崔 娟，喬 方，胡英露，田鑫月，趙麗娜，史樹森*

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，吉林 132101；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

篩豆龜蝽Megacoptacribraria(Fabricius)屬半翅目Hemiptera龜蝽科Plataspidae，是大豆等豆科作物的一種重要刺吸類害蟲(Shietal., 2014)。目前，已知該害蟲分布于我國(guó)及澳大利亞、美國(guó)、印度、印度尼西亞、日本、韓國(guó)、馬來西亞、緬甸等國(guó)家，并有進(jìn)一步擴(kuò)展蔓延的趨勢(shì)(Egeretal., 2010)，已成為世界性害蟲。篩豆龜蝽喜溫暖和濕潤(rùn)的環(huán)境(Liangetal., 2018)，25℃條件下，成蟲壽命75 d，產(chǎn)卵前期35 d，單雌產(chǎn)卵量160粒，世代重疊嚴(yán)重，是我國(guó)南方各大豆產(chǎn)區(qū)的重要害蟲(Shietal., 2014)，主要以成蟲、若蟲刺吸大豆莖稈，豆莢和葉片，為害嚴(yán)重時(shí)，田間被害株率達(dá)到70%～80%(Rubersonetal., 2013)，不防治的田塊可造成大豆減產(chǎn)60%(Seiteretal., 2013)。

近年來，全球氣候變暖導(dǎo)致我國(guó)南方區(qū)域性極端溫度頻發(fā)(馬罡和馬春森, 2016)，夏季最高氣溫往往超過40℃，尤其是中午到午后的3～4個(gè)小時(shí)(Zhangetal., 2015)。由于農(nóng)田的開放式結(jié)構(gòu)，夏季大豆田冠層溫度較高，白天田間微生境較周圍環(huán)境高0.9℃～4.5℃(Grant and Lamp, 2018)。如此高溫環(huán)境對(duì)篩豆龜蝽種群的生存和發(fā)展影響如何？在全球氣候變暖的大背景下，篩豆龜蝽對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)性又如何？目前尚不十分清楚，而深入了解這些問題對(duì)明確其潛在分布區(qū)的預(yù)警和綜合管理具有重要意義。

本研究測(cè)定了篩豆龜蝽在梯度高溫脅迫下的存活情況及其體內(nèi)SOD、CAT、POD、T-AOC的活性變化及MDA的含量變化，以期了解篩豆龜蝽成蟲對(duì)極端高溫環(huán)境的適應(yīng)能力，進(jìn)而明確其田間種群對(duì)極端高溫環(huán)境的適應(yīng)性，為研究該害蟲的生態(tài)適應(yīng)性評(píng)價(jià)及對(duì)其全球區(qū)域性分布擴(kuò)張趨勢(shì)分析提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試?yán)ハx

篩豆龜蝽采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)基地大豆田(32°26′25″N, 118°50′23.47″E)，室內(nèi)飼養(yǎng)。養(yǎng)蟲室環(huán)境溫度25℃±1℃，相對(duì)濕度65%～75%，光周期16 L∶8 D。成蟲飼養(yǎng)在養(yǎng)蟲籠(0.6 m×0.6 m×0.6 m)內(nèi)，每籠50頭，以結(jié)莢初期的盆栽大豆植株進(jìn)行飼養(yǎng)，每籠2盆，每盆5株大豆，待成蟲產(chǎn)卵孵化后，采集大豆葉片上同期初孵若蟲，用小毛筆輕輕將其挑到開花期的大豆植株上飼養(yǎng)，每籠100頭，15 d更換一次盆栽大豆，待若蟲羽化，每50頭同期羽化成蟲放入新的養(yǎng)蟲籠內(nèi)飼養(yǎng)10 d備用。

1.1.2儀器材料

主要試劑：SOD、POD、CAT、T-AOC、MDA和總蛋白含量試劑盒均購于南京建成生物工程公司。

主要儀器：BIR-80DI生化培養(yǎng)箱(上海三滕儀器有限公司)；SP-756P紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜有限公司)；Centrifuge 5430R多功能離心機(jī)(Eppendorf中國(guó)有限公司)；AL-204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 方法

