金一春，許柯，朱駿，曹向英，孫文梅，胡曉艷

（上海市松江區(qū)食用農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)督檢測(cè)中心，上海 松江 201611）

豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種急性高致病性傳染病，其變異毒株的感染可引起高發(fā)病率和高死亡率，因其傳播速度快、發(fā)病率高，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，成為危害當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一［1］。目前，豬藍(lán)耳病尚無(wú)特效治療藥物，我國(guó)一直采取疫苗接種的方法來(lái)預(yù)防和控制［2］。

為了解上海松江區(qū)豬群豬藍(lán)耳病的免疫效果，準(zhǔn)確掌握其流行病學(xué)規(guī)律，筆者于2016～2020年采用ELISA方法和熒光RT-PCR方法對(duì)本區(qū)內(nèi)規(guī)模場(chǎng)、種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場(chǎng)的豬群在春秋兩季進(jìn)行集中監(jiān)測(cè)。

1 材料

1.1 被檢樣品 選擇上海市松江區(qū)規(guī)模場(chǎng)、種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場(chǎng)的豬群，于2016～2020 年共采集5 728份豬血液樣品，其中規(guī)模場(chǎng)3 867份、種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場(chǎng)1 861份。

1.2 檢測(cè)試劑 豬繁殖與呼吸綜合征酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒、熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)試劑盒，分別購(gòu)自IDEXX 和北京生科尚儀科技有限公司；磁珠法核酸提取試劑盒購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司。

2 方法

2.1 ELISA檢測(cè)

2.1.1 操作步驟 檢測(cè)試劑在室溫下充分回溫，用超純水將濃縮洗液作10倍稀釋?zhuān)脴悠废♂屢簩⒈粰z血清作40 倍稀釋?zhuān)?、?yáng)性對(duì)照血清不作稀釋?zhuān)辉谖⒘糠磻?yīng)板各相應(yīng)孔中加入已處理過(guò)的被檢血清及陰、陽(yáng)性對(duì)照血清各100 μL，振蕩混勻，封膜，21 ℃下孵育30 min；用約300 μL 洗滌液重復(fù)洗滌板孔4 次，最后一次洗滌后將板拍干；每孔加入酶標(biāo)抗豬IgG 抗體100 μL，振蕩混勻，封膜，21 ℃下孵育30 min；同樣洗板4 次拍干后，每孔加入TMB 底物溶液100 μL，避光21 ℃孵育15 min；每孔加入終止液100 μL，混勻后置酶標(biāo)儀上，用單波長(zhǎng)650 nm讀取結(jié)果。

2.1.2 結(jié)果分析 在實(shí)驗(yàn)條件成立下，分析S∕P值：若S∕P＜0.4，則該樣品為豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陰性；若S∕P≥0.4，則該樣品為豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽(yáng)性。

2.2 熒光RT-PCR檢測(cè)

2.2.1 核酸提取 準(zhǔn)備96 孔板，分別取130 μL Buffer MLB及10μL Proteinase K和10 μL MagBind Particles加入孔A，再取已處理樣品及陰陽(yáng)性對(duì)照各50 μL加入孔A；取150 μL Buffer MW1 加入孔B；取150 μL Buffer MW2 加入孔C、D；取50 μL Nuclease Free Water 加入孔H，將96 孔板與磁力外套放入儀器相應(yīng)位置，啟動(dòng)程序運(yùn)行至結(jié)束；將96孔板孔H中的液體吸入1.5 mL離心管中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 核酸擴(kuò)增 反應(yīng)總體積25.5 μL，分別含15 μL PCR 反應(yīng)液，0.25 μL TaqDNA 酶，0.25 μL PCR 酶及10 μL 模板。擴(kuò)增條件：42 ℃30 min，92 ℃3 min；92 ℃10 s，45 ℃30 s，72 ℃60 s，5次循環(huán)；92 ℃10 s，60 ℃30 s，40次循環(huán)。

2.2.3 結(jié)果分析 在實(shí)驗(yàn)條件成立下，分析Ct值：Ct 值小于30 且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線者，判為陽(yáng)性。

