張麗，湯亞飛，李正剛，于琳，藍(lán)國(guó)兵，佘小漫，何自福

侵染廣東省葫蘆科作物的中國(guó)南瓜曲葉病毒的分子特征

張麗，湯亞飛，李正剛，于琳，藍(lán)國(guó)兵，佘小漫，何自福

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640

【】中國(guó)南瓜曲葉病毒（squash leaf curl China virus，SLCCNV）是危害葫蘆科作物的主要病毒之一，可侵染南瓜、葫蘆、冬瓜、黃瓜、甜瓜、哈密瓜，嚴(yán)重影響葫蘆科作物生產(chǎn)。論文旨在探究SLCCNV廣東分離物的分子特征、親緣關(guān)系及其致病性，為SLCCNV的防控提供科學(xué)依據(jù)。從廣東省湛江市雷州市和徐聞縣、惠州市博羅縣、河源市源城區(qū)以及佛山市高明區(qū)共采集53份疑似感染菜豆金色黃花葉病毒屬（）病毒的葫蘆科作物病樣，提取總DNA，利用菜豆金色黃花葉病毒屬通用引物AV494/CoPR進(jìn)行PCR檢測(cè)。選取PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行RCA擴(kuò)增、酶切、克隆及測(cè)序，獲得各分離物基因組A組分（DNA-A）的全長(zhǎng)序列；同時(shí)利用背向引物PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序，獲得各分離物基因組B組分（DNA-B）的全長(zhǎng)序列。將得到的SLCCNV廣東分離物DNA-A和DNA-B全長(zhǎng)序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，利用SDT1.2軟件MUSCLE alignment方法對(duì)序列相似性作進(jìn)一步比較分析，應(yīng)用MEGA7軟件對(duì)獲得的SLCCNV廣東分離物及已報(bào)道的SLCCNV分離物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用同源重組技術(shù)，構(gòu)建SLCCNV河源南瓜分離物的侵染性克隆，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)注射接種南瓜子葉，測(cè)定其致病性。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，53份疑似病樣中有52份感染了菜豆金色黃花葉病毒屬病毒；進(jìn)一步從南瓜、葫蘆、冬瓜以及白瓜4種葫蘆科作物病樣中分別克隆獲得8個(gè)SLCCNV廣東分離物基因組全序列，DNA-A組分全長(zhǎng)大小為2 735—2 739 nt，含有6個(gè)ORF，與已報(bào)道SLCCNV相同。DNA-B組分大小為2 701—2 721 nt，含有2個(gè)ORF，分別編碼與病毒運(yùn)動(dòng)相關(guān)的蛋白BC1和BV1。序列相似性比較結(jié)果顯示，廣東不同分離物DNA-A組分核苷酸序列相似性在94.9%以上，與已報(bào)道的SLCCNV其他分離物的相似性在88%以上；所獲得的DNA-B組分核苷酸序列相似性在86.7%以上，與已報(bào)道的SLCCNV其他分離物的相似性在83%以上。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，8個(gè)廣東分離物與來(lái)自中國(guó)廣西、河南、海南、越南、泰國(guó)、菲律賓、印度尼西亞的分離物親緣關(guān)系近，同屬于一個(gè)分支，而與來(lái)自印度的分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。致病性測(cè)定結(jié)果表明，接種后15 d（dpi），接種南瓜植株的新葉開(kāi)始出現(xiàn)了皺縮癥狀；30 dpi，接種南瓜植株表現(xiàn)典型的曲葉病癥狀，PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，Western blot檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。在廣東檢測(cè)到SLCCNV侵染多種葫蘆科作物，SLCCNV是引起廣東南瓜曲葉病的病原。SLCCNV廣東分離物與廣西、海南等分離物親緣關(guān)系近，同屬于一個(gè)分支，而與來(lái)自印度的分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