1.2.1試蟲處理

根據(jù)中國(guó)中南部(篩豆龜蝽分布區(qū))夏季最高氣溫可達(dá)到44℃，通常持續(xù)3個(gè)小時(shí)(Chenetal., 2014)，本試驗(yàn)選擇37℃、40℃、43℃、46℃為高溫梯度脅迫溫度，處理時(shí)間4 h，以適溫25℃(Shietal., 2014)為對(duì)照處理。取10日齡雌雄成蟲置于干凈無菌的小型有機(jī)玻璃養(yǎng)蟲罐(10 cm×15 cm)內(nèi)，每罐雌雄蟲各10頭，養(yǎng)蟲罐底部放置等體積濕潤(rùn)的海棉保持罐內(nèi)濕度(模擬田間小氣候)，將上述養(yǎng)蟲罐分別置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)溫度處理。

1.2.2高溫脅迫對(duì)篩豆龜蝽存活的影響

觀察上述各溫度處理后試蟲的存活情況，用小毛筆輕輕碰觸蟲體，可以自由爬動(dòng)，則視為存活，記錄各處理成蟲存活數(shù)量。

1.2.3抗氧化酶活性、總抗氧化能力和MDA含量測(cè)定

每個(gè)溫度隨機(jī)抽取處理后的雌雄成蟲各5頭為測(cè)定樣本，3次重復(fù)。

酶液提取：準(zhǔn)確稱量各處理活蟲質(zhì)量，按照質(zhì)量與0.86%生理鹽水1∶9(m/v)的比例配置裝入離心管，將離心管放置冰水混合物內(nèi)，用微量研磨儀機(jī)械研磨成10%組織勻漿，將勻漿液在高速冷凍離心機(jī)4℃下冷凍離心15 min(12 000 r/min)，所得上清液為酶提取液。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參考Bradford(1976)方法，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提取和測(cè)定。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣品總蛋白含量。

SOD、CAT、POD、T-AOC活性和MDA含量的測(cè)定，均參照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用單因素方差分析(ANOVA)分析不同處理溫度下篩豆龜蝽成蟲存活率及抗氧化酶活性的差異顯著性(P<0.05)，并采用LSD測(cè)驗(yàn)進(jìn)行多重比較。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)篩豆龜蝽成蟲存活的影響

篩豆龜蝽對(duì)高溫適應(yīng)性比較強(qiáng)，在37℃、40℃、43℃和46℃下處理4 h后，成蟲存活率均為100%，與對(duì)照無顯著差異。

2.2 篩豆龜蝽成蟲體內(nèi)抗氧化酶活性對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

2.2.1篩豆龜蝽成蟲SOD活性對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

各高溫處理對(duì)SOD活性(F=57.974; df=4,10;P<0.001)影響顯著，其活性均顯著高于對(duì)照。其中，37℃處理的SOD活性最高，較25℃時(shí)增加了97.41%，隨著溫度進(jìn)一步升高，SOD活性有所下降，在40℃～46℃范圍內(nèi)，各處理間SOD活性仍然顯著高于對(duì)照(圖1-A)。

2.2.2篩豆龜蝽成蟲CAT活性對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

各高溫處理對(duì)CAT活性(F=14.96; df=4,10;P<0.001)亦有顯著影響，各高溫處理CAT活性均顯著高于對(duì)照。37℃～46℃范圍內(nèi)，隨著處理溫度的升高CAT活性呈逐漸升高趨勢(shì)，但各處理間無顯著差異。在極端高溫46℃時(shí)，CAT活性最高，較25℃時(shí)增高78.97%，較37℃時(shí)增高14.90%(圖1-B)。

2.2.3篩豆龜蝽成蟲POD活性對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

在37℃～40℃范圍內(nèi)，各溫度處理POD活性(F=12.236; df=4,10;P=0.001)顯著高于對(duì)照。隨著處理溫度進(jìn)一步升高，POD活性顯著降低，43℃和46℃處理兩者間無顯著差異，也分別與對(duì)照無顯著差異，且POD活性分別較25℃增高20%左右(圖1-C)。

