李騰騰， 王紫薇， 任鵬， 藍(lán)天一， 邵艷卿， 方軍*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 溫州市海洋生物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國水產(chǎn)科學(xué)研究院海洋貝類工程技術(shù)研究中心，浙江 溫州 325005； 2.寧波大學(xué)，浙江 寧波 315211)

近年來，我國貝類、蝦類等養(yǎng)殖快速發(fā)展，苗種需求旺盛。2017年我國蝦類育苗量為12 518億尾，比2016年(10 752億尾)同比增長16.42%，其中南美白對蝦2017年為9 552億尾，比2016年(8 028億尾)同比增長18.97%；2017年貝類育苗量248 406億粒，比2016年同比增加4%[1]。蝦類和貝類育苗過程中的關(guān)鍵因素是水質(zhì)和餌料[2]，而水質(zhì)受地理環(huán)境、氣候變化和經(jīng)濟(jì)活動等的影響，人為調(diào)控能力較弱，因此，餌料微藻的選擇及培養(yǎng)關(guān)系著蝦、貝苗種繁育和養(yǎng)殖生產(chǎn)。

微藻幾乎是貝類幼苗唯一的餌料選擇[3]，影響著貝類的營養(yǎng)、生理和繁殖[4]。微藻是體形微小(2～30 μm)、能進(jìn)行光合作用的低等植物的總稱，具有可利用光能、生長繁殖快、對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)和易培養(yǎng)等特點(diǎn)[5]。常見的餌料微藻約有20多個屬、40多個種，包括硅藻、金藻和綠藻等種類，除應(yīng)用在貝類和蝦類的育苗過程外，還廣泛應(yīng)用于浮游動物如輪蟲、橈足類等的培養(yǎng)[6]。不同種類的微藻有著不同的適宜培養(yǎng)條件，目前國內(nèi)外關(guān)于環(huán)境因素對微藻生長影響的研究很多[7-10]，但大多停留在試驗(yàn)室階段，生產(chǎn)培養(yǎng)相關(guān)方面的研究鮮有報道。

本試驗(yàn)選取威氏海鏈藻9021(Thalassiosiraweissflogii)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、湛江叉鞭金藻(Dicrateriazhanjiangensis)以及亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)4種生產(chǎn)培養(yǎng)上較為常見的餌料微藻進(jìn)行二級擴(kuò)大性培養(yǎng)，探究培養(yǎng)水體溫度和外界光照強(qiáng)度對餌料微藻繁殖生長的影響，以期為浙江沿海地區(qū)蝦、貝等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物的人工育苗提供餌料微藻培養(yǎng)的堅實(shí)依據(jù)，為不同季節(jié)、梅雨、高溫、臺風(fēng)等惡劣天氣條件下微藻種類選擇及培養(yǎng)策略提供技術(shù)性指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用藻種威氏海鏈藻9021株系由寧波大學(xué)海洋學(xué)院提供，牟氏角毛藻、湛江叉鞭金藻和亞心形扁藻株系由浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所清江試驗(yàn)基地藻種庫提供。

1.2 培養(yǎng)方法與條件

培養(yǎng)液母液配置按“寧波大學(xué)3號”配方配置，NaNO3100 g，K2HPO410 g，F(xiàn)eSO4250 mg，MnSO425 mg，Na2EDTA 10 g，VB10.6 mg，VB125 μg，海水1 000 mL。

試驗(yàn)所用海水為二級沙濾海水，經(jīng)10 g·m-3漂白粉清洗并暗處理至少24 h進(jìn)行消毒。接種前加入3 g·m-3的Na2S2O3并充分曝氣，使用余氯試劑盒檢測水體中余氯殘留，待水體中有效氯完全中和后接種。試驗(yàn)使用容器為50 L塑料桶，先用高錳酸鉀溶液消毒，再經(jīng)消毒水沖洗2～3次干燥后備用，尼龍薄膜和充氣管煮沸高溫消毒。

在50 L塑料白桶中加入30 L已完全中和的消毒海水，并加入50 mL培養(yǎng)液母液，取處于對數(shù)生長期的藻種接種，同時設(shè)置3個平行組，并測定微藻的起始培養(yǎng)濃度。然后用透明尼龍薄膜封口，自然光照下，充氣一次性培養(yǎng)，每天使用溫度計和照度計監(jiān)測水溫與光照強(qiáng)度變化，及時調(diào)節(jié)溫度(通過移位至陰涼通風(fēng)處或用加熱棒升溫)和光照強(qiáng)度(通過調(diào)節(jié)遮陰網(wǎng)以達(dá)到試驗(yàn)要求)。

1.3 溫度試驗(yàn)

設(shè)置5個溫度梯度：17～20 ℃、20～23 ℃、23～26 ℃、26～29 ℃、29～32 ℃。光照強(qiáng)度為10 000～20 000 lx，海水鹽度為18‰，pH為8.1～8.3。

