喬春霞，王 晶，羅龍龍，馮健男

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850）

2019年12月暴發(fā)的新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）疫情目前正在全球大流行。2020年1月，該病毒被成功分離并測序［1-2］。2020年2月11日，國際病毒分類委員會(huì)將該病毒分類名定為SARSCoV-2。世界衛(wèi)生組織將由該病毒導(dǎo)致的疾病正式命名為新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）。由于該病毒潛伏期長，易突變且感染性強(qiáng)，加之缺乏醫(yī)療物資和規(guī)范的防護(hù)措施，一些國家和地區(qū)的感染病例和死亡人數(shù)仍居高位。目前開發(fā)的針對(duì)COVID-19的防治藥物主要包括疫苗、抗體和小分子藥物（蛋白酶抑制劑、病毒核苷類似物和病毒宿主融合抑制劑）等。其中，抗體具有安全性高、特異性強(qiáng)、療效顯著且不良反應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是治療COVID-19最具潛力的藥物之一。本文綜述SARS-CoV-2中和抗體的研究進(jìn)展，為SARS-CoV-2疫情防控提供參考。

1 SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)、致病機(jī)制和表位

1.1 SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)

SARS-CoV-2是一種單鏈RNA正鏈包膜β冠狀病毒，同家族成員還包括SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）。SARS-CoV-2與SARSCoV基因組序列的同源性約79.6%［1］。

SARS-CoV-2基因組編碼約16種非結(jié)構(gòu)蛋白、4種結(jié)構(gòu)蛋白和5～8種輔助蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白包括3胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶（3-chymotrypsin-like protease）、木瓜蛋白酶樣蛋白酶（papain-like protease）、解旋酶（helicase）和RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）；結(jié)構(gòu)蛋白包括突起蛋白（spike protein，S蛋白）、包膜蛋白（envelopeprotein，E蛋白）、膜蛋白（membraneprotein，M蛋白）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N蛋白），少數(shù)病毒還編碼血凝素酯酶（haemaglutinin-esterase，HE蛋白）。其中E蛋白和M蛋白與病毒裝配有關(guān)，S蛋白以三聚體形成突起，伸出包膜表面，使整個(gè)病毒外形如王冠狀。S蛋白在病毒的附著、融合、入胞和傳播中起著至關(guān)重要的作用，成為抗SARS-CoV-2藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。

1.2 致病機(jī)制

SARS-CoV-2疫情暴發(fā)之初，科學(xué)家通過計(jì)算機(jī)預(yù)測得出SARS-CoV-2與SARS-CoV結(jié)合相同的受體分子血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）。隨后，Wrapp等［3］測定結(jié)果表明，ACE2與SARS-CoV-2 S蛋白結(jié)合的親和力比其與SARS-CoV更強(qiáng)（約為后者的10～20倍），這也是SARS-CoV-2人際傳播能力較SARS-CoV強(qiáng)的重要分子基礎(chǔ)。SARS-CoV-2主要導(dǎo)致肺炎和呼吸道感染，發(fā)熱和咳嗽是主要的臨床癥狀，其他還包括呼吸急促、肌痛（肌肉酸痛）/疲勞、精神錯(cuò)亂、頭痛和喉嚨痛，甚至急性呼吸窘迫綜合征，導(dǎo)致肺或多器官功能衰竭［4］。對(duì)于患有糖尿病、高血壓或心血管疾病的老年患者來說，感染SARS-CoV-2可導(dǎo)致致命的呼吸道疾病。SARSCoV-2具有較強(qiáng)的人際傳播能力，致病性強(qiáng)，且其發(fā)病機(jī)制未被完全闡明，給疫情的防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)。因此，亟需開發(fā)有效的防治藥物。在研藥物中，與疫苗相比，抗體藥物具有安全性高、可感染后給藥等優(yōu)勢，成為抗SARS-CoV-2特效藥物的研發(fā)熱點(diǎn)。