3 結(jié)果

3.1 2016～2020 年間豬藍(lán)耳病免疫抗體檢測(cè)結(jié)果 從表1 可以看出，2016～2020 年間松江區(qū)規(guī)模場(chǎng)、種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場(chǎng)的豬藍(lán)耳病抗體免疫合格率分別為89.8%、86.8%、91.2%、95.3%、91.6%和94.6%、93.3%、99.0%、98.6%、90.9%，均達(dá)到群體抗體合格率大于或等于70%的要求。2016～2019 年規(guī)模場(chǎng)的豬藍(lán)耳病抗體免疫合格率略低于種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場(chǎng)。2016～2017 年及2019～2020 年松江區(qū)豬藍(lán)耳病抗體免疫合格率總體呈下降趨勢(shì)，如圖1所示。

表1 2016～2020年上海市松江區(qū)豬藍(lán)耳病免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

圖1 2016～2020年松江區(qū)豬藍(lán)耳病免疫抗體合格率趨勢(shì)圖

3.2 2016～2020年間豬藍(lán)耳病病毒RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 從表2檢測(cè)結(jié)果可以看出，除了2016年規(guī)模場(chǎng)有檢測(cè)出豬藍(lán)耳病陽(yáng)性（陽(yáng)性率為0.7%）外，其他年份均未檢出。

表2 2016～2020年上海市松江區(qū)豬藍(lán)耳病病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

4 討論

4.1 從本次監(jiān)測(cè)結(jié)果來(lái)看，上海市松江區(qū)豬藍(lán)耳病的整體免疫情況良好，但通過(guò)此次監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)在疫病免疫防控工作上仍有上升空間，應(yīng)加強(qiáng)防控監(jiān)管力度。

4.2 飼養(yǎng)管理、仔豬補(bǔ)欄、免疫接種、診斷治療等不規(guī)范操作都會(huì)影響抗體免疫效果。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)2016～2019 年規(guī)模場(chǎng)的豬藍(lán)耳病免疫抗體合格率低于種養(yǎng)結(jié)合家庭農(nóng)場(chǎng)，2016～2017年及2019～2020 年豬藍(lán)耳病免疫抗體合格率總體呈下降趨勢(shì)，分析原因可能與豬場(chǎng)的免疫程序及豬群健康狀況等因素有關(guān)。為了確保豬群的免疫效果，應(yīng)加強(qiáng)主要疫病的持續(xù)監(jiān)測(cè)，科學(xué)制定符合生產(chǎn)實(shí)際的免疫程序。

4.3 針對(duì)2016 年檢出豬藍(lán)耳病陽(yáng)性的情況，筆者還應(yīng)用熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)2016年和2017年的血液樣本進(jìn)行了豬圓環(huán)病毒2 型檢測(cè)，結(jié)果顯示2016、2017 年豬圓環(huán)病毒2 型的陽(yáng)性率分別是10.2%、0.8%，由此推測(cè)2016、2017 年規(guī)模場(chǎng)豬群有豬圓環(huán)病毒2型感染現(xiàn)象，由于其免疫抑制性，嚴(yán)重影響了豬藍(lán)耳病免疫抗體的產(chǎn)生。豬場(chǎng)應(yīng)引起重視，建立良好的飼養(yǎng)管理措施，制定科學(xué)的消毒程序，嚴(yán)格生物安全管理制度，保證飼料品質(zhì)和青綠飼料的供給，減少豬群應(yīng)激［3］，加強(qiáng)豬群自身免疫力提升，從而提高免疫效果。

4.4 控制豬藍(lán)耳病應(yīng)以預(yù)防為主［4］，豬群注射疫苗后應(yīng)進(jìn)行定期、持續(xù)的免疫抗體監(jiān)測(cè)，及時(shí)了解免疫效價(jià)水平，對(duì)免疫效果不理想的豬群及時(shí)補(bǔ)免，最終提高本地區(qū)豬藍(lán)耳病的防制效果?！?/p>