1.4 光照試驗(yàn)

光強(qiáng)過高會造成微藻的死亡，結(jié)合浙江當(dāng)?shù)亟涤昵闆r(陰雨天實(shí)際光照強(qiáng)度為980～10 180 lx，晴天實(shí)際光照強(qiáng)度為9 700～76 600 lx)，通過調(diào)節(jié)遮陰網(wǎng)的密度將光照調(diào)控在20 000 lx左右，將光照分為兩個梯度，陰天為1 000～10 000 lx，晴天為10 000～20 000 lx，水體溫度26～29 ℃，海水鹽度為18‰，pH為8.1～8.3。

1.5 溫度和光照的正交試驗(yàn)

對威氏海鏈藻9021株以及湛江叉鞭金藻進(jìn)行正交試驗(yàn)。設(shè)置5個溫度梯度(17～20 ℃、20～23 ℃、23～26 ℃、26～29 ℃、29～32 ℃)和兩個光照強(qiáng)度(1 000～10 000 lx和10 000～20 000 lx)的正交試驗(yàn)，海水鹽度為18‰，pH為8.1～8.3。

1.6 比生長率的計算

每天固定上午10:00取樣，用Lugol碘液固定，在顯微鏡下使用血球計數(shù)板計數(shù)并計算生物量，每個樣品計數(shù)3次，取平均值。通過公式μ=(1nXt-lnX0)·t-1計算比生長率，其中X0指初始藻類細(xì)胞數(shù)量，Xt指td后藻類細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對微藻生長的影響

不同溫度條件下4種餌料微藻的生長曲線如圖1所示。4種餌料微藻的生長周期和最大生物量均隨溫度的變化而變化，4種餌料微藻自接種第2天生物量均有顯著增長，達(dá)到最大生物量后維持幾天，之后迅速進(jìn)入衰敗期。微藻與其他水生生物一樣，對水環(huán)境的溫度有一定的適應(yīng)性，過高或過低的溫度均會抑制微藻的生長，水體溫度過高甚至?xí)斐晌⒃宓难杆偎劳?。有些研究者認(rèn)為對于光合自養(yǎng)生物而言，當(dāng)超出適宜溫度范圍時，溫度主要是通過控制物質(zhì)與能量代謝過程中酶的動力學(xué)來影響其生長，此外，超出適溫范圍的溫度對于微藻的傷害作用可能是由于出現(xiàn)了不同程度的質(zhì)壁分離[11]。

圖例溫度條件后無相同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。

從本試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，溫度對4種餌料微藻的生長有顯著影響。湛江叉鞭金藻在17～29 ℃均可正常生長，溫度高于29 ℃時，盡管比生長率獲得最大值，但其生長明顯受到抑制；牟氏角毛藻在17～32 ℃時可正常生長，因此屬于廣溫種，在26～32 ℃能快速到達(dá)平臺期，在17～26 ℃時生長則受到一定程度的抑制；威氏海鏈藻9021在17～32 ℃均可正常生長，同樣為廣溫種，在高溫和低溫下均能快速生長；亞心形扁藻在17～26 ℃能快速生長且具有較高的最大生物量，高于26 ℃時生長則受到一定程度的限制，當(dāng)溫度高于29 ℃時生長明顯受到抑制。

2.2 光照強(qiáng)度對微藻生長的影響

光照是微藻生長必不可少的，但過高的光照會對藻細(xì)胞造成一定程度的傷害，過低的光照則很大程度上抑制藻細(xì)胞的生長。不同光照強(qiáng)度下4種餌料微藻的生長曲線如圖2所示。結(jié)果表明：光照強(qiáng)度對4種餌料微藻生長有顯著影響。隨著光照強(qiáng)度的增加，牟氏角毛藻、湛江叉鞭金藻和亞心形扁藻的最大生物量均有所增加，且比生長速率有顯著差異。有研究表明：光照強(qiáng)度越高，細(xì)胞分裂越快，生物量越大[12]。而威氏海鏈藻9021呈現(xiàn)出相反的現(xiàn)象，在陰天情況下生長要優(yōu)于晴天。

圖例光照條件后無相同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.3 溫度和光照的正交試驗(yàn)

湛江叉鞭金藻在1、8、9、10等3組條件下有較大比生長速率，但由于其生物量受到嚴(yán)重的抑制，達(dá)不到實(shí)際生產(chǎn)過程中的需求，因此，我們認(rèn)為26～29 ℃、10 000～20 000 lx是湛江叉鞭金藻大規(guī)模培養(yǎng)的適宜條件，此時比生長速率為0.396(表1、圖3)。

表1 正交試驗(yàn)中湛江叉鞭金藻的比生長率

圖3 湛江叉鞭金藻的最大生物量

威氏海鏈藻在溫度26～29 ℃、光照強(qiáng)度1 000～10 000 lx試驗(yàn)組生長狀況最好，比生長速率最大(μ為0.291)(表2、圖4)，據(jù)此我們可以認(rèn)為這是威氏海鏈藻9021的適宜培養(yǎng)條件。