中國(guó)南瓜曲葉病毒；廣東??；分子特征；侵染性克?。恢虏⌒?/p>

0 引言

【研究意義】中國(guó)南瓜曲葉病毒（squash leaf curl China virus，SLCCNV）屬于雙生病毒科（）菜豆金色黃花葉病毒屬（）[1]，由煙粉虱（）以持久性方式進(jìn)行傳播，不能通過(guò)機(jī)械摩擦和種子帶毒傳播[2-3]。中國(guó)南瓜曲葉病毒主要侵染南瓜、葫蘆、冬瓜、甜瓜等葫蘆科（Cucurbitaceae）作物，引起植株長(zhǎng)勢(shì)弱、葉片卷曲、皺縮等癥狀，嚴(yán)重影響果實(shí)的商品價(jià)值和產(chǎn)量[1,4-5]，已成為危害葫蘆科作物的重要病毒之一[2-3]。葫蘆科作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位，廣東省常年種植有南瓜、冬瓜、黃瓜、節(jié)瓜等多種葫蘆科蔬菜作物，田間病毒病和煙粉虱發(fā)生非常普遍。煙粉虱傳病毒病也成為影響廣東葫蘆科蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)制約因子。因此，對(duì)危害廣東省葫蘆科作物的SLCCNV的分子特征和致病性開(kāi)展研究，可為該病毒病的防控提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】SLCCNV是一種單鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組含DNA-A和DNA-B兩個(gè)組分，屬于雙組分病毒，基因組大小為2.5—2.8 kb。DNA-A編碼6個(gè)ORF，其中病毒鏈上包含2個(gè)ORF，分別為（編碼外殼蛋白）和（編碼與病毒移動(dòng)相關(guān)蛋白），互補(bǔ)鏈上包含4—5個(gè)ORF，分別為（編碼復(fù)制相關(guān)蛋白）、（編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白）、（編碼復(fù)制增強(qiáng)蛋白）、（編碼復(fù)制或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）[6]。DNA-B編碼2個(gè)ORF，其中病毒鏈上的編碼核穿梭蛋白，互補(bǔ)鏈上的編碼運(yùn)動(dòng)蛋白[7-8]。DNA-A和DNA-B在序列、位置和結(jié)構(gòu)上存在保守的基因間隔區(qū)（intergenic region，IR），也稱為共同區(qū)（common region，CR）。該區(qū)域含有雙生病毒復(fù)制起始相關(guān)的“TAATATT/AC”9堿基保守序列。SLCCNV最先發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)90年代廣西南寧田間表現(xiàn)曲葉癥狀的南瓜病樣中，根據(jù)其外殼蛋白（coat protein，CP）基因序列比較分析鑒定為一個(gè)雙生病毒新種[1]。隨后，在越南[9]、印度[10-12]、菲律賓[13]、泰國(guó)[14]、巴基斯坦[15]、東帝汶[16]等多國(guó)的南瓜上也相繼發(fā)現(xiàn)了SLCCNV；而在我國(guó)，目前已在廣西、河南、云南、海南等多省報(bào)道有該病毒病的發(fā)生[1,17-22]。已報(bào)道的SLCCNV可侵染的自然寄主有南瓜[1]、葫蘆[23-24]、冬瓜[25]、黃瓜[26]、甜瓜[17]、哈密瓜[21]多種葫蘆科作物?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2018—2020年，筆者系統(tǒng)調(diào)查了廣東省葫蘆科作物病毒病發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)南瓜、冬瓜、葫蘆以及白瓜等作物的病毒病及煙粉虱發(fā)生均十分普遍，其中有一些植株表現(xiàn)葉片卷曲。利用菜豆金色黃花葉病毒屬病毒（begomoviruses）的簡(jiǎn)并引物AV494/CoPR[27-28]進(jìn)行PCR檢測(cè)，證實(shí)這些表現(xiàn)葉片卷曲癥狀的病樣中存在begomoviruses。目前文獻(xiàn)中尚未見(jiàn)對(duì)危害廣東葫蘆科作物的SLCCNV及其致病性的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究危害廣東葫蘆科作物的煙粉虱傳雙生病毒種類(lèi)及其分子特征，明確其致病性，為該病毒病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年7月至2021年1月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 樣品來(lái)源

2018—2020年，從廣東省湛江市雷州市、湛江市徐聞縣、惠州市博羅縣、河源市源城區(qū)以及佛山市高明區(qū)葫蘆科蔬菜種植區(qū)隨機(jī)采集疑似病樣53份，其中南瓜31份、葫蘆10份、冬瓜7份、白瓜5份，采集的植物樣品帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱保存。

1.2 樣品總DNA提取

取植株病葉組織100 mg，利用北京全式金生物技術(shù)有限公司的植物DNA提取試劑盒（Easypure Plant Genomic DNA Kit）抽提其總DNA，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DNA沉淀溶解于50 μL TE（10 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0）溶液中。

