張震 洪俊 徐鈺茜 錢惠忠 許友山

ABO亞型的鑒定常以血型血清學方法為主，由于不同ABO亞型的抗原抗體強度不同[1]，可能還有不規(guī)則抗體、自身抗體等因素的干擾，使ABO亞型不能準確地定型。除血型血清學方法外，還常采用分子生物學方法來檢測ABO亞型：應用序列特異性引物引導的PCR反應（sequence specific primer，PCR-SSP）進行初步基因分型以及經(jīng)DNA測序后參照標準序列進行突變位點分析[2-3]。由于分子生物學技術從基因的角度對血型進行鑒定，可以彌補血型血清學方法的缺陷，使ABO亞型的分型結果更為準確，臨床輸血更為安全[4]。

材料與方法

1 研究對象：選擇2016年5月～2019年6月，符合《獻血者健康檢查要求》的獻血者共120 118名，經(jīng)檢驗科檢測為ABO血型正反定型不符或疑為亞型的標本送至血液研究室進一步鑒定ABO血型，最終經(jīng)血型血清學方法初步判定為ABO亞型19例。

2 試劑與儀器：抗-A、抗-B（單克隆抗體）血型試劑，ABO反定型紅細胞試劑盒，抗-A1試劑，抗-H（單克隆抗體）試劑，以上試劑均由上海血液生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；抗-A、抗-B血型定型試劑（人血清）由中國醫(yī)學科學院輸血研究所生產(chǎn)；抗-AB試劑由DIAGAST公司生產(chǎn)；核酸（DNA）提取試劑盒（高鹽法）由江蘇中濟萬泰生物公司生產(chǎn)；人類紅細胞ABO基因分型試劑盒由天津秀鵬生物技術公司提供。KA-2200低速離心機、KA-3500高速離心機（日本久保田公司）；水浴箱（德國MEMMERT公司）；PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司）；電泳儀和凝膠成像分析儀（上海復日公司）。所用檢測試劑均在有效期內(nèi)使用。

3 方法

3.1 血型血清學方法：采用鹽水試管法對標本進行ABO正反定型及吸收放散等試驗，操作均按照文獻[5]進行。ABO亞型的結果判斷參考文獻[6]。ABO亞型用血型血清學鑒定時，除了進行常規(guī)的正反定型之外，還進行了以下幾種特殊試驗：①采用增強法（加大血清/血漿量；反定結果較弱時在4 ℃放置10～30分鐘后處理[6]；多次離心）②被檢者紅細胞與抗-A1、抗-AB及抗-H血清的凝集試驗。③抗體篩查試驗。④吸收放散試驗。

3.2 DNA提?。喊凑丈唐坊噭┖姓f明書進行操作。

3.3 PCR-SSP：檢測及ABO基因第1-7外顯子DNA測序：由于經(jīng)血清學鑒定后標本量有限，故僅對14例疑為亞型標本進行分子生物學檢測。14例標本中的11例同時進行PCR-SSP檢測及DNA測序，另3例標本僅做了DNA測序。PCR-SSP檢測按照商品化試劑盒說明書進行操作，DNA測序送至天津秀鵬生物技術公司完成。

結 果

1 ABO亞型血型血清學結果 本次研究經(jīng)血型血清學方法初步判定ABO亞型19例，其中A亞型6例（Ael 1例、A21例、A2B 1例、AxB 3例），B亞型10例（Bend/B32例、Bel 3例、Bx 3例、ABend/AB31例、ABx 1例），CisAB型1例，B（A）型1例，AB類孟買型1例。無錫地區(qū)獻血者ABO亞型檢出率約為1.6/萬，且B亞型多于A亞型（10/6）。血型血清學鑒定結果見表1。

表1 19例樣本ABO血型血清學反應格局圖

2 PCR-SSP 檢測結果 11例標本中A/O1、A201/O1、B/B基因型各1例，B/O1、B/O2基因型各2例，A/B基因型3例，另7號標本基因型不明確。PCR-SSP方法與血清學方法鑒定結果符合率約為90.9%（10/11），但分型結果較為粗略，尤其是ABO基因的特殊突變無法檢測，需用DNA測序方法進一步分析。

3 DNA基因測序結果 在14例標本進行DNA基因測序結果中，獲取了本地ABO亞型的多態(tài)性數(shù)據(jù)，有Ael02、A201、Bw27、Bel03、Bw22、B310、A217、CisAB01、B（A）02共計九種突變等位基因，國內(nèi)均已有報道。DNA測序方法與血清學方法鑒定結果符合率約為78.6%（11/14）。4、12和13號標本的血型表型為Bel、ABend/AB3、AxB，但在PCR-SSP及第1-7號外顯子DNA測序結果中均未見突變，結果見表2。16號標本的第1外顯子發(fā)生了c.26_27delC的突變，發(fā)現(xiàn)為新等位基因，并已獲GenBank注冊號（MT281528），電泳圖和測序圖見圖1。

