蘆安娜

摘要：以卷曲霉素產(chǎn)生的菌卷曲鏈霉菌作為出發(fā)菌，經(jīng)過UV誘變和五氯酚濃縮處理，得到一株效價在7950u/ml左右的營養(yǎng)缺陷型卷曲霉素菌株，再經(jīng)過EMS誘變處理篩選得到更多突變株和高產(chǎn)菌，整個過程中卷曲霉素的效價都能保持在穩(wěn)定的狀態(tài)。采用單因子實驗與多因子正交實驗進(jìn)行分析，經(jīng)過研究確定卷曲霉素菌株N13最佳發(fā)酵條件，此時卷曲霉素效價達(dá)到了9483u/ml，比出發(fā)菌的效價提升了42.8%以上。

關(guān)鍵詞：卷曲霉素;卷曲鏈霉菌;結(jié)核桿菌;發(fā)酵生產(chǎn);菌種改良

引言：卷曲霉素主要是由卷曲鏈霉菌產(chǎn)生的環(huán)狀多肽類抗生素，對結(jié)核桿菌傳染引發(fā)的肺結(jié)核有著較好的治療效果，且副作用比較小。目前卷曲霉素已成為較為理想的抗結(jié)核菌藥物，由于其發(fā)酵效價成本低，成藥價格略高，有必要對卷曲霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行有效的改良與分析，經(jīng)過物理或化學(xué)誘變劑處理方法做出改良，并得到理想化實驗結(jié)果。

1.卷曲霉素的研究現(xiàn)狀

卷曲霉素簡稱CPM，是由卷曲鏈霉菌或指孢囊菌產(chǎn)生，類似于紫霉素的環(huán)狀多肽類抗生素，卷曲霉素中的組份十分相似，可以溶于水，但無法溶于多數(shù)有機溶劑，卷曲霉素在酸堿度4-8的水溶液中比較穩(wěn)定，其抗菌機理是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。當(dāng)前人們將卷曲霉素用于抗結(jié)核桿菌感染，這是有效控制耐藥性結(jié)核疾病的重要抗生素，隨著肺結(jié)核抗菌素的研制成功，肺結(jié)核已經(jīng)基本得到控制，但近年來該疾病再次蔓延，世衛(wèi)組織于1993年宣布肺結(jié)核為全球性急癥，1996年將4月24日定為世界防治結(jié)核病日[1]。

2.卷曲霉素產(chǎn)生菌的改良研究

2.1材料與方法

2.1.1菌株與試劑

卷曲霉素產(chǎn)生菌的改良試驗主要用到兩種菌株，一種是出發(fā)菌株卷曲鏈霉素4006，另一種是檢測菌枯草芽孢桿菌6633，這兩種菌株目前都由中國科學(xué)研成都生物所負(fù)責(zé)保存。

本實驗使用到的方法主要有以下幾種：（1）紫外線誘變篩選。紫外線誘變就是將出發(fā)菌卷曲鏈霉素在高氏一號斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天左右，溫度控制在28℃，使用無菌生理鹽水洗下孢子，再用玻珠搖勻，制作為每毫升106個孢子懸液。取下50ml的孢子懸液，將其放在500ml燒杯內(nèi)，紫外燈先預(yù)熱20min，隨后將燒杯放在磁力攪拌器上，用40w燈在距離30cm的位置照射0-5min，分別取樣10ml即可。等待樣品稀釋取0.1ml稀釋液涂布ES平板，在28℃環(huán)境下避光培養(yǎng)一周即可，測定卷曲霉素紫外誘變后的存活情況。（2）營養(yǎng)缺陷型篩選。使用無菌牙簽將ES平板上長出的菌落分別點中在基礎(chǔ)平板和ES平板中，并與出發(fā)菌4006進(jìn)行對照分析，每個平板需點中菌落52個，在28℃的環(huán)境溫度下培養(yǎng)10天左右。在基礎(chǔ)平板上不長，但是在ES平板上生長的菌落就是營養(yǎng)缺陷型。（3）CPM抑制卷曲鏈霉菌4006實驗分析。

2.1.2培養(yǎng)基

對于實驗中需要用到的培養(yǎng)基，主要有以下幾種：高氏一號培養(yǎng)基，使用蒸餾水定容后到1L，要求酸堿度在7.2左右;種子培養(yǎng)基，其中包含蛋白、玉米淀粉、葡萄糖、碳酸鈣、氯化鈉、氫氧化鈉等，用蒸餾水定容，酸堿值達(dá)到7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基，主要用于卷曲霉素初篩和復(fù)篩，與種子培養(yǎng)基要求相同;NO.13與NO.39培養(yǎng)基，前者需要將20g的掩埋在1L蒸餾水內(nèi)煮沸20分鐘，紗布過濾后加入18g瓊脂，補充蒸餾水到1L，調(diào)整酸堿值為7.2，再加入1ml微量元素溶液。NO.39培養(yǎng)基中包含葡萄糖、麥芽酚、碳酸鈣、瓊脂以酵母膏，加入蒸餾水后還需使用KOH調(diào)整PH值。