1.3 PCR檢測(cè)

利用菜豆金色黃花葉病毒屬病毒基因部分序列的通用簡(jiǎn)并引物AV494：GCCYATRTAYAGRAAGC CMAG/CoPR：GANGSATGHTRCADGCCATATA[27-28]，對(duì)53份疑似病樣進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系：待測(cè)病樣總DNA 1 μL（約20 ng），滅菌水9.5 μL，PCR Mixer 12.5 μL（TaKaRa公司），10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL，總體積25 μL。反應(yīng)程序：94℃ 4 min；94℃ 45 s；52℃ 45 s；72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4 全基因組序列的擴(kuò)增

1.4.1 DNA-A組分全長(zhǎng)序列擴(kuò)增及克隆 挑取PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的病樣總DNA為模板，利用TempliPhiTMRCA Kit（GE Healthcare）進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）獲得病毒的基因全長(zhǎng)[29]。具體操作步驟：1 μL總DNA樣品（約20 ng）加入5 μL樣品緩沖液（sample buffer），混勻，95℃變性3 min；立即置冰上冷卻；隨后加入5 μL反應(yīng)緩沖液（reaction buffer）和0.2 μL DNA聚合酶，在30℃反應(yīng)18—20 h；最后在65℃下加熱10 min以終止反應(yīng)，RCA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩CA擴(kuò)增產(chǎn)物分別用HⅠ、RⅠ、dⅢ、Ⅰ限制性內(nèi)切酶（Thermo公司）進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系：RCA產(chǎn)物2 μL、內(nèi)切酶1 μL、10×內(nèi)切酶緩沖buffer 1 μL，總酶切反應(yīng)體系10 μL。在37℃條件下酶切1 h，之后電泳分析。若酶切出2.7—3.0 kb或1.5 kb左右的條帶，應(yīng)用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Thermo公司）回收RCA酶切產(chǎn)物，純化后連接到相應(yīng)酶切處理的pGEM-3Z/5Z載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Trans-T1，每個(gè)平板隨機(jī)挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆送上海生工生物股份有限公司測(cè)序。

1.4.2 DNA-B組分全長(zhǎng)序列擴(kuò)增及克隆 根據(jù)已報(bào)道SLCCNV的DNA-B組分序列（GenBank登錄號(hào)：KC171649），設(shè)計(jì)一對(duì)背向引物F1/R1，用于擴(kuò)增DNA-B組分全長(zhǎng)，引物序列為F1：CAATGTAGCGTT TACATTTGATTTC/R1：AATAAAGGCGTGTGATAA ATTTATTG，反應(yīng)體系：待測(cè)病樣總DNA 1 μL（約20 ng），滅菌水9.5 μL，PCR Mixer 12.5 μL（TaKaRa公司），10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL，總體積25 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min；50℃ 1 min；72℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。應(yīng)用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Thermo公司）回收目的大小片段，連接至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Trans-T1，每個(gè)平板隨機(jī)挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆送上海生工生物股份有限公司測(cè)序。

1.5 序列分析

利用DNAStar軟件（DNASTAR Inc，Madison，USA）對(duì)測(cè)序的基因序列進(jìn)行拼接，獲得病毒各分離物基因組兩個(gè)組分的全長(zhǎng)序列，進(jìn)一步將所獲病毒基因組全長(zhǎng)序列在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行BLASTn比對(duì)，使用ORF finder進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)。利用SDT1.2的MUSCLE alignment對(duì)序列相似性作進(jìn)一步詳細(xì)分析[30]，使用MEGA7的鄰接法（neighbor joining，NJ）[31]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrapping值為1 000。

1.6 SLCCNV侵染性克隆構(gòu)建

1.6.1 DNA-A侵染性克隆的構(gòu)建 以采自河源市源城區(qū)的南瓜樣品HYNG-01為毒源，構(gòu)建該病毒分離物的侵染性克隆。設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增兩個(gè)1.0倍的DNA-A，擴(kuò)增引物分別為SLA1-F：ATATCGAATTCC TGCAGCCC/SLA1-R：GAAGAAGAAGAACATCAGGCGTAGACGAATTG；SLA2-F：GCCTGATGTTCTTCTTCTTCTTCTGTGGTTGC/ SLA2-R：CTAGAACTAGTGGATCC CCC（下劃線為同源重組序列）。序列經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，將所獲得的兩個(gè)1.0倍的DNA-A通過(guò)同源重組技術(shù)連接到pGreenⅡ0229載體上，進(jìn)一步對(duì)所得重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定，最終獲得DNA-A組分的侵染性克隆pGreenⅡ0229- 2.0A。

