鄭美青 薛 冰

(首都醫(yī)科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy, AFM)原理是在反饋控制系統(tǒng)的作用下，根據(jù)針尖曲率半徑在納米尺度的微小探針與樣品間的相互作用，去感觸樣品表面形貌的變化，就如同人在大腦地控制下，用手去感觸物體表面形貌。就原子力顯微鏡而言，其反饋到中央控制系統(tǒng)的參數(shù)是探針與樣品間的相互作用力，因此，可以更容易地獲得樣品的力學(xué)參數(shù)。

原子力顯微鏡樣品制備相對(duì)簡單，對(duì)樣品損傷小，無需進(jìn)行染色、包埋等復(fù)雜處理過程，對(duì)測試環(huán)境要求不高，在空氣和液態(tài)環(huán)境下都可以進(jìn)行測試，可用于表征普通材料樣品和生物樣品[1，2]，例如 DNA、蛋白質(zhì)和活性細(xì)胞[3-6]。相對(duì)于光學(xué)顯微鏡，原子力顯微鏡可以有更好的分辨率。

實(shí)際掃描的過程中，原子力顯微鏡的成像圖是原子力探針和樣品共同卷積的結(jié)果，所以探針的選擇、樣品的制備直接決定成像質(zhì)量。

1 探針對(duì)原子力顯微鏡的成像的影響

在掃描樣品表面時(shí)，探針的微小針尖與樣品表面相互作用，使探針的微懸臂發(fā)生形變。由激光二極管發(fā)出的激光束照射在探針的微懸臂末端，當(dāng)微懸臂發(fā)生形變時(shí)，激光束的反射光束也發(fā)生相應(yīng)的變化，通過四象限光電探測器接收反射后的激光束，對(duì)所獲得的信息進(jìn)行轉(zhuǎn)換、放大，輸出電壓檢測信號(hào)。計(jì)算機(jī)通過比較檢測信號(hào)和預(yù)先設(shè)置的參考信號(hào)來實(shí)時(shí)調(diào)整壓電陶瓷掃描器在Z 軸方向上的伸縮量，實(shí)現(xiàn)反饋控制。計(jì)算機(jī)通過軟件編程對(duì)檢測信號(hào)進(jìn)行處理，獲取樣品表面形貌圖像以及相應(yīng)的物理量[7]。

探針[8]分基底(Substrate)、懸臂(Cantilever)和針尖(Tip)三部分。懸臂相當(dāng)于力傳感器，根據(jù)懸臂形狀，探針可分為矩形懸臂和三角形懸臂。探針質(zhì)量好壞以及探針參數(shù)會(huì)直接影響最后的成像。選擇探針不是由哪種掃描模式?jīng)Q定，實(shí)驗(yàn)中要根據(jù)探針的參數(shù)去選擇。選擇探針的基本原則是：懸臂的軟硬度要適中，既保證樣品要產(chǎn)生足夠的形變量，又要保證有足夠的探測靈敏度。

1.1 彈性系數(shù)(k)

不同模式[9]下，應(yīng)選擇不同彈性系數(shù)的針。以布魯克原子力顯微鏡為例，智能成像模式基于peakforce tapping mode，探針以正弦驅(qū)動(dòng)方式離開和接近表面。我們要確保探針敲到表面之后可以離開，因?yàn)闃悠繁砻嬗姓掣搅Φ挠绊?，如果探針太軟，樣品粘附力比較大，探針形變比較大，樣品會(huì)拽著探針不讓離開，可能掃描器把探針拉到最高點(diǎn)的時(shí)候還沒分開，一般選擇彈性系數(shù)小于1N/m的探針就可以。

Tapping mode振幅比較小，一般在幾個(gè)nm到幾十個(gè)nm，克服粘附力是完全要依靠蘊(yùn)藏在探針里的能量來離開樣品表面。彈性系數(shù)k越小，懸臂里的能量越小，越不容易離開樣品表面。Tapping振幅又小，所以要求探針的k要大，一般要選擇k大于2N/m的針。

接觸模式是探針直接壓到樣品表面來回劃，力越大越容易破壞樣品，所以盡量選擇k小的探針來做成像，太硬的針會(huì)劃傷樣品表面。同時(shí)我們應(yīng)參考樣品的彈性模量大小來選擇探針。

1.2 曲率半徑(tip radius)

AFM有橫向分辨率和縱向分辨率，決定它們的因素不一樣。曲率半徑主要影響AFM的橫向分辨率，一般情況下，曲率半徑越小，針尖越尖，橫向分辨率越高。探針尖端尖不尖，用鈍針和尖針得到的效果是完全不一樣的，如圖1，同一個(gè)樣品，如果選擇曲率半徑小的尖針成像(圖1 b)，針尖可以更好地插入樣品，得到更高分辨率的成像。

圖1 鈍針(a)和尖針(b)的成像

1.3 懸臂鍍層

懸臂是AFM力的傳感器，所以它非常重要，控制力其實(shí)就是控制懸臂的彎曲量。探針背面的鍍層會(huì)增加懸臂反射率，提高信噪比。鍍層一般會(huì)選擇金、鋁等材質(zhì)，帶鍍層的針sum值位于4.0～7.5V，不帶鍍層的針sum值位于1.5～2.5V。鍍層的質(zhì)量也會(huì)影響到成像質(zhì)量，成像有干涉條紋出現(xiàn)，一般情況是由于光調(diào)偏了，會(huì)有光漏出，也有可能是鍍層質(zhì)量有問題。實(shí)驗(yàn)中激光位置應(yīng)該在懸臂前半部分，找sum值最大的位置。