SARS-CoV-2的S蛋白含1273個(gè)氨基酸，與SARS-CoV的S蛋白氨基酸序列同源性為76.5%［5-6］。在SARS-CoV-2的S蛋白的S1/S2交界處存在弗林蛋白酶（furin）裂解位點(diǎn)，這一位點(diǎn)的缺失可能會(huì)影響病毒感染細(xì)胞。在感染過程中，S蛋白被宿主蛋白酶切割成N端的S1亞基（受體結(jié)合區(qū)）和C端的S2亞基（細(xì)胞膜融合區(qū)），促進(jìn)病毒入侵。S1亞基又分為N端結(jié)構(gòu)域（N terminal domain，NTD）和受體結(jié)合域（receptor-binding domain，RBD）。此外，SARS-CoV-2還結(jié)合宿主細(xì)胞上CD147和TMPRSS2等多個(gè)受體。SARSCoV-2通過其S1亞基RBD區(qū)與宿主細(xì)胞上ACE2結(jié)合，觸發(fā)S2亞基的構(gòu)象變化，S2亞基中融合環(huán)的暴露誘導(dǎo)SARS-CoV-2包膜與宿主細(xì)胞膜融合并進(jìn)入靶細(xì)胞［7-10］。

3項(xiàng)獨(dú)立研究結(jié)果均顯示，ACE2與SARSCoV-2 RBD結(jié)合的平衡解離常數(shù)（equilibrium dissociation constant，KD）分別為15.2，4.7 和1.2 nmol·L-1，均高于 SARS-CoV（KD分別為 31.0，15.2和5.0 nmol·L-1）［11-13］。晶體結(jié)構(gòu)顯示，該 2 種病毒RBD結(jié)構(gòu)高度相似，ACE2與SARS-CoV-2結(jié)合的親和力（KD約為15 nmol·L-1）比 SARS-CoV 高10～20倍［14］。SARS-CoV-2 RBD與ACE2結(jié)合的自由能明顯低于SARS-CoV，這可能是SARSCoV-2比SARS-CoV更具感染性的分子基礎(chǔ)［15］。

對(duì)SARS-CoV-2的S蛋白三聚體的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)一步闡明了其RBD識(shí)別人ACE2的分子機(jī)制。S蛋白存在閉合構(gòu)型和開放構(gòu)型2種構(gòu)象。閉合構(gòu)型時(shí)，3個(gè)RBD位于同一界面；開放構(gòu)型中，RBD之一向上旋轉(zhuǎn)并暴露與ACE2結(jié)合的位點(diǎn)。SARSCoV-2 RBD與ACE2接觸面積大于SARS-CoV，且SARS-CoV-2 RBD與ACE2存在更多的分子間氫鍵相互作用，涉及RBD的Q493和G496以及ACE2的K31，E35和 K353位點(diǎn)。同時(shí)，SARS-CoV-2 RBD的F486插入ACE2的疏水口袋中，使得復(fù)合物結(jié)構(gòu)比SARS-CoV 更緊湊［16］；ACE2中的 N90與 RBD 的R408形成分子間氫鍵，且與SARS-CoV相比，SARS-CoV-2含有四殘基基序（G-V-E-G482-485），使其結(jié)構(gòu)更加緊湊，并與ACE2的N端螺旋形成更好的接觸［17］。用X射線晶體學(xué)方法確定SARS-CoV-2 RBD-ACE2復(fù)合物（2.45 ?分辨率，1?=0.1 nm）的結(jié)構(gòu)顯示，RBD含有4對(duì)二硫鍵，其中3對(duì)位于核心（Cys336-Cys361，Cys379-Cys432和Cys391-Cys525），輔助穩(wěn)定β片層結(jié)構(gòu)；1對(duì)（Cys480-Cys488）連接RBD遠(yuǎn)端的環(huán)。SARS-CoV-2 RBD的17個(gè)殘基與ACE2的20個(gè)殘基作用，而SARS-CoV RBD有16個(gè)殘基與ACE2的20個(gè)殘基結(jié)合。2種RBD結(jié)合的ACE2殘基中有17個(gè)相同，且多數(shù)位于N端螺旋區(qū)；2個(gè)RBD之間則有8個(gè)殘基相同［11］。