1.6.2 DNA-B侵染性克隆的構(gòu)建 以采自河源市源城區(qū)的南瓜樣品HYNG-01為毒源，設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增兩個(gè)1.0倍的DNA-B，擴(kuò)增引物分別為SLB1-F：ATATCGAATTCCTGCAGCCC/SLB1-R：GCAGACCATACAAAAA CCTCAGCGGATTAGATG；SLB2-F：GAGGTTTTTG TATGGTCTGCTGGTGACAGAAACC/SLB2-R：CTAGAACTAGTGGATCCCCC（下劃線為同源重組序列）。序列經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，將所獲的兩個(gè)1.0倍的DNA-B通過(guò)同源重組技術(shù)連接到pGreenⅡ0229載體上，對(duì)得到的質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定，最終獲得DNA-B組分的侵染性克隆pGreenⅡ0229-2.0B。

1.7 侵染性克隆的接種

將質(zhì)粒pGreenⅡ0229-2.0A和pGreenⅡ0229-2.0B（約0.5 μg）分別轉(zhuǎn)入100 μL GV3101（含pSoup）農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞（上海唯地生物技術(shù)有限公司），28℃培養(yǎng)48 h，對(duì)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。分別將含有pGreenⅡ0229-2.0A和pGreenⅡ0229-2.0B質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（100 μg·mL-1卡那霉素、25 μg·mL-1利福平），28℃條件下，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，4 000 r/min離心10 min，棄上清，收集沉淀，用農(nóng)桿菌懸浮緩沖液（10 mmol·L-1MES，10 mmol·L-1MgCl2，150 μmol·L-1AS）重懸，將菌液OD600值調(diào)至約1.0。在室溫靜置3 h后對(duì)南瓜（品種：蜜本3號(hào)）進(jìn)行注射接種。

1.8 Western blot檢測(cè)

取50 mg發(fā)病及健康對(duì)照的南瓜植株樣品于2 mL離心管中，經(jīng)液氮速凍及組織研磨機(jī)研磨，加入300 μL蛋白上樣緩沖液，充分振蕩混勻。沸水浴10 min，立即置于冰上2 min，12 000 r/min離心10 min，取20 μL上清進(jìn)行Western blot檢測(cè)。Western blot一抗選用與SLCCNV CP氨基酸序列相似性為61.1%的廣東番茄曲葉病毒（tomato leaf curl Guangdong virus，ToLCGuV）CP多克隆抗體，兔二抗購(gòu)自Sigma Aldrich。

2 結(jié)果

2.1 樣品采集及檢測(cè)

2018—2020年，對(duì)廣東省葫蘆科作物病毒病進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)部分田間的南瓜、葫蘆、冬瓜、白瓜4種葫蘆科作物葉片表現(xiàn)為葉片皺縮、卷曲等癥狀（圖1），疑似感染了菜豆金色黃花葉病毒屬病毒，分別隨機(jī)采集疑似病樣53份（表1）。利用begomoviruses特異簡(jiǎn)并引物AV494/CoPR[27-28]進(jìn)行PCR檢測(cè)，52份病樣總DNA中能擴(kuò)增出大小為570 bp的特異目的片段，對(duì)照中未擴(kuò)增出片段（圖2）。表明除了1份冬瓜病樣外，其他52份病樣中存在菜豆金色黃花葉病毒屬病毒（表1）。

A：葫蘆Cucurbits；B：白瓜White melon；C：冬瓜Wax gourd；D：南瓜 Pumpkin

M：DL 2000 DNA Marker (TaKaRa)；1—15：發(fā)病植株Diseased plants；CK：健康對(duì)照樣品Control sample

表1 采集樣品及檢出率

2.2 病毒分離物基因組的克隆與序列分析

2.2.1 病毒基因組結(jié)構(gòu) 對(duì)于每一采樣地的每種葫蘆科作物病樣，各挑選一個(gè)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品總DNA進(jìn)行RCA和酶切，利用HⅠ酶切均可以切出一條2.7 kb的條帶，經(jīng)克隆和序列測(cè)定，共獲得8個(gè)廣東分離物的基因組全長(zhǎng)（表2），這8個(gè)廣東分離物均含有DNA-A和DNA-B兩個(gè)組分。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，8個(gè)分離物基因組結(jié)構(gòu)特征基本一致，都為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且均有一個(gè)共同區(qū)（CR），該CR區(qū)含有9堿基保守序列TAATATT/AC[32]。DNA-A組分編碼6個(gè)ORF，其中，病毒鏈編碼2個(gè)蛋白，編碼外殼蛋白，編碼與移動(dòng)相關(guān)蛋白；互補(bǔ)鏈編碼4個(gè)蛋白，編碼復(fù)制相關(guān)蛋白，編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白，編碼復(fù)制增強(qiáng)蛋白，編碼復(fù)制或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。DNA-B組分編碼2個(gè)ORF，和，編碼與病毒運(yùn)動(dòng)相關(guān)的蛋白。8個(gè)分離物DNA-A和DNA-B組分ORF區(qū)域見(jiàn)表3。