表2 正交試驗(yàn)中威氏海鏈藻9021的比生長率

圖4 威氏海鏈藻9021最大生物量

3 討論

3.1 溫度對微藻生長的影響

溫度是影響微藻生長和繁殖的重要環(huán)境因子之一，微藻對溫度的耐受能力因種類不同而存在巨大差異，各種藻類對溫度的要求不同，有其各自的適應(yīng)范圍[13]。主要通過影響微藻細(xì)胞生理活動的活性和其對水體營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，這兩種影響方式并存，是共同作用又相互競爭的關(guān)系[14]。申哲民等[15]研究表明，年均氣溫每增加1.0 ℃，年均藻類生物量會增加0.145倍，且水體富營養(yǎng)化程度越顯著，溫度升高對藻類生長的影響越大。從本試驗(yàn)的結(jié)果來看，雖然生產(chǎn)性培養(yǎng)的餌料微藻有些為廣溫性藻類，但生產(chǎn)中需要快速、高效地提供高濃度的藻液。因此，盡管有部分試驗(yàn)結(jié)果表明在29～32 ℃條件下湛江叉邊金藻具有很高的比生長率，但達(dá)不到大規(guī)模培養(yǎng)所需要的生物量，因此，該條件并不是大規(guī)模生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)條件。本研究發(fā)現(xiàn)，在26～29 ℃，10 000 lx～20 000 lx條件下湛江叉鞭金藻獲得較大的比生長速率，同時具有較高的最大生物量，為大規(guī)模培養(yǎng)的最佳條件。春秋季的水溫為17～26 ℃，適宜于大規(guī)模培養(yǎng)湛江叉鞭金藻、威氏海鏈藻9021以及亞心形扁藻作為水產(chǎn)苗種的餌料，牟氏角毛藻少量培養(yǎng)搭配使用。夏季高溫期水溫為26～32 ℃，適宜大規(guī)模培養(yǎng)威氏海鏈藻9021和牟氏角毛藻作為苗種的餌料。這與陳貞奮[16]關(guān)于牟氏角毛藻的研究結(jié)果相同，湛江叉鞭金藻可作為開口餌料小規(guī)模少量培養(yǎng)。

3.2 光照強(qiáng)度對微藻生長的影響

光照是單細(xì)胞藻培養(yǎng)中最重要的影響因子之一，浮游植物需要通過光合作用制造有機(jī)物維持自身生長、繁殖。浮游藻類生產(chǎn)量的季節(jié)變化與光照條件的季節(jié)差異有著直接關(guān)系，水生藻類光合作用的強(qiáng)弱，取決于透入水中的光照強(qiáng)度和光質(zhì)[17]。對于光能自養(yǎng)的浮游植物而言，光能是一個不斷變化的資源；很多種類浮游植物都表現(xiàn)出對光照相同的生理適應(yīng)，即其生長速率隨著光照強(qiáng)度從零到某一個適宜光照強(qiáng)度的增加而相應(yīng)地增加[18]。本試驗(yàn)中湛江叉鞭金藻、牟氏角毛藻和亞心形扁藻在強(qiáng)光條件下(10 000～20 000 lx)的比生長率均明顯大于弱光條件(1 000～10 000 lx)，而威氏海鏈藻9021在弱光條件下的比生長率明顯大于強(qiáng)光條件，故為喜陰種，但最大生物量較高光組低，可能是由于隨著生物量的增加，水體透光性降低，藻細(xì)胞對光的利用降低，減緩了細(xì)胞分裂[19]，從而抑制了生長。因此，威氏海鏈藻9021是一種在弱光條件下比較容易培養(yǎng)的餌料微藻，在江浙地區(qū)梅雨季節(jié)，連續(xù)陰雨天無法提供充足光照的條件下可以很好地替代角毛藻作為水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)苗種中后期培育的餌料。

綜上所述，溫度和光照的變化會影響?zhàn)D料微藻的比生長率和最大生物量，在適宜的溫度、光照條件下培養(yǎng)合適的餌料微藻可以極大程度上加快餌料微藻的提供效率，從而減輕餌料供應(yīng)不足的壓力。據(jù)統(tǒng)計，浙江沿海一帶春季陰冷多雨，平均溫度維持在13～18 ℃，夏季為梅雨季，降水量充足，氣溫25～30 ℃；秋季氣溫變化較大，氣溫16～21 ℃，降雨量較少；冬季晴冷少雨，氣候較干燥，氣溫3～9 ℃。因此，在了解不同餌料微藻的適宜培養(yǎng)環(huán)境的情況下，關(guān)注水體溫度和光照變化，提前做好準(zhǔn)備工作，可以有效防止餌料供應(yīng)出現(xiàn)斷層。