大部分情況下，應(yīng)該選背面有鍍層的針來做成像，特別是做peakforce tapping時(shí)。變溫實(shí)驗(yàn)時(shí)要選擇不帶鍍層的懸臂，因?yàn)閼冶酆湾儗硬牧喜灰粯?，溫度變化時(shí)熱膨脹系數(shù)不一樣，懸臂會(huì)變彎，vertical一直在飄，所以變溫實(shí)驗(yàn)時(shí)要避免選擇帶鍍層的針。

1.4 Deflection sensitivity

Deflection sensitivity代表垂直形變量的靈敏度，這個(gè)值很重要，在做力學(xué)實(shí)驗(yàn)中首先要校準(zhǔn)Deflection sensitivity。數(shù)越小，探測小的形變量的sensitivity越高，因此如果要測量特別小的形變量時(shí)，我們應(yīng)該選擇Deflection sensitivity數(shù)比較小的探針。因?yàn)镈eflection sensitivity跟懸臂的長度成正比，跟光路的長度成反比，因此要選懸臂短一些的針。

1.5 假象的問題

針尖形狀會(huì)影響到橫向分辨率，掃描的過程中會(huì)經(jīng)常遇到兩種情況，一是探針被污染了，粘上東西了，相當(dāng)于探針的形狀有變化，還有一種情況是，在做成像的過程中，因?yàn)榱Φ脑蛑饾u把探針磨鈍了，相當(dāng)于探針的形狀有了變化，所以分辨率會(huì)有變化。這兩種情況下，所測得結(jié)果卷積了探針形狀的改變，成像不真實(shí)，因此實(shí)驗(yàn)中需要排除可能存在的這些假象，如圖2。

圖2 探針被污染或者變鈍的成像

2 樣品對(duì)原子力顯微鏡的成像的影響

2.1 樣品制樣

AFM樣品制樣原則，一要求基底干凈，二樣品要固定在基底上，如果樣品固定不好，或者樣品表面起伏太大，會(huì)導(dǎo)致力曲線很不穩(wěn)定。常用的固定方法有四種：一是范德華力，可以用膠將樣品粘在基底上，大多數(shù)情況下可以選雙面膠，導(dǎo)電實(shí)驗(yàn)時(shí)用銀膠；二是用化學(xué)鍵固定，比如表面修飾，經(jīng)常用到的化學(xué)鍵是金硫鍵，硫醇的巰基在外面，固定到金的表面；三是酰胺鍵，在羥基或者氨基表面，樣品用氨基或者羥基結(jié)尾，形成酰胺鍵；還有一種是用靜電力，利用樣品和基底表面的電荷，比如很多DNA是帶負(fù)電荷[10]的，要把基底表面修飾成帶正電荷的，通過靜電作用固定樣品如圖3，基底修飾后的成像分辨率明顯提高很多。

圖3 云母基底修飾前后的成像圖a.修飾前；b.修飾后

最常用的基底是云母片，云母基底非常好用，每一層都是原子級(jí)平整的，不需要額外清理、清洗，前提是要選用高質(zhì)量的云母。第二種基底是石墨，也是原子級(jí)平整，這兩種基底一個(gè)是親水，一個(gè)是疏水，在原子力的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用比較多，處理比較簡單。

2.2 樣品的安裝

安裝樣品時(shí)不要引入太多噪聲，如果樣品大于樣品臺(tái)，安裝樣品時(shí)會(huì)引起樣品臺(tái)邊緣震動(dòng)，噪聲會(huì)比較高，甚至?xí)采w樣品本身的信號(hào)。

2.3 樣品帶電問題

同樣的樣品在不同的帶電條件下，測出來的結(jié)果不同。如果用tapping mode來做成像，一定要排除靜電影響。原因是tapping mode是通過振幅來成像，但如果樣品和探針之間有額外的靜電作用力的話，會(huì)引起探針共振峰的移動(dòng)，即使高度沒有變化，引入額外的靜電力也會(huì)導(dǎo)致振幅變化，tapping將所有的振幅變化都反映在高度里邊，所以額外的靜電力會(huì)對(duì)高度有貢獻(xiàn)。這時(shí)雖然看到的圖很漂亮，但結(jié)果是錯(cuò)誤的。

2.4 樣品污染的問題。

實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)遇到這種情況，本來很細(xì)膩的顆粒，成像突然變得很大，很顯然是探針被污染了，污染的東西掉下來之后又可以繼續(xù)掃，如果是peakforce QNM，可以根據(jù)粘附力變化來判斷樣品是否被污染。

2.5 樣品老化的問題。

有些樣品容易老化，不能放置時(shí)間太久，一定要新制的樣品才可以檢測，空氣中放置后就會(huì)無法檢測。

3 總結(jié)

原子力顯微鏡是一種納米級(jí)測量分析儀器，儀器非常靈敏，影響因素較多，大致包括探針、樣品、AFM成像系統(tǒng)、軟件設(shè)置以及人為的參數(shù)調(diào)節(jié)等幾大類。本文總結(jié)了探針的彈性系數(shù)、曲率半徑、懸臂鍍層對(duì)成像的影響，以及制樣、裝樣時(shí)可能存在的問題，實(shí)驗(yàn)中為獲得更準(zhǔn)確的成像，我們需要盡量克服樣品可能存在的這些問題，并選擇最優(yōu)的探針來對(duì)其成像。