2.2.2 病毒序列相似性分析 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)（圖3），8個(gè)廣東分離物DNA-A組分之間的序列相似性在94.9%以上。其中，佛山南瓜分離物FSNG和佛山白瓜分離物FSBG的相似性最高，為99.9%，河源南瓜分離物HYNG和湛江徐聞南瓜分離物XWNG的相似性僅次于前者，為99.5%，湛江雷州南瓜分離物L(fēng)ZNG和惠州葫蘆分離物HZHL的相似性為99.4%，惠州南瓜分離物HZNG和惠州冬瓜分離物HZDG的相似性為99.3%。BLAST檢索結(jié)果表明，8個(gè)廣東分離物的DNA-A與已登錄GenBank的SLCCNV各個(gè)分離物DNA-A相似性均大于88%；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，8個(gè)廣東分離物與來(lái)自我國(guó)不同地區(qū)的10個(gè)SLCCNV分離物以及泰國(guó)、越南、馬來(lái)西亞、菲律賓、印度尼西亞的16個(gè)SLCCNV分離物相似性均在92%以上，其中與來(lái)自我國(guó)不同地區(qū)的分離物相似性最高，在95%以上；而與來(lái)自印度的9個(gè)分離物的相似性較低，均在92%以下（圖3）。

表2 廣東分離物序列全長(zhǎng)和GenBank登錄號(hào)

圖3 SLCCNV 8個(gè)廣東分離物與其他35個(gè)分離物DNA-A序列相似性

8個(gè)SLCCNV 廣東分離物DNA-B組分的序列相似性均在86.7%以上，除雷州南瓜分離物L(fēng)ZNG外，其余7個(gè)分離物之間的相似性都在94.7%以上?；葜荻戏蛛x物HZDG與惠州葫蘆分離物HZHL相似性最高，為99.8%；佛山南瓜和白瓜分離物FSNG、FSBG與徐聞南瓜分離物XWNG，雷州南瓜分離物L(fēng)ZNG，惠州南瓜、葫蘆和冬瓜分離物HZNG、HZHL、HZDG的相似性都在95%以下；雷州南瓜分離物L(fēng)ZNG與佛山白瓜分離物FSBG的相似性為87.6%。BLAST檢索結(jié)果表明，8個(gè)廣東分離物的DNA-B與已登錄GenBank的SLCCNV的各個(gè)分離物DNA-B相似性均大于83%，其中與來(lái)自我國(guó)不同地區(qū)的7個(gè)分離物的相似性為87%—98%，與泰國(guó)、越南、菲律賓、印度尼西亞等7個(gè)SLCCNV分離物相似性為83%—92%，而與來(lái)自印度的8個(gè)分離物和巴基斯坦的2個(gè)分離物相似性均在86%以下，分離物L(fēng)ZNG與印度J1分離物（登錄號(hào)：MN594505）的相似性最低，僅83.1%（圖4）。

2.2.3 病毒親緣關(guān)系分析 為了分析8個(gè)廣東分離物DNA-A與SLCCNV其他35個(gè)分離物的親緣關(guān)系，以泰國(guó)番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl Thailand virus）DNA-A組分（登錄號(hào)：MN495605）為外組，利用MEGA7軟件以鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示（圖5），8個(gè)廣東分離物與來(lái)自中國(guó)不同地區(qū)、越南、泰國(guó)、柬埔寨等23個(gè)SLCCNV分離物聚類(lèi)在一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近；進(jìn)一步與印度尼西亞、菲律賓和馬來(lái)西亞3個(gè)SLCCNV分離物形成一個(gè)大的分支；而來(lái)自印度的9個(gè)SLCCNV分離物聚類(lèi)在另一個(gè)分支，8個(gè)廣東分離物與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 SLCCNV 8個(gè)廣東分離物與其他24個(gè)分離物的DNA-B序列相似性

表3 8個(gè)廣東分離物ORF位點(diǎn)

Pu：南瓜Pumpkin；Wx：冬瓜Wax gourd；Mu：甜瓜Muskmelon；Cu：葫蘆Cucurbits；Ch：佛手瓜chayote；Ja：茉莉Jasmine；Ss：西葫蘆Summer squash；Wm：白瓜white melon