1.3 S蛋白的免疫表位

抗體發(fā)揮中和效應(yīng)的強(qiáng)度與其所識(shí)別的功能表位密切相關(guān)。SARS-CoV-2的表位信息研究為靶向抗體等藥物的設(shè)計(jì)提供了有益參考［18］。利用新型預(yù)測工具Q-UEL［19］、反向疫苗學(xué)、免疫信息學(xué)和分子生物學(xué)等手段，可預(yù)測病毒結(jié)構(gòu)蛋白上T和B細(xì)胞表位信息，并驗(yàn)證確定保守的功能表位［20］。SARS-CoV-2的S蛋白含有25個(gè)B細(xì)胞表位（Ser438-Gln506，Thr553-Glu583，Gly404-Aps427，Thr345-Ala352和 Lys529-Lys535）和 40個(gè) T細(xì)胞表位（9個(gè)CD4+表位11個(gè)CD8+表位，其中RBD區(qū)7個(gè)CD4+表位和9個(gè)CD8+表位，尾部2個(gè)CD4+表位和2個(gè)CD8+表位），SARS-CoV-2 S蛋白結(jié)合CD4+T細(xì)胞的表位與SARS-CoV S 蛋白對(duì)應(yīng)［21］。Mukherjee等［22］從SARS-CoV-2的5個(gè)免疫原區(qū)鑒定出7個(gè)表位，與宿主細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）等位基因具有高度親和力，且能夠覆蓋世界人口，覆蓋率＞87%，可作為設(shè)計(jì)SARS-CoV-2疫苗的候選抗原。同時(shí)，Abdelmageed等［23］也預(yù)測了SARS-CoV-2的E蛋白中10個(gè)與MHCⅠ類或Ⅱ類分子結(jié)合的T細(xì)胞表位，覆蓋率分別為88.5%和99.99%。Khurana團(tuán)隊(duì)分析了SARS-CoV-2 S蛋白不同結(jié)構(gòu)域的免疫原性，證實(shí)RBD誘導(dǎo)中和抗體的免疫原性最好，而S2區(qū)誘導(dǎo)中和抗體的能力較弱［24］。除RBD外，SARS-CoV-2 S1區(qū)C端548～632位氨基酸也可良好誘導(dǎo)中和抗體，為疫苗設(shè)計(jì)及中和抗體研發(fā)提供了有益信息。同時(shí)，SARS-CoV-2 S蛋白的2個(gè)表位被COVID-19患者血清特異性識(shí)別，其中S21覆蓋了部分融合肽，在冠狀病毒家族中高度保守；S14位于RBD附近，進(jìn)一步截短的S14P5和S21P2肽分別與患者血清作用，血清陽性率顯著增高，提示COVID-19患者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)這2個(gè)表位的抗體概率較高，且針對(duì)這2個(gè)表位的血清抗體水平與血清中和SARS-CoV-2的能力顯著相關(guān)，表明S14P5和S21P2是抗體中和表位［25］。盡管SARS-CoV-2 S蛋白與SARS-CoV S蛋白具有很高的同源性，但新表位約占85%，推測SARS-CoV-2的抗原性發(fā)生了顯著變化。這可能是大多數(shù)針對(duì)SARS-CoV的抗體對(duì)SARS-CoV-2均無效的原因，這為SARS-CoV-2疫苗的研發(fā)提供了有益參考［26］。

