李 瓊，李金花，常世豪，楊青春，舒文濤，耿 臻

（周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 周口 466001）

大豆是我國重要的油料作物，在植物油生產(chǎn)中占有重要地位[1]。我國大豆種植面積小，大豆品種出油率較進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆低，大豆油消費(fèi)的主要來源仍然依靠進(jìn)口。2020 年我國進(jìn)口大豆10 032.7萬t，同比增長17%，創(chuàng)下歷史新高[2?3]。在我國大豆產(chǎn)量總體不足的情況下，選育及種植高油大豆品種是提高國內(nèi)產(chǎn)油量的有效途徑之一。我國高油大豆品種主要種植在北方地區(qū)，但生產(chǎn)上油分含量高、豐產(chǎn)性好的品種十分匱乏[4]。選育高油大豆的基礎(chǔ)是對高油大豆種質(zhì)資源的搜集和合理利用。分析高油大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可探索種質(zhì)材料間的親緣關(guān)系。通過種質(zhì)材料遺傳背景的分析，指導(dǎo)親本間的選配，可充分發(fā)揮其雜種優(yōu)勢，加快實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)。因此，分析高油大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性，對育種親本材料的篩選和高油大豆品種的選育具有重要意義。

SSR分子標(biāo)記具有操作簡便、周期較短、多態(tài)性豐富和重復(fù)性高等特點(diǎn)，基于SSR 分子標(biāo)記的指紋圖譜身份證技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于大豆品種遺傳特異性鑒定[5]。陳亮等[6]以98 份吉林省大豆品種為試驗(yàn)材料，利用12 對SSR 引物構(gòu)建出由7 對SSR 標(biāo)記組成的核心引物組合，實(shí)現(xiàn)對試驗(yàn)材料的逐一區(qū)分。王帥等[7]以60份東北地區(qū)大豆疫霉根腐病抗性品種為試驗(yàn)材料，利用35對SSR 引物對其進(jìn)行遺傳多樣性分析，構(gòu)建出由5 對SSR 引物組成的指紋圖譜。中國是大豆起源的中心，地域遼闊、地形復(fù)雜多樣，擁有最為豐富的大豆自然群體。然而，人工選育大豆品種（系）過程中，對優(yōu)良親本的重復(fù)利用，造成大豆遺傳背景逐漸單一。目前，關(guān)于大豆遺傳多樣性的分析及SSR 指紋圖譜的構(gòu)建多是針對個別省份或地區(qū)進(jìn)行，同時對多個區(qū)域高油大豆種質(zhì)資源的研究較少。鑒于此，基于68 對SSR 引物，對中國和來自美國的共61份高油大豆品種（系）進(jìn)行遺傳多樣性分析并構(gòu)建指紋圖譜，為高油大豆種質(zhì)資源保存、新品種保護(hù)及育種親本的選擇等提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

采用近紅外光譜儀測定286 份大豆品種（系）[包括國家區(qū)試參試品種（系）和美國引進(jìn)大豆品種（系），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院和周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供]的脂肪含量，根據(jù)國家大豆品質(zhì)區(qū)試中高油大豆的判定標(biāo)準(zhǔn)（脂肪含量≥21.5%），從中篩選出脂肪含量≥21.5% 的61 份高油大豆材料作為供試材料（表1）。根據(jù)品種（系）產(chǎn)地來源及種植生態(tài)區(qū)，將來自遼寧、黑龍江、山西、河北、北京的高油大豆材料歸為群體A（編號P1—P32，主要來源于北方春大豆區(qū)以及黃淮海夏大豆中部和北部片區(qū)），將來自河南、山東、安徽、江蘇、湖北的高油大豆材料歸為群體B（編號P33—P50，主要來源于黃淮海夏大豆南部片區(qū)和長江流域夏大豆區(qū)），將美國引進(jìn)高油大豆材料歸為群體C（編號P51—P61）。

表1 61份大豆高油品種（系）名稱及產(chǎn)地來源Tab.1 Names and origins of 61 high-oil soybean varieties（lines）