圖1 不同溫度處理對(duì)篩豆龜蝽成蟲SOD(A)、CAT(B)和POD(C)活性影響

2.3 高溫脅迫對(duì)篩豆龜蝽成蟲體內(nèi)T-AOC活性的影響

各溫度處理對(duì)T-AOC活性(F=33.63; df=4,10;P<0.001)影響顯著，各高溫脅迫處理后其活性均顯著高于對(duì)照。37℃～46℃范圍內(nèi)，隨著處理溫度的升高T-AOC活性呈先升高后降低趨勢(shì)。當(dāng)溫度為40℃時(shí)T-AOC活性最高，較對(duì)照25℃時(shí)增高54.55%，在極端高溫46℃時(shí)其活性最低，顯著低于其它處理，但仍較對(duì)照增高22.24%(圖2)。

圖2 不同溫度處理對(duì)篩豆龜蝽成蟲T-AOC活性影響

2.4 高溫脅迫對(duì)篩豆龜蝽成蟲體內(nèi)MDA含量的影響

各溫度處理MDA含量存在一定差異(F=5.398; df=4,10;P=0.017)。在37℃～46℃范圍內(nèi)，MDA含量與對(duì)照無顯著差異，隨著處理溫度的升高M(jìn)DA含量呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)溫度升高到40℃時(shí)MDA含量最高，隨著溫度進(jìn)一步升高，MDA含量降低，當(dāng)溫度達(dá)到46℃時(shí)MDA含量最低，顯著低于40℃時(shí)MDA的含量，且較對(duì)照降低5.58%(圖3)。

圖3 不同溫度處理對(duì)篩豆龜蝽成蟲MDA含量的影響

3 結(jié)論與討論

在昆蟲的長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，形成了一系列適應(yīng)環(huán)境溫度的保護(hù)機(jī)制，其中抗氧化酶的應(yīng)激變化是蟲體響應(yīng)溫度脅迫的重要策略之一(Bafanaetal., 2011)。篩豆龜蝽存在世代重疊現(xiàn)象，任何一個(gè)發(fā)育階段或整個(gè)世代都可能遭遇階段性高溫脅迫，而其成蟲有較長(zhǎng)的壽命，終生可繁殖(Shietal., 2014)。在本研究中，篩豆龜蝽對(duì)高溫有較強(qiáng)的耐受能力，46℃以下短時(shí)的高溫脅迫對(duì)其無致死效應(yīng)，而高溫脅迫下篩豆龜蝽成蟲的抗氧化酶SOD、CAT、POD、T-AOC活性及MDA含量均發(fā)生了不同程度的變化，表現(xiàn)出蟲體受到外界高溫環(huán)境干擾達(dá)到一定程度時(shí)所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，說明這些抗氧化酶在減輕熱應(yīng)激產(chǎn)生活性氧ROS對(duì)蟲體的不利影響方面具有積極作用，進(jìn)而有效提高了對(duì)環(huán)境高溫的適應(yīng)性。

SOD幾乎存在于所有的生物細(xì)胞中，是生物體內(nèi)最重要的抵御氧化脅迫的物質(zhì)(Celinoetal., 2011)。廣聚螢葉甲Ophraellacommuna在短期高溫脅迫下，其成蟲的SOD活性整體顯著升高(Chenetal., 2018)，在對(duì)茶淡黃刺蛾Darnatrima的研究中也有類似的現(xiàn)象(李品武等, 2016)。本研究結(jié)果顯示，篩豆龜蝽在高溫脅迫后SOD活性也顯著增加，溫度超過40℃，SOD活性雖有顯著下降，但仍顯著高于對(duì)照，表明高溫脅迫能誘導(dǎo)篩豆龜蝽增強(qiáng)SOD活性，從而提高篩豆龜蝽的耐熱能力。

