周婧琪， 陳磊， 田薇*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311300； 2.象鼻山香(杭州)生物科技有限公司，浙江 杭州 310030)

玄參為玄參科植物玄參的干燥根，具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)的功效[1]。目前玄參在我國(guó)分布很廣，浙江磐安為其道地產(chǎn)區(qū)[2]。玄參在栽培過(guò)程中極易感染多種病害，包括葉斑病，白絹病等，目前防治手段主要為化學(xué)防治[3-6]。研究揭示野菊多糖抗誘劑(CIP)可以降低白術(shù)的病情指數(shù)，對(duì)白術(shù)土傳病害防控具有顯著功效[7-8]。但CIP是否可作為綠色防治手段增強(qiáng)玄參抗病性及其產(chǎn)量尚不清楚。本研究采取盆栽試驗(yàn)探討CIP對(duì)玄參的誘導(dǎo)促生作用，通過(guò)對(duì)玄參生理指標(biāo)、病情指數(shù)的變化情況統(tǒng)計(jì)分析，探究CIP對(duì)玄參生長(zhǎng)期的生物性狀及抗病性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)基地在浙江農(nóng)林大學(xué)平山農(nóng)場(chǎng)溫室大棚，試驗(yàn)中所用的玄參種苗采購(gòu)于浙江省磐安縣新渥鎮(zhèn)，為當(dāng)年生種苗。種苗采用生根粉浸種處理；CIP由實(shí)驗(yàn)室前期制備。瓊脂粉、無(wú)水葡萄糖、95%乙醇、甲醇、冰醋酸、香蘭素均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。SR真菌為美國(guó)菌種保藏中心 ATCC 15205。

1.2 處理設(shè)計(jì)

1.2.1 制備CIP

CIP[9]由實(shí)驗(yàn)室前期制備，稱取20 g的CIP加水定容至1 000 mL，配成20 mg·mL-1的溶液。

1.2.2 制備菌絲懸浮液

參考文獻(xiàn)[10]。

培養(yǎng)白絹菌。稱取200 g去皮干凈土豆切塊于1 000 mL蒸餾水中煮沸約20 min或煮至土豆變軟，之后用4層紗布過(guò)濾，移去濾渣得濾液，同時(shí)分別稱取10 g無(wú)水葡萄糖、20 g瓊脂，將濾液、無(wú)水葡萄糖和瓊脂混合煮沸至無(wú)水葡萄糖和瓊脂完全溶解，得培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液、培養(yǎng)皿等置高壓滅菌鍋中滅菌20 min，分裝倒入培養(yǎng)皿中制PDA培養(yǎng)基，繼而進(jìn)行接菌，于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d即得菌絲體。

制備菌絲懸浮液。將1個(gè)培養(yǎng)皿的菌絲全部刮下，用20 mL的去離子水溶解，制成菌絲懸浮液。

1.2.3 盆栽試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在浙江農(nóng)林大學(xué)平山農(nóng)場(chǎng)溫室中進(jìn)行，采用常規(guī)盆栽育苗。玄參種植時(shí)隨機(jī)選苗、稱重，種植前浸于生根液中30 s。盆栽實(shí)驗(yàn)分成4個(gè)組，每組10個(gè)重復(fù)，發(fā)芽后試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理。(1)噴20 mg·mL-1的CIP(CIP)；(2)噴20 mg·mL-1的CIP和菌絲懸浮液(C+S)；(3)噴菌絲懸浮液0.05培養(yǎng)皿·mL-1(SR)；(4)噴清水(CK)。共4組處理，每處理重復(fù)10次。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

分別調(diào)查各組玄參的株高、葉片數(shù)、葉面積及病情指數(shù)，從2021年4月28日開始統(tǒng)計(jì)，調(diào)查時(shí)間為出苗后的2個(gè)月內(nèi)，20 d統(tǒng)計(jì)1次。收獲時(shí)測(cè)定各組玄參地上部分鮮重、塊根增長(zhǎng)量、皂苷含量及多糖含量。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)[11]。0級(jí)為無(wú)病葉，無(wú)死亡；1級(jí)為1/3的葉片枯萎，變黃；2級(jí)為2/3的葉片枯萎，變黃；3級(jí)為葉片全部枯萎；4級(jí)為出現(xiàn)死株。

玄參皂苷測(cè)定。參考文獻(xiàn)[12]。將玄參用蒸餾水洗凈后放烘箱50 ℃干燥至恒重，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)0.38 mm篩，稱取0.2 g玄參粉，加入40%乙醇6 mL、60 ℃超聲提取45 min后，過(guò)濾，得到玄參皂苷提取液。吸取皂苷提取液0.5 mL于蒸發(fā)皿中揮干溶劑，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶，即為樣品的皂苷測(cè)試液。取測(cè)試液2.0 mL置于10 mL具塞試管中，于沸水浴中揮干溶劑，加入5%香草醛·冰醋酸溶液0.2 mL，振蕩搖勻，再加入60%硫酸5.0 mL，混勻后于60 ℃水浴保溫20 min，取出冷卻后，以相同體積甲醇為空白對(duì)照，于560 nm測(cè)吸光度。