1.2 方法

1.2.1 大豆DNA 提取及引物合成 選取2 粒飽滿的大豆種子在育苗盤中種植，放置在培養(yǎng)箱（25 ℃，光照8 h/d）內(nèi)培育出3 片復(fù)葉。采集鮮嫩葉片按照CTAB 法[8]提取DNA。采用紫外分光光度計測定DNA 質(zhì)量濃度，并稀釋至50 ng/μL，放置于-80 ℃冰箱備用。參考http://soybase.org/公布的引物標(biāo)記和參考文獻(xiàn)[9-11]中與大豆品質(zhì)（油分、蛋白質(zhì)）相關(guān)的引物標(biāo)記，選取分布于20條連鎖群上的88對SSR引物，并從中篩選出多態(tài)性較好的68 對引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測 PCR 反應(yīng)體系為10 μL，包括DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×TranTaq-PCRSuper-Mix 5 μL，加水補(bǔ)足。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電壓180 V，時長2.5 h，銀染法染色，即時拍照。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 同一位置有條帶賦值為“1”，無條帶則賦值為“0”，在Excel 中建立61 份材料的“0/1”矩陣。用POPGEN 32 軟件計算不同群體的等位基因數(shù)（Allele number，Na）、有效等位基因數(shù)（Effective number of allele，Ne）、Shannon’s 信息指數(shù)[12]（Shannon’s information index，I）、遺傳相似度（Genetic identity，GI）、遺傳距離（Genetic distance，GD）、多 態(tài) 位 點(diǎn) 比 率（Percentage of polymorphic bands，PPB）、Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）、總遺傳多樣度（Ht）、群體內(nèi)遺傳多樣度（Hs）、群體間遺傳分化系數(shù)（Gst）和基因流（Nm*）等并進(jìn)行對比分析，計算引物的多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC）[13]。利用NTSYS 軟件進(jìn)行遺傳相似性分析，計算遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity，GS），并采用非加權(quán)配對法UPGMA 和SHAN 程序進(jìn)行聚類分析，Eigen 程序進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。將高油大豆品種（系）以十進(jìn)制數(shù)據(jù)構(gòu)建指紋圖譜[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用68 對引物（表2）分別對61 份高油大豆品種（系）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共檢測出203個條帶，多態(tài)性條帶為199 個，PPB 為98.03%。PIC 變幅為0.236～0.978，平均為0.627。PIC可以衡量基因變異程度的高低。朱振東等[15]認(rèn)為，PIC＞0.5 時，該引物為高度信息引物。由此可見，本研究所選取的68 對引物中，其中50對具有較高的多態(tài)性。

表2 供試材料SSR引物多態(tài)性信息Tab.2 Polymorphism information of SSR primers in the tested materials

2.2 高油大豆品種（系）DNA指紋圖譜的構(gòu)建

根據(jù)68對SSR 引物的擴(kuò)增結(jié)果，統(tǒng)計基因型個數(shù)。選取基因型較多且PIC 較高的引物對61 份大豆品種（系）進(jìn)行區(qū)分。參照PIC值由高到低依次加入SSR 引物，逐步對材料進(jìn)行鑒定，直到把所有品種（系）區(qū)分開。由表3 可知，SSR 引物sat_304、satt708、satt373、satt216 可區(qū)分67.74%（41 份）的材料；SSR 引 物sat_304、satt708、satt373、satt216、satt463 可區(qū)分88.71%（54 份）的材料；SSR 引物sat_304、satt708、satt373、satt216、satt463、satt631 可區(qū)分96.77%（59 份）的材 料；sat_304、satt708、satt373、satt216、satt463、satt631 和satt268 七對引物可把61份高油大豆品種（系）區(qū)分開。按照sat_304、satt708、satt373、satt216、satt463、satt631、satt268 的引物組合順序?qū)⒚糠莶牧蠈?yīng)的擴(kuò)增結(jié)果轉(zhuǎn)化為二進(jìn)制“0/1”代碼，得到每個品種（系）獨(dú)立的唯一編碼，構(gòu)成61 份高油大豆材料的指紋圖譜（表4）。本研究篩選得到的7 對核心引物可將61 份高油大豆品種（系）完全分開，從分子水平上將DNA指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于高油大豆品種（系）的鑒定、識別。

表3 逐個增加SSR標(biāo)記引物組合對高油大豆品種（系）的區(qū)分情況Tab.3 Differentiation of high-oil soybean varieties（lines）by adding SSR marker primer combinations one by one

表4 7對引物構(gòu)建的61份高油大豆品種（系）的SSR指紋圖譜Tab.4 SSR fingerprints of 61 high-oil soybean varieties（lines）constructed by seven pairs of primers

續(xù)表4 7對引物構(gòu)建的61份高油大豆品種（系）的SSR指紋圖譜Tab.4（Continued） SSR fingerprints of 61 high-oil soybean varieties（lines）constructed by seven pairs of primers