2.1.3原生質(zhì)體NTG誘變

首先，培養(yǎng)菌絲體生長。將出發(fā)菌孢子使用生理鹽水洗下，玻璃珠搖勻后接入盛裝25mlPM1培養(yǎng)液的三角瓶內(nèi)，要求溫度控制在30℃，每分鐘150r勻速培養(yǎng)24小時。其次，制備原生質(zhì)體，最終溶菌酶的濃度應(yīng)達(dá)到1g/L，在搖床上保持每分鐘100r的速度，35℃下酶處理60分鐘。最后，NTG誘變原生質(zhì)體，取10ml離心管，共3支，分別加入4ml原生質(zhì)體懸液，再加入NTG，洗滌后制作原生質(zhì)體溶液并涂布在平板上，30℃的溫度下培養(yǎng)一周，最終確定原生質(zhì)體再生頻率。

2.1.4篩選卷曲霉素高產(chǎn)菌

初步篩選時使用瓊脂塊法，復(fù)篩使用搖瓶發(fā)酵法，將斜面上生長好的孢子接種在25ml種子培養(yǎng)液內(nèi)，在250ml三角瓶中以每分鐘240r的速度培養(yǎng)48小時，種子長好以后再以10%的接種量，將其接種在25ml發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)，同等培養(yǎng)條件培養(yǎng)96小時。

2.2研究結(jié)果

2.2.1獲得營養(yǎng)缺陷型高產(chǎn)菌

取經(jīng)過紫外線誘變5分鐘，致死率94%，且經(jīng)過五氯酚處理后的卷曲霉素孢子懸液涂布在ES平板中，再從菌落中篩選出營養(yǎng)缺陷型4株，經(jīng)過瓊脂法和搖瓶發(fā)酵的篩選方法，從缺陷型菌株中篩出卷曲霉素效價在7950u/ml的營養(yǎng)缺陷型高產(chǎn)菌，其突變株產(chǎn)量比出發(fā)菌4006產(chǎn)量高出19.7%[2]。

2.2.2獲得抗終產(chǎn)物CPM高產(chǎn)菌

取經(jīng)過EMS誘變2分鐘且致死率在74%的出發(fā)菌4006的孢子液，涂布在ES平板內(nèi)，平板中含有CPM，挑取290株CPM突變株，使用瓊脂塊法經(jīng)過初篩后發(fā)現(xiàn)抑菌圈大于出發(fā)菌，搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩，得出抗性突變株5-41，與4006-35株相比產(chǎn)量提高了6.4%。所以抗終產(chǎn)物CPM突變株5-41可以作為下一輪原生質(zhì)體NTG誘變出發(fā)菌株。

2.2.3NTG誘變原生質(zhì)體篩選高產(chǎn)菌

再生平板中的原生質(zhì)體占比92%，使用NTG溶液誘變原生質(zhì)體30分鐘，篩選出卷曲霉素高產(chǎn)菌，挑選出出高產(chǎn)菌后還需經(jīng)過初篩與復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)沒有得到超過出發(fā)菌5-41的菌株，經(jīng)過NTG誘變CPM抗性突變株原生質(zhì)體再生菌落內(nèi)選730株做初篩與復(fù)篩，最終得到了9050u/ml突變株N13，與出發(fā)菌5-41相比產(chǎn)量提高了7.2%。

總結(jié)：總而言之，當(dāng)前人們加深了對微生物遺傳學(xué)的研究深度，有目的的篩選出了與產(chǎn)品質(zhì)量和數(shù)量相符合的突變型菌株，避免了以往篩選工作的盲目性。本文采用篩選營養(yǎng)缺陷型突變株的方法得到了卷曲霉素高產(chǎn)突變菌株，在達(dá)到卷曲霉素高產(chǎn)菌朱目的的同時為后續(xù)結(jié)核菌的抑制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李桂蓮，萬康林.5種中國罕見慢速生長非結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及臨床分離株的藥物敏感性分析[J].疾病監(jiān)測，2020，35（05）：435-441.

[2]許磊.觀察卷曲霉素在耐多藥肺結(jié)核治療中應(yīng)用價值并分析用藥安全性[J].人人健康，2020（08）：223-224.