2 SARS-CoV-2中和抗體

抗SARS-CoV-2抗體可以直接與SARS-CoV-2 S蛋白結(jié)合，阻斷SARS-CoV-2與宿主細(xì)胞ACE2結(jié)合，抑制SARS-CoV-2感染細(xì)胞，發(fā)揮中和效應(yīng)。疫情之初，有研究者認(rèn)為托西珠單抗〔tocilizumab，抗人白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）受體單抗〕可能會(huì)抑制SARS-CoV-2感染者疾病的發(fā)展［27］；抗CD147人源化抗體美珀珠單抗（meplazumab）能與S蛋白競爭結(jié)合CD147，可顯著抑制SARSCoV-2入侵細(xì)胞［28-29］；舒泰神公司的抗C5a抗體BDB-001可抑制炎癥反應(yīng)（于2020年4月進(jìn)入臨床試驗(yàn)）。同時(shí)，與治療SARS類似，使用COVID-19完全康復(fù)患者恢復(fù)期血漿可有效抵抗SARS-CoV-2［30］。為確診COVID-19患者輸注高滴度COVID-19康復(fù)者血漿，患者血清中和抗體滴度迅速增加，臨床癥狀改善［31-32］。目前，COVID-19患者恢復(fù)期血漿已成為臨床治療COVID-19的緊急使用藥品之一，也為SARS-CoV-2基因工程抗體的研發(fā)提供了支持。不過，康復(fù)者血漿中抗體效價(jià)并不穩(wěn)定，阻礙了血漿療法的大規(guī)模應(yīng)用，客觀上也對(duì)單抗的研發(fā)提出了迫切需求。

2.1 抗SARS-CoV抗體用于COVlD-19治療的嘗試

疫情初期，由于時(shí)間所限，研究者從SARS-CoV患者中和抗體入手，希望找到能夠同時(shí)識(shí)別并中和SARS-CoV和SARS-CoV-2的抗體［33］。然而，已知的幾種抗SARS-CoV單抗如S230，80R和m396等均不能結(jié)合SARS-CoV-2［11，14］。其中，單抗 S230 對(duì)SARS-CoV的中和機(jī)制為模仿受體結(jié)合和促進(jìn)S蛋白融合構(gòu)象的改變，80R和m396可阻斷RBD與ACE2的相互作用從而中和SARS-CoV［34］。晶體結(jié)構(gòu)顯示，抗體中和機(jī)制是直接阻斷受體結(jié)合。然而，SARS-CoV的RBD能被m396識(shí)別的21個(gè)表位殘基中有7個(gè)在SARS-CoV-2中不保守，80R識(shí)別的25個(gè)表位中16個(gè)不保守，這可能是該類抗體缺乏明顯的交叉保護(hù)性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［16］。

抗SARS-CoV單抗CR3022也能與SARSCoV-2的RBD高親和力結(jié)合，但在高達(dá)400 mg·L-1的濃度下仍不能中和SARS-CoV-2。3.1 ?分辨率的晶體結(jié)構(gòu)顯示，CR3022靶向SARS-CoV RBD上1個(gè)高度保守的表位，遠(yuǎn)離受體結(jié)合位點(diǎn)，使得該抗體可以交叉結(jié)合SARS-CoV-2［12］。同時(shí)，只有當(dāng)SARS-CoV-2三聚體S蛋白上至少有2個(gè)RBD打開處于“向上”構(gòu)象并輕微旋轉(zhuǎn)時(shí)，CR3022才能與SARS-CoV-2三聚體S蛋白結(jié)合［35］。該抗體識(shí)別SARS-CoV-2的28個(gè)表位殘基中，24個(gè)與SARS-CoV相同，但該抗體與SARS-CoV-2的親和力比SARSCoV低2個(gè)數(shù)量級(jí)（部分原因可能是SARS-CoV的N370糖基化形成了復(fù)合聚糖，增加了抗體接觸面積）［12，35-36］。即使該抗體識(shí)別的表位在這 2 種病毒中均保守，靜電表位計(jì)算結(jié)果也顯示，SARS-CoV-2的RBD蛋白與ACE2結(jié)合的親和力遠(yuǎn)高于SARSCoV。因此，針對(duì)SARS-CoV的能夠與ACE2競爭的抗體可能很難完全阻斷SARS-CoV-2的RBD與ACE2的相互作用［16，37］。