2.3 不同高油大豆群體間遺傳多樣性、遺傳距離和遺傳變異分析

由表5 可見，供試61 份高油大豆品種（系）的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon’s 信息指數(shù)（I）分別為1.980 3、1.414 2、0.272 4、0.429 7，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為199，多態(tài)位點(diǎn)比率（PPB）為98.03%。各群體間遺傳多樣性指標(biāo)存在差距，群體A（Na=1.955 7，Ne=1.424 5，H=0.263 7，I=0.414 7，PPB=95.57%）＞群體B（Na=1.921 2，Ne=1.416 8，H=0.261 3，I=0.408 8，PPB=92.12%）＞群 體C（Na=1.743 8，Ne=1.370 0，H=0.225 7，I=0.347 6，PPB=74.38%），表明群體A 遺傳多樣性最豐富，群體B 次之，群體C 遺傳多樣性最差。3 個大豆群體的總遺傳多樣度（Ht）、群體內(nèi)遺傳多樣度（Hs）、群體間遺傳分化系數(shù)（Gst）和基因流（Nm*）分別為0.276 9、0.250 2、0.096 4和4.688 7。由此可見，9.64%的遺傳變異存在于3 個群體之間，90.36%的遺傳變異存在于群體內(nèi)部。3個群體間差異較小，存在低度分化，但群體內(nèi)部個體差異較大，群體間基因交流較為豐富。

表5 不同高油大豆群體的遺傳多樣性指標(biāo)Tab.5 Genetic diversity index of different high-oil soybean groups

由表6 可知，群體A 與群體B 的遺傳相似度（GI）為0.974 4，遺傳距離（GD）為0.025 9；群體A與群體C 的遺傳相似度（GI）為0.944 2，遺傳距離（GD）為0.057 4；群體B 與群體C 的遺傳相似度（GI）為0.922 5，遺傳距離（GD）為0.080 7。由此可見，3 個群體間遺傳相似性高，遺傳距離較近，即3個群體遺傳背景較為相似，親緣關(guān)系較近。3 個群體之間遺傳距離比較可知，群體B 與群體C 親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，群體A 與群體C 親緣關(guān)系居中，群體A與群體B 親緣關(guān)系最近。

表6 不同高油大豆群體間的遺傳相似度（GI）和遺傳距離（GD）Tab.6 Genetic identity（GI）and genetic distance（GD）between different high-oil soybean groups

2.4 不同高油大豆品種（系）的聚類分析和主成分分析

利用68 對引物（表2）分別對61 份高油大豆品種（系）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用NTSYS 軟件對68 對SSR 引物的擴(kuò)增數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計算并建立遺傳相似度矩陣，進(jìn)行UPGMA 聚類。結(jié)果（圖1）表明，61份材料的遺傳相似系數(shù)（GS）在0.61～0.87。遺傳相似系數(shù)在0.63 處，61 份材料被分為四大類群。類群Ⅰ中有2 份材料，包括開科源特早和遼04M05-4，這2 個品種均為菜豆品種（屬群體A）；類群Ⅱ中有12份材料，包括AU1、AU2、AU3 等11 份材料（屬群體C）和1 份材料（合交2001-336-7）（屬群體A）；類群Ⅲ中有30 份材料，包括汾豆95、冀豆17、冀10B8 等26 份材料（屬群體A）和南圣105、濰豆80031、魯97013-1、油07-73 四份材料（屬群體B）；類群Ⅳ中有17 份材料，包括周01015-1、周豆21、濟(jì)087129 等14 份材料（屬群體B）和中黃37、中黃70、中作4110 三份材料（屬群體A）。其中，合交2001-336-7、南圣105、濰豆80031、魯97013-1、油07-73、中黃37、中黃70 和中作4110 共8 份材料未被歸類于原區(qū)域類群。

利用NTSYS 對遺傳相似度矩陣進(jìn)行主成分分析（PCA），得出三維立體散點(diǎn)圖（圖2）。第1、第2和第3 主成分解釋變異的貢獻(xiàn)率分別為8.255%、5.552%和4.938%，累計貢獻(xiàn)率僅為18.745%；聚類法分析（圖1）和主成分分析聚類法分析（圖2）均可將供試的61 份高油大豆品種（系）劃分為4 個類群。進(jìn)一步證明了供試61 份高油大豆品種（系）間遺傳相似度高、遺傳背景狹隘以及被分為4 個類群的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論與討論