玄參多糖測(cè)定。參考文獻(xiàn)[12]。將提取皂苷的玄參殘?jiān)湃牒嫦洌?0 ℃烘干至恒重得到玄參渣，加入30%乙醇，料液比1∶30，采用80 ℃水浴110 min回流提取。將提取液減壓濃縮至1 mL，4 ℃靜置過(guò)夜，4 000 r·min-1離心10 min，取沉淀，用80%的乙醇洗滌沉淀之后，將沉淀用蒸餾水溶解，定容至10 mL，取其中1 mL，移入25 mL容量瓶中定容，再取其中1.0 mL放入10 mL具塞試管，加蒸餾水至2 mL，按照上述步驟于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值。

主成分分析方法。參考文獻(xiàn)[13]。主成分分析之前要對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)備化處理，株高增長(zhǎng)量、葉片數(shù)增長(zhǎng)量、葉面積增長(zhǎng)量、地上部分鮮重、塊根增長(zhǎng)量、多糖相對(duì)含量、皂苷相對(duì)含量屬于正向指標(biāo)。病情指數(shù)屬于逆向指標(biāo)，按公式對(duì)這幾類指標(biāo)采取不同方式的轉(zhuǎn)換，將值約束在0～1范圍內(nèi)。

正向指標(biāo)：r′ij=rij/rijmax；逆向指標(biāo)：r′ij=1-rij/rijmax。

其中，rij為評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)值，r′ij為評(píng)價(jià)指標(biāo)轉(zhuǎn)化值。

采用SPSS19.0軟件系統(tǒng)對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行主成分分析，依次計(jì)算協(xié)方差矩陣，協(xié)方差矩陣的特征根、特征向量、負(fù)荷量和主成分得分。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析分別用Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行基本計(jì)算和統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CIP對(duì)白絹菌的防效

如表1所示，CIP對(duì)玄參白絹病防治具有一定的效果。其中，C+S組的病情指數(shù)明顯低于其他各組，其次是CIP組，試驗(yàn)初期CIP的防效指數(shù)高達(dá)100%，最終CIP防效達(dá)80.0%。

表1 CIP對(duì)白絹病的防治效果

2.2 CIP對(duì)玄參生理指標(biāo)的影響

由表2可知，CIP明顯促進(jìn)葉片數(shù)、葉面積、地上部分鮮重、塊根的增長(zhǎng)，且CIP組的多糖和皂苷含量高于其他組。

表2 不同處理對(duì)玄參植株生理指標(biāo)的影響

2.3 主成分分析各組指標(biāo)

主成分分析標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果如表3所示。根據(jù)相關(guān)矩陣得到2個(gè)主成分，其特征值、貢獻(xiàn)率和累計(jì)貢獻(xiàn)率如表4所示，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到89.16%，第一主成分貢獻(xiàn)率達(dá)到74.29%，第二主成分貢獻(xiàn)率為14.87%。主成分得分系數(shù)矩陣如表5所示。

表3 標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果

表4 解釋的總方差

表5 主成分得分系數(shù)矩陣

提取方法：主成分分析法。

將特征向量與生理指標(biāo)帶入公式計(jì)算，各生理指標(biāo)與選取的2個(gè)主成分的關(guān)系通過(guò)以下公式計(jì)算。第一主成分：F1=0.618X1+0.99X2+0.984X3+0.756X4+0.926X5-0.546X6+0.997X7+0.943X8；第二主成分：F2=0.771X1+0.022X2+0.049X3-0.638X4-0.366X5-0.011X6+0.063X7+0.218X8；綜合評(píng)價(jià)：F=(0.742 8F1+0.148 6F2)/0.891 5。

綜合評(píng)價(jià)得分排名如表6所示，排名第一的是CIP組，其次是C+S組，排名最低的是CK。

表6 主成分分析綜合得分

3 小結(jié)與討論

在試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)中發(fā)現(xiàn)，CIP和C+S組玄參的病情指數(shù)都明顯低于CK和S組，這表明噴施CIP的處理組均具有較好的白絹病防治效果，可以增強(qiáng)植物本身的抗病性。本研究結(jié)果顯示，噴施CIP可顯著提高玄參的株高、葉片數(shù)、地上部分鮮重、塊根增長(zhǎng)量等指標(biāo)長(zhǎng)。通過(guò)主成分的綜合指標(biāo)分析，無(wú)論是CIP 組還是C+S組都明顯高于S組和CK組，這進(jìn)一步說(shuō)明CIP的促生長(zhǎng)作用。研究為實(shí)現(xiàn)玄參田間安全高效防治白絹病及增產(chǎn)提供了依據(jù)，也進(jìn)一步顯示CIP具有重要的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景。