表2 本研究中發(fā)現(xiàn)的ABO亞型送檢樣本的PCR-SSP結果及測序結果

圖1 16號樣本新突變位點的電泳圖及測序圖

討 論

ABO亞型的A、B抗原的數(shù)量和性質常發(fā)生改變，血漿中也常存在不規(guī)則抗-A或抗-B抗體。因此，ABO亞型常在正反定型不一致時被發(fā)現(xiàn)。ABO亞型較為少見，據(jù)報道：濱州地區(qū)獻血者ABO亞型檢出率約為1.4/萬[7]；邢臺和上海地區(qū)獻血者ABO亞型檢出率均約為2.8/萬[8-9]，且B亞型多于A亞型[7-8]。本次研究ABO亞型檢出率與濱州地區(qū)較接近，約為1.6/萬，且B亞型也多于A亞型。較邢臺和上海地區(qū)獻血者ABO亞型檢出率略低的原因可能有以下三點：①人群因素：由于地區(qū)人群不同而導致差異；②試劑原因：目前廣泛使用單克隆試劑，能與Ax和Bx等一些亞型產(chǎn)生較強凝集，從而造成漏檢；③方法學原因：由于本單位使用的血型儀檢測需30 ℃孵育1 h后才出結果，對具有IgM型不規(guī)則抗體的亞型可能會造成漏檢。

本次研究中的4、12和13號標本在血型血清學鑒定時表現(xiàn)出亞型特征，但在第1-7號外顯子DNA測序中卻未見突變。近年來，ABO等位基因的啟動子、增強子、內(nèi)含子等非編碼調(diào)控區(qū)域的異常而導致A或B抗原弱表達的報道較多[10-13]，因此上述3個標本還需對其非編碼區(qū)進行分子生物學檢測，觀察有無異常。其余經(jīng)DNA測序標本的ABO表型均與分子生物學結果相符。ABO等位基因的第6、7號外顯子占編碼區(qū)序列長度的77%，大多數(shù)亞型的變異發(fā)生于此，且變異類型以堿基替換為主。堿基替換后導致氨基酸的置換，常改變抗原表達量，有些還會影響其催化特性，甚至使糖基轉移酶同時具有結合兩種底物的能力[9，14-15]，如17和18號的CisAB和B（A）標本。本次研究發(fā)現(xiàn)7號標本B310在第1外顯子處發(fā)生c.28G＞A突變，造成了p.Gly10Arg的置換。Cai X等人證實[16]，B310抗原表達弱化的主要原因并非是氨基酸置換導致，而是由于c.28G＞A處突變導致的剪接缺陷下調(diào)了ABO基因mRNA的水平，最終導致B抗原弱表達。16號標本血清學表現(xiàn)為ABx，DNA測序時發(fā)現(xiàn)第1外顯子存在26位與27位之間的胞嘧啶缺失，其異常剪接處緊鄰1號外顯子的28位堿基，推測其B抗原弱表達發(fā)生機制類似B310基因，由于該標本的等位基因未做單倍體分析，所以未能確定突變位于A還是B等位基因上，后期將完善相關實驗來證實以上推測。另外，2號標本A201除了一處堿基替換外，還存在c.1061處胞嘧啶單核苷酸的缺失，從而導致終止密碼子失效，最終造成A2轉移酶活性顯著下降。據(jù)報道，在PH 5.5的條件下轉化低分子量的底物，來源于A1血清的A轉移酶的活性比A2轉移酶高5～10倍[17]。

現(xiàn)有PCR-SSP方法試劑盒只能針對ABO基因中數(shù)個常見的重要位點做分析，而不能檢測之外的點突變及缺失等情況[18]，因此本次研究用PCR-SSP方法只鑒定了A201/O1亞型，PCR-SSP方法與血清學方法鑒定結果的符合率雖然較高，但根據(jù)表2的數(shù)據(jù)，大部分標本用PCR-SSP方法檢測的結果比較粗略。因此，當血型血清學和PCR-SSP方法結論不一致時，需要進行DNA測序才能發(fā)現(xiàn)更多的突變情況。而PCR-SSP方法簡單易操作，且在當天可以出結果，對于緊急且血清學結果不明確的標本可先用此方法分型。

筆者使用3種方法檢測了ABO亞型標本，積累了鑒定ABO亞型的實驗經(jīng)驗，對本地區(qū)ABO亞型發(fā)生頻率及分子生物學特征有了初步了解。此次研究的例數(shù)較少，且未能對19例標本全部進行PCR-SSP檢測及ABO等位基因全序列的測序，今后還需進一步收集標本來彌補以上不足。

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