DNA 指紋圖譜技術(shù)作為最新型的指紋表現(xiàn)手法，在作物血緣關(guān)系和遺傳基礎(chǔ)、品種審定、假冒偽劣種子鑒別、種子管理檢測[16?17]、遺傳育種及作物遺傳作圖等方面發(fā)揮著重要作用。董永梅等[18]以來自黑龍江、內(nèi)蒙古和新疆的26 份大豆品種為材料，利用8 對SSR 引物將供試材料逐一區(qū)分，并構(gòu)建了26份大豆品種（系）的指紋圖譜。丁俊杰等[19]以黑龍江省103 份灰斑?。? 號生理小種）抗性大豆品種為材料，利用與大豆抗灰斑病基因連鎖的7 對SSR 引物建立品種的分子身份證。何琳等[20]以長江流域國家大豆區(qū)域試驗(yàn)中的45 份大豆品種為材料，選擇6對SSR 引物將參試大豆品種全部區(qū)分，并獲得唯一的分子身份證。然而，關(guān)于高油大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建方面的研究較少。本研究篩選出的7 對核心引物（sat_304、satt708、satt373、satt216、satt463、satt631 和satt268）可將61份高油大豆品種（系）完全區(qū)分，且所有材料都有一組唯一的指紋圖譜“0/1”代碼。利用指紋圖譜信息可鑒定出高油大豆的優(yōu)良基因或DNA 片段在雜交后代中的變化和傳遞情況，對高油大豆品種的選育具有重要意義。但本研究中供試材料僅為國家大豆區(qū)域試驗(yàn)中部分高油材料，缺乏對高油大豆“核心種質(zhì)”指紋圖譜背景的深入研究，因此，其研究結(jié)果的廣適性有待驗(yàn)證。

通過對作物群體遺傳多樣性的分析，可進(jìn)一步了解群體的遺傳結(jié)構(gòu)、變異水平和遺傳背景，為親本選配、品種保護(hù)等提供理論基礎(chǔ)[21]。本研究從均勻分布于大豆20 個連鎖群上選取多態(tài)性高的SSR標(biāo)記引物對61 份高油大豆材料的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，61份高油大豆材料遺傳多樣性豐富（Na=1.980 3、Ne=1.414 2、H=0.272 4、I=0.429 7、PPB=98.03%）。根據(jù)品種（系）產(chǎn)地來源及種植生態(tài)區(qū)劃分的3 個群體中，群體A 材料主要來源于北方春大豆區(qū)以及黃淮海夏大豆中部和北部片區(qū)，遺傳多樣性最高，群體B 材料主要來源于黃淮海夏大豆南部片區(qū)和長江流域夏大豆區(qū)，遺傳多樣性次之，群體C材料主要是美國引進(jìn)高油大豆材料，遺傳多樣性最差。眾所周知，栽培大豆起源于我國黃河中下游地區(qū)，大豆起源地種質(zhì)資源相對豐富；而且我國大豆油分含量由北向南總體呈現(xiàn)由高到低的變化趨勢[22]。因此，我國大豆種質(zhì)資源整體上比美國大豆種質(zhì)資源豐富，大部分高油大豆種質(zhì)廣泛集中于我國北方地區(qū)。本研究中，3個群體樣本量不同，從某種程度上會影響對其遺傳多樣性豐富度的判斷，下一步需對更豐富的大豆高油材料進(jìn)行深入研究。

本研究結(jié)果表明，3 個高油大豆群體間差異較小、存在低度分化，群體間基因交流較豐富?？傮w來看，3個群體遺傳相似性高、遺傳距離較近。宋喜娥等[23]表示，近代我國育成的大豆新品種群體遺傳基礎(chǔ)越來越窄，育成品種群體遺傳背景逐漸單一。BURNHAM 等[24]和GEORGE 等[25]研究也發(fā)現(xiàn)，中國和美國大豆親緣關(guān)系較近。本研究結(jié)果表明，群體B 與群體C 親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，群體A 與群體C 親緣關(guān)系次之。采用國內(nèi)遺傳距離較遠(yuǎn)或者引進(jìn)國外高油大豆品種對現(xiàn)有高油大豆品種進(jìn)行改良，在一定程度上對高油大豆的培育具有積極作用。

種質(zhì)材料遺傳關(guān)系受種質(zhì)材料育種來源地或種植地理位置的影響，通常來自同一地區(qū)或生態(tài)區(qū)的種質(zhì)材料具有相似的遺傳信息，在聚類分析中被聚在相同的類群中[26]。本研究利用NTSYS 進(jìn)行聚類分析，將61 份高油大豆品種（系）區(qū)分為四大類群，各類群中絕大多數(shù)的品種（系）來自于同一區(qū)域，僅有8份材料未被歸類于原區(qū)域類群，可能是由于種質(zhì)資源間存在頻繁交流，從而使這些品種（系）與相鄰區(qū)域大豆品種（系）密切相關(guān)。

綜上所述，本研究確定了61 份高油大豆品種（系）的親緣關(guān)系，并構(gòu)建了由7 對SSR 核心引物確定的指紋圖譜，為選擇遺傳背景差異較大、遺傳距離較遠(yuǎn)、可能含有不同高油基因的大豆品種作為親本材料，培育超高油大豆品種提供理論依據(jù)。