SLCCNV DNA-B組分親緣關(guān)系分析顯示，8個(gè)廣東分離物DNA-B與來(lái)自我國(guó)不同地區(qū)及越南和泰國(guó)等11個(gè)SLCCNV分離物親緣關(guān)系較近，聚類(lèi)在一個(gè)分支；進(jìn)一步與印度8個(gè)分離物和巴基斯坦2個(gè)分離物形成一個(gè)大的分支；而2個(gè)菲律賓分離物和1個(gè)印度尼西亞分離物與上述分離物的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)（圖6）。

Pu：南瓜Pumpkin；Wx：冬瓜Wax gourd；Mu：甜瓜Muskmelon；Cu：葫蘆Cucurbits；Ja：茉莉Jasmine；Ss：西葫蘆Summer squash；Wm：白瓜white melon；Bg：苦瓜Bitter gourd；Ts：筍瓜True squash

2.3 HYNG-01分離物的致病性測(cè)定

將構(gòu)建的SLCCNV分離物HYNG-01的侵染性克隆按照pGreenⅡ0229-2.0A+pGreenⅡ0229-2.0B（1﹕1）處理注射接種南瓜子葉。結(jié)果顯示，15 dpi時(shí)，接種的9株南瓜中有3株上部葉片出現(xiàn)了明顯的皺縮、卷曲癥狀；30 dpi時(shí)，癥狀更加明顯（圖7-A）。利用檢測(cè)DNA-A的引物AV494/CoPR和DNA-B的引物F1/R1對(duì)接種植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，兩對(duì)引物均能從顯癥植株總DNA擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異片段，而健康對(duì)照植株未擴(kuò)增出任何條帶（圖7-B）；進(jìn)一步Western blot結(jié)果顯示，顯癥植株中可以檢測(cè)到CP條帶，而健康對(duì)照植株中沒(méi)有檢測(cè)到條帶（圖7-C）。這些結(jié)果說(shuō)明，顯癥植株中確實(shí)存在SLCCNV。

A：HYNG接種南瓜上的癥狀及健康對(duì)照植株 Symptoms of pumpkin infected by isolate HYNG and healthy plant。Mock：未接種對(duì)照植株 Control plant without inoculation。右圖為白色方框放大圖 The right figure is magnification of the white frame。B：接種植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果 PCR detection of inoculated plants。C：Western blot檢測(cè)結(jié)果Result of western blot detection。Mock：未接種對(duì)照植株 Control plant without inoculation。M：Protein marker

3 討論

本文應(yīng)用RCA擴(kuò)增及基因克隆方法，從采集于廣東多地葫蘆科作物感染煙粉虱傳雙生病毒的病樣中克隆獲得8個(gè)雙生病毒分離物基因組全序列，該基因組為雙組分，其中DNA-A組分序列間相似性在94.9%以上，DNA-B組分序列間相似性86.7%—99.8%，而8個(gè)廣東分離物的DNA-A組分與已報(bào)道的SLCCNV各分離物序列相似性均在88%以上。根據(jù)國(guó)際雙生病毒科分類(lèi)方案[33]，從廣東葫蘆科作物分離獲得的8個(gè)病毒分離物均屬于SLCCNV。

SLCCNV為雙生病毒科菜豆金色黃花葉病毒屬成員。該屬病毒是雙生病毒科中種類(lèi)最多、分布最廣、危害最重的一個(gè)屬，主要通過(guò)煙粉虱傳播，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，嚴(yán)重威脅番茄、辣椒、木薯、南瓜、甘薯、番木瓜等多種重要經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)安全。早在1994年，洪益國(guó)等[1]在廣西南寧市南瓜表現(xiàn)曲葉病植株上檢測(cè)到煙粉虱傳雙生病毒，并鑒定出該病毒為SLCCNV，是雙生病毒科一個(gè)新種。隨著煙粉虱在我國(guó)大范圍的發(fā)生和擴(kuò)散，也導(dǎo)致SLCCNV在我國(guó)廣西、河南、海南等地葫蘆科作物上流行，并造成較大經(jīng)濟(jì)損失。本文對(duì)危害廣東省葫蘆科作物的煙粉虱傳雙生病毒進(jìn)行分子鑒定，明確該病毒是SLCCNV，并證明了該病毒是引起廣東南瓜曲葉病的病原，這是首次在廣東發(fā)現(xiàn)SLCCNV。

