(fā)揮抗病毒、免疫、抗炎的作用。

和以往研究相比，本工作中的三個(gè)藥方大多涉及免疫系統(tǒng)、炎癥系統(tǒng)、內(nèi)分泌相關(guān)的通路，更側(cè)重于免疫與炎癥相關(guān)通路，例如黃酮類活性成分可共同通過促使煙霧誘導(dǎo)的TGF-β 減少釋放[44]，抑制“上皮-間質(zhì)”轉(zhuǎn)化來減輕肺纖維化；也可通過阻斷促分裂原活化蛋白激酶通路，該通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要包 括MAPK1、MAPK3 等，MAPK1可通過調(diào)控VEGF和MAPK 信號(hào)通路，促進(jìn)修復(fù)損傷肺組織達(dá)到抗COVID-19 的目的[45-47]，MAPK3[48]也廣泛參與肺部炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展。

我們不難發(fā)現(xiàn)，各藥方的某些活性成分之間存在共同的關(guān)鍵靶點(diǎn)，例如藥方1 的β-谷甾醇與藥方2 和3 的活性成分豆甾醇具有共同的靶點(diǎn)IL-17、TNF-α 和IL-6 等；藥方1 的活性成分苦參素與藥方2 的（-）-兒茶素具有共同的靶點(diǎn)JAK1、STAT3等；藥方2 的活性成分綠原酸與藥方3 的槲皮素具有共同的靶點(diǎn)IL-6、MAPK1 等，繼而調(diào)控炎癥相關(guān)通路如TNF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路以及JAKSTAT 信號(hào)通路等。

3.2.3 差異通路分析

整體上來講，從靶點(diǎn)的功能注釋以及通路富集上的差別可以推測(cè)傣醫(yī)對(duì)于這三種癥狀對(duì)癥下藥的科學(xué)依據(jù)。藥方1 主要富集于抗炎通路、病毒感染通路，與其相對(duì)應(yīng)的各靶點(diǎn)則是參與炎癥反應(yīng)或者病毒感染細(xì)胞過程中的各個(gè)重要因子，例如MAPK1、MAPK3、MAPK8、JAK1、EGFR、STAT3 等，在抗炎反應(yīng)與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用，也反映出在風(fēng)毒初起、水傷火盛型的癥狀對(duì)應(yīng)下，藥方1 治療的重點(diǎn)放在抗炎、病毒感染細(xì)胞的通路上，從而提高機(jī)體的免疫能力。

對(duì)于風(fēng)毒壅肺、火盛土傷型的癥狀，藥方2 主要集中于病原菌、病毒感染通路、抗炎信號(hào)通路等，PTGS2、PTGS1、NOS2、PRKCA、PRKCB、PRKCE、IL-6 靶點(diǎn)在整個(gè)調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用，這些通路對(duì)臨床上患者所出現(xiàn)的發(fā)熱不退、咳嗽氣喘、痰多黃稠、心悸胸悶、腹脹便秘等癥狀有著協(xié)同調(diào)控的作用。

藥方3 以清火解毒、疏風(fēng)調(diào)水、補(bǔ)水培土為治則，對(duì)應(yīng)可治療的臨床癥狀為高熱不退、全身乏力、氣促胸悶、呼吸困難、神志不清等，比前兩種癥狀都更為嚴(yán)重，核心靶點(diǎn)主要有PIK3CA、PIK3CB、MAPK1、IL-6、IL-1β，其對(duì)應(yīng)的通路重點(diǎn)集中在炎癥相關(guān)信號(hào)通路、細(xì)胞增殖凋亡通路，富集結(jié)果顯示對(duì)細(xì)胞增殖凋亡作用較大，然而是否存在全身效應(yīng)還需要進(jìn)一步結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、以及相應(yīng)的指標(biāo)方可得出準(zhǔn)確判斷。

就抗炎通路而言，從富集作用較為顯著的通路來看，藥方1 與其他藥方的抗炎通路區(qū)別在于多出了花生四烯酸信號(hào)通路，花生四烯酸的代謝產(chǎn)物如前列腺素、白三烯和脂毒素等作為體內(nèi)重要的炎癥物質(zhì)參與機(jī)體免疫及炎癥反應(yīng)過程。MAPK 等其他的抗炎通路在藥方3 中的富集條目數(shù)占比約23%，同等情況下抗炎通路的富集條目數(shù)高于藥方1 和2。說明抗炎通路貫穿整個(gè)藥方的治療過程，且隨著癥狀不同，對(duì)應(yīng)的抗炎通路在治療過程中發(fā)揮的作用也存在局部差異。

4 結(jié)束語

本工作通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，初步探索了傣藥藥方防治COVID-19 的生物學(xué)作用機(jī)制，從分子水平闡述了傣藥方的多成分、多靶點(diǎn)對(duì)機(jī)體的整體調(diào)控，為民族醫(yī)藥基于傣藥方治療 COVID-19 提供了進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)，其確切機(jī)制仍需后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。例如構(gòu)建新型冠狀病毒肺炎動(dòng)物模型，根據(jù)本工作揭示出的藥方3 可能通過細(xì)胞凋亡、炎癥相關(guān)信號(hào)通路干預(yù)新型冠狀病毒肺炎的特點(diǎn)，通過監(jiān)測(cè)動(dòng)物模型中的炎癥因子MAPK1、IL-6及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2 等指標(biāo)的表達(dá)水平，從而對(duì)藥方3 的調(diào)控作用進(jìn)行驗(yàn)證。