陳桂平,丁劍峰,付戴波,周偉良,張串聯(lián),涂群

（1.江西省養(yǎng)蜂研究所，江西南昌330200；2.永修縣立新鄉(xiāng)農(nóng)技站；3.九江市動(dòng)物疾病控制中心）

蜂房球菌（Melissococcus pluton,MSSP）是一種革蘭氏陽(yáng)性、兼性厭氧菌。室溫下，可以在蜂蠟中存活65d以上、在干枯的幼蟲(chóng)死亡殘留物中存活3年，是引起蜜蜂“爛子病”的主要細(xì)菌性病原之一。江西省山區(qū)適宜中蜂養(yǎng)殖，每年飼養(yǎng)規(guī)模很大，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民主要收入之一，而目前人工養(yǎng)殖的中蜂蜂群“爛子”現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，給中蜂養(yǎng)殖帶來(lái)很大經(jīng)濟(jì)損失，該病在江西省流行情況尚不清楚。為揭示該病在江西省贛北中蜂養(yǎng)殖區(qū)的流行現(xiàn)狀和特點(diǎn)，本研究從贛北地區(qū)不同養(yǎng)蜂場(chǎng)采集患病幼蟲(chóng)、蜂脾等樣品，分離鑒定蜂房球菌，分析各地蜂場(chǎng)蜂房球菌引起的爛子病流行情況，為有效防控該病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源。贛北地區(qū)不同中蜂場(chǎng)采集的患病幼蟲(chóng)、可疑巢脾和花粉。在贛北地區(qū)選擇4個(gè)縣，每個(gè)縣選擇3個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)選擇3～6家蜂場(chǎng)，每家蜂場(chǎng)用無(wú)菌取樣器采集可疑幼蟲(chóng)、巢脾和花粉各3份，做好標(biāo)記，保溫箱保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、果糖、蛋白胨、阿拉伯糖、檸檬酸鉀、檸檬酸鈉、海藻糖、蛋白胨、半胱氨酸等生化試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制。蛋白胨1g、半胱氨酸0.02g、葡萄糖0.5g、果糖0.5g、可溶性淀粉1g組成，瓊脂2g加純化水至100mL，用1mol/LKH2PO4調(diào)pH至7.0。

1.2.2 病原分離。將可疑幼蟲(chóng)、巢脾和花粉分別與同體積的無(wú)菌生理鹽水勻漿[1]，在無(wú)菌操作臺(tái)用滅菌接種環(huán)蘸取少量上清液接種在瓊脂培養(yǎng)基表面，在5%～10%CO2厭氧條件下35℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形成，并挑起菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 生化鑒定。將分離的菌株接種于專門培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)與純化[2～3]，然后將單一菌落分別接種在葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、海藻糖、麥芽糖、山梨糖、硝酸鹽還原等微量生化鑒定管，在5%～10%CO2厭氧條件下35℃培養(yǎng)48h，進(jìn)行生化鑒定。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

分離臨床樣品，并挑取單一菌落純培養(yǎng)后，在5%～10%CO2厭氧條件下35℃培養(yǎng)24h，可觀察到圖1所示菌落，細(xì)菌菌落直徑在1mm左右，為半透明水滴樣，邊緣整齊，表面光滑、中心凸突的小菌落。

圖1 細(xì)菌菌落形態(tài)

2.2 生化鑒定結(jié)果

對(duì)樣品分離菌株進(jìn)行生化鑒定，由表1結(jié)果可知，該菌能利用葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、阿拉伯糖、麥芽糖，而不能利用乳糖、甘露糖。厭氧和硝酸鹽還原試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性。

表1 樣品分離菌株的生化鑒定結(jié)果

2.3 細(xì)菌分離結(jié)果

由表2、表3結(jié)果可知，以不同地區(qū)蜂場(chǎng)感染程度來(lái)評(píng)價(jià)，60家蜂場(chǎng)中有34家蜂場(chǎng)檢出帶菌樣品，蜂場(chǎng)檢出率56.7%，其中武寧縣蜂場(chǎng)檢出率最高達(dá)61.1%、永修縣60%、修水縣53.3%、都昌縣50%，4個(gè)縣蜂場(chǎng)檢出率均≥50%；以不同樣品帶菌程度來(lái)評(píng)價(jià)，360個(gè)樣品中檢出帶菌樣品194個(gè)，不同取樣部位的樣品檢出率以幼蟲(chóng)為最高，達(dá)達(dá)50.6%。

表2 不同取樣部位蜂房球菌檢出情況 份、%

表3 不同地區(qū)蜂場(chǎng)蜂房球菌檢出情況 戶、%

3 討論

由于蜂房球菌屬于兼性厭氧菌，分離培養(yǎng)時(shí)對(duì)溫度和CO2濃度均要求較高，需要熟練掌握分離培養(yǎng)技術(shù)。分離出的菌落與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[4～5]，因此可確定從樣品中分離出的細(xì)菌是蜂房球菌。

從不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)蜂場(chǎng)檢出率比較來(lái)看，永修縣馬口鎮(zhèn)檢出率最高為80%、都昌縣多寶鄉(xiāng)檢出率最低為25%，4個(gè)縣蜂場(chǎng)檢出率均≥50%，說(shuō)明蜂房球菌在當(dāng)?shù)胤淙褐幸汛嬖趥鞑チ餍?，這與該菌在外省蜂場(chǎng)中的流行特點(diǎn)基本相符[6～7]。