關(guān)于危害廣東葫蘆科作物的SLCCNV來(lái)源，目前GenBank上的SLCCNV基因組全序列有24個(gè)，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，來(lái)自中國(guó)、越南、泰國(guó)、菲律賓、印度尼西亞的分離物聚類(lèi)在一個(gè)分支，組成東亞-東南亞組；而來(lái)自印度分離物聚類(lèi)在另一個(gè)分支，組成南亞組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，來(lái)自廣東HYNG、HZNG、HZDG、FSNG、FSBG、XWNG這6個(gè)分離物與河南、海南、越南、泰國(guó)等地的SLCCNV分離物親緣關(guān)系較近，而分離物L(fēng)ZNG、HZHL與廣西分離物親緣關(guān)系較近。由此推測(cè)，侵染廣東葫蘆科作物的SLCCNV可能有兩個(gè)來(lái)源，一是海南或越南、泰國(guó)，二是廣西；傳入途徑主要是通過(guò)調(diào)運(yùn)葫蘆科作物種苗及其攜帶的煙粉虱帶毒傳入。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆接種技術(shù)是研究雙生病毒致病性的有效手段，被研究者普遍采用。本研究利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了SLCCNV廣東河源南瓜分離物的侵染性克隆，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆注射接種蜜本3號(hào)南瓜子葉，明確了SLCCNV廣東河源南瓜分離物DNA-A和DNA-B組分共同侵染南瓜時(shí)可以引起與田間癥狀相同的南瓜曲葉病，從而證實(shí)了廣東南瓜曲葉病是由雙組分病毒SLCCNV侵染所引起的病害。除南瓜病樣外，本研究也從冬瓜、葫蘆、白瓜3種葫蘆科作物中檢測(cè)出SLCCNV，SLCCNV對(duì)冬瓜、葫蘆、白瓜以及其他葫蘆科作物的致病性如何，還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

SLCCNV首次發(fā)現(xiàn)于中國(guó)廣西，除我國(guó)海南、云南、河南外，在越南、印度、菲律賓、泰國(guó)、巴基斯坦、印度尼西亞等多國(guó)多地也已發(fā)生，報(bào)道的自然寄主有南瓜、葫蘆、冬瓜、黃瓜、甜瓜、哈密瓜等多種葫蘆科作物。2020年，趙麗玲等[22]在云南的非葫蘆科作物水茄上檢測(cè)到該病毒。本研究也首次在白瓜上檢測(cè)到SLCCNV?？梢?jiàn)，SLCCNV地理分布和寄主范圍正在不斷擴(kuò)大，危害越來(lái)越重。SLCCNV主要靠煙粉虱帶毒近距離傳播和帶毒種苗調(diào)運(yùn)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，對(duì)未發(fā)生區(qū)域應(yīng)加強(qiáng)檢疫，確保種植無(wú)毒種苗，從源頭控制該病毒的危害；同時(shí)，生產(chǎn)上盡可能選擇抗病品種，控制田間煙粉虱的發(fā)生，以有效地控制該病毒的發(fā)生與流行。

廣東種植有南瓜、冬瓜、節(jié)瓜、黃瓜、絲瓜、葫蘆等多種葫蘆科作物，病毒病是制約葫蘆科作物正常生產(chǎn)的重要因子之一，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)其相關(guān)病原病毒開(kāi)展了研究，李正剛等[34]明確了侵染廣東連州葫蘆的黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）的分子特征以及其致病性；LI等[35]利用小RNA深度測(cè)序技術(shù)鑒定出侵染廣東葫蘆科作物的有來(lái)源10個(gè)不同屬的17種病毒，其中來(lái)自雙生病毒科菜豆金色黃花葉病毒屬的病毒僅有SLCCNV一種。本文采用RCA擴(kuò)增及基因克隆方法，從廣東葫蘆科病樣中僅鑒定出SLCCNV，這一結(jié)果與LI等[35]的研究結(jié)果一致。雖然目前危害廣東葫蘆科作物的菜豆金色黃花葉病毒屬病毒僅有SLCCNV，但廣東地區(qū)存在其他多種菜豆金色黃花葉病毒屬病毒，加上煙粉虱發(fā)生極為普遍，也容易導(dǎo)致其他病毒種類(lèi)危害葫蘆科作物。因此，極有必要后續(xù)繼續(xù)對(duì)危害廣東省葫蘆科作物的菜豆金色黃花葉病毒屬病毒種類(lèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，及時(shí)了解病毒種類(lèi)動(dòng)態(tài)變化。