CAT和POD均能清除昆蟲體內(nèi)過氧化氫(H2O2)，H2O2濃度較高時(shí)CAT發(fā)揮主要作用，而H2O2濃度較低時(shí)POD發(fā)揮主要作用，二者共同作用將H2O2維持在較低的水平(Lietal., 2003)。篩豆龜蝽受溫度脅迫后POD和CAT活性同時(shí)增加，但在高于43℃后POD活性顯著下降而CAT活性無顯著變化，雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲Monoleptahieroglyphica的POD活性表現(xiàn)為隨溫度的升高呈先升高后降低的變化(張志虎等, 2018)。說明在高溫37℃～40℃時(shí)，篩豆龜蝽體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2主要以CAT和POD共同發(fā)揮作用，高于43℃后H2O2濃度較高則主要由CAT清除。

T-AOC是指有機(jī)體體內(nèi)的總抗氧化能力(Ghisellietal., 2000)。篩豆龜蝽成蟲T-AOC活性隨著脅迫處理溫度的升高，表現(xiàn)為先增加而后降低，但均顯著高于對(duì)照，表明篩豆龜蝽成蟲在高溫條件下誘導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)較多。T-AOC活性在高溫40℃時(shí)達(dá)最高，而SOD和POD在37℃時(shí)活性最高，CAT在43℃時(shí)最高，T-AOC活性與SOD、POD、CAT活性最大值的脅迫溫度并不一致，說明篩豆龜蝽還存在其他的抗氧化機(jī)制，在昆蟲體內(nèi)，海山梨醇、海藻糖、熱激蛋白等已被發(fā)現(xiàn)與抗氧化酶共同抵御活性氧的傷害(Cuietal., 2011；唐維媛等, 2016)。隨著溫度的升高，T-AOC活性又有所下降，表明部分抗氧化機(jī)制可能被抑制。

MDA是脂質(zhì)過氧化物的主要分解產(chǎn)物，作為氧化應(yīng)激的一個(gè)常用指標(biāo)，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度(Raeletal., 2004)。本研究結(jié)果顯示，篩豆龜蝽經(jīng)高溫脅迫后37℃～43℃體內(nèi)的MDA含量有所增加但差異并不顯著，說明MDA的正常水平可能是由于抗氧化酶活性的增強(qiáng)，可以清除多余的脂質(zhì)過氧化。隨著溫度的增加，MDA含量總體呈下降趨勢(shì)，這與高溫脅迫對(duì)龜紋瓢蟲Propylaeajaponica和腐食酪螨Tyophagusputrescentiae的影響結(jié)果類似(Zhangetal., 2015; 王靜等, 2019)，篩豆龜蝽在較高的溫度脅迫下伴隨著脂質(zhì)過氧化和其他對(duì)氧化脅迫的反應(yīng)，抗氧化能力逐漸增強(qiáng)，從而清除了體內(nèi)過多的活性氧。

綜上所述，抗氧化酶在高溫脅迫的抗氧化反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，篩豆龜蝽成蟲可有效處理熱脅迫誘導(dǎo)的活性氧進(jìn)而表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境高溫較強(qiáng)的適應(yīng)性。這與篩豆龜蝽主要分布在中國(guó)南方地區(qū)的生態(tài)學(xué)表現(xiàn)是一致的，通過對(duì)生態(tài)環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng)，形成了自身機(jī)體具有較強(qiáng)的耐熱性。從本研究篩豆龜蝽成蟲可對(duì)46℃極端高溫仍有相當(dāng)積極生理響應(yīng)的結(jié)果看，在全球氣候持續(xù)變暖條件下，高溫對(duì)該害蟲種群分布及在農(nóng)田發(fā)生危害的不利影響是有限的，隨著溫度的升高，該害蟲有可能通過遷移擴(kuò)散擴(kuò)大其空間分布范圍，危害進(jìn)一步加重。本研究較全面測(cè)定分析了在極端高溫條件下篩豆龜蝽抗氧化防御系統(tǒng)的響應(yīng)，該結(jié)果為進(jìn)一步開展篩豆龜蝽預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和在全球氣候持續(xù)變暖的環(huán)境下深入探討其種群動(dòng)態(tài)變化、分布范圍以及其對(duì)高溫環(huán)境適應(yīng)的分子機(jī)制研究提供了科學(xué)依據(jù)。