4 結(jié)論

中國(guó)南瓜曲葉病毒（SLCCNV）侵染廣東南瓜、葫蘆、冬瓜、白瓜等葫蘆科作物，是廣東南瓜曲葉病的病原，危害廣東葫蘆科作物的SLCCNV可能來(lái)自廣西、海南等地，也可能來(lái)自與廣東農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易頻繁的越南、泰國(guó)等國(guó)家。

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Molecular Characteristic of Squash leaf curl China virus (SLCCNV) Infecting Cucurbitaceae Crops in Guangdong province

ZHANG Li, TANG YaFei, LI ZhengGang, YU lin, LAN GuoBing, SHE XiaoMan, HE ZiFu

Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640

【】Squash leaf curl China virus (SLCCNV) is one of the main viruses infecting Cucurbitaceae crops, which can infect pumpkin, cucurbits, wax gourd, cucumber, muskmelon and honeydew melon, andseverely affect Cucurbitaceaecrop production. The objective of this study is to investigate the molecular characteristics,genetic relationship and pathogenicity of SLCCNV Guangdong isolates, and to provide a theoretical basis for the prevention and control of SLCCNV.【】Fifty-three suspected samples infected bywere collected from Leizhou City and Xuwen county of Zhanjiang City, Boluo County of Huizhou city, Yuancheng district of Heyuan City and Gaoming district of Foshan city, Guangdong province.Total DNA was extracted from all suspected samples, respectively, and used as template for PCR amplification with degenerate begomovirus primers AV494/CoPR. The full-length DNA-A sequence of each isolate was obtained by RCA amplification, gene cloning and sequencing from positive samples by PCR detection. The full-length DNA-B sequence of each isolate was obtained by PCR amplification using designed abutting primers. All full-length sequences of SLCCNV obtained from Guangdong Province were analyzed with BLAST in NCBI. The similarity was compared using Muscle alignment of SDT1.2 software. Phylogenetic analysis between SLCCNV Guangdong isolates and the other SLCCNV isolates was performed using MEGA7. Infectious clone of SLCCNV isolate HYNG was constructed using homologous recombination technology. The infectious clone was inoculated to the cotyledon of pumpkin plants by agro-inoculation.【】The PCR detection result showed that 52 out of 53 suspected samples were infected by. The full-length sequences of eight isolates of SLCCNV from Guangdong province were obtained from pumpkin, cucurbits, wax gourd and white melon, respectively. The full DNA-A sequences of eight isolates ranged from 2 735 to 2 739 nt in size, contained six ORFs, which were identical to the reported SLCCNV. The full DNA-B sequences of eight Guangdong isolates of SLCCNV ranged from 2 701 to 2 721 nt in size, contained two ORFs, encoding proteins associated with viral movement BC1 and BV1,respectively. The similarity analysis of the full sequence showed that the DNA-A of eight isolates from Guangdong shared ＞94.9% nt identities with each other, and shared ＞88% nt identities with other isolates of SLCCNV in GenBank database, and the DNA-B of eight isolates from Guangdong shared ＞86.7% nt identities with each other, and shared ＞83% nt identities with isolates of SLCCNV in GenBank database. Phylogenetic analysis indicated that the eight Guangdong isolates clustered with SLCCNV isolates from Guangxi, Henan, Hainan of China, Vietnam, Thailand, Philippines, Indonesia to form one branch, and the isolates from India clustered to form the other branch. Pathogenicity results showed that the new leaves of pumpkin inoculated with infectious clones of SLCCNV displayed crimple symptoms at 15 days post-inoculation (dpi), and more severe symptoms at 30 dpi. SLCCNV could be detected by PCR from the symptomatic plants, western blot detection further verified the above results.【】SLCCNV was detected infecting Cucurbitaceae crops in Guangdong province. The SLCCNV is the pathogen causing pumpkin curl leaf disease in Guangdong province. The SLCCNV isolates from Guangdong are closely related to isolates from Guangxi, Hainan etc., belonging to the same branch, while it is more distantly related to isolates from India.

squash leaf curl China virus (SLCCNV); Guangdong province; molecular characteristic; infectious clone; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.006

2021-03-01；

2021-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（32072392）、廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2020KJ110，2020KJ134）、廣州市科技計(jì)劃（201904010173）、科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)資金（高水平農(nóng)科院建設(shè)）（R2019PY-JX005）

張麗，E-mail：1587650114@qq.com。湯亞飛，E-mail：yf.tang1314@163.com。張麗和湯亞飛為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者何自福，Tel：020-87597476；E-mail：hezf@gdppri.com。通信作者佘小漫，Tel：020-87597476；E-mail：lizer126@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）