即使如此，部分抗SARS-CoV抗體也能顯示良好的中和SARS-CoV-2的效應(yīng)。人源抗SARS-CoV單抗S309能夠與SARS-CoV2 S蛋白的RBD結(jié)合，可中和SARS-CoV-2和SARS-CoV假病毒及SARS-CoV-2真病毒。冷凍電子顯微鏡結(jié)果顯示，S309識(shí)別了SARS-CoV病毒的1個(gè)包含聚糖的非受體結(jié)合表位，且該表位在病毒亞屬中是保守的。S309對(duì)SARS-CoV和SARS-CoV-2假病毒的中和效應(yīng)相近，S309 79 μg·L-1即可有效中和 SARSCoV-2 真病毒（2019n-CoV/USA_WA1/2020）［38］。在抗埃博拉病毒單抗研發(fā)過程中，從康復(fù)患者記憶B細(xì)胞庫中獲得的mAb114單抗可以顯著中和埃博拉病毒［39-40］。類似的，Wec等［41］從恢復(fù)期SARS患者記憶B細(xì)胞庫中鑒定出9個(gè)中和抗體，其中8個(gè)識(shí)別RBD，1個(gè)識(shí)別NTD。假病毒研究結(jié)果顯示，4個(gè)抗體識(shí)別的RBD表位與人ACE2（human ACE2，hACE2）和CR3022識(shí)別的RBD表位重疊，其他4個(gè)識(shí)別的RBD表位與hACE2表位重疊。體外中和實(shí)驗(yàn)表明，這些抗體對(duì)SARS-CoV的半數(shù)抑制濃度（IC50）為 0.05～1.40 mg·L-1，而對(duì) SARSCoV-2的IC50為0.004～0.060 mg·L-1。真病毒體系結(jié)果與此類似。其中，SARS-CoV單抗ADI-55689可能與hACE2競爭，似乎結(jié)合在hACE2結(jié)合位點(diǎn)的邊緣，靠近SARS-CoV RBD結(jié)構(gòu)更保守的核心結(jié)構(gòu)域。SARS-CoV單抗ADI-56046能夠競爭hACE2，與SARS-CoV RBD的柔性遠(yuǎn)端結(jié)合。Tai等［42］鑒定了6種與SARS-CoV-2 RBD存在交叉反應(yīng)的抗SARS-CoV抗體，其中18F3和7B11可中和SARS-CoV-2假病毒，10 mg·L-1時(shí)中和率均可達(dá)到80%。18F3識(shí)別SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD上保守的中和表位（D392和V394），與ACE2結(jié)合位點(diǎn)不重疊。而7B11識(shí)別SARS-CoV-2 RBD上不完全保守的表位（I428，A430和K439），接近ACE2結(jié)合位點(diǎn)，因此可以阻斷SARS-CoV-2 RBD與ACE2的結(jié)合。

然而更多情況下，從SARS-CoV感染的康復(fù)者血漿獲得的抗體能夠保護(hù)SARS-CoV-2感染的概率較小。如SARS-CoV感染康復(fù)者的7份血漿樣本中有5份可中和SARS-CoV，效價(jià)在1∶40～1∶320，但無1份可交叉中和SARS-CoV-2。同樣，15例SARS-CoV-2感染患者血漿只有1例可以交叉中和SARS-CoV，且效價(jià)很低（1∶10）［43］。提示SARSCoV與SARS-CoV-2的抗原表位并不完全相同，引起的免疫反應(yīng)也具有明顯差異。

2.2 抗SARS-CoV-2抗體研究

隨著對(duì)SARS-CoV-2研究的深入，單細(xì)胞測序和轉(zhuǎn)基因小鼠等技術(shù)被合理地用于篩選SARSCoV-2中和抗體［44］，特別是單細(xì)胞測序技術(shù)在抗SARS-CoV-2抗體研發(fā)中發(fā)揮了重要作用，陸續(xù)篩選得到眾多功能優(yōu)良的候選抗體。鑒于S蛋白的核心地位，目前開發(fā)的抗SARS-CoV-2抗體基本以SARS-CoV-2的S蛋白為靶點(diǎn)，且識(shí)別表位多位于RBD區(qū)，少數(shù)位于S2亞基或S1/S2蛋白水解位點(diǎn)。抗體來源包括康復(fù)者外周血、轉(zhuǎn)基因小鼠和噬菌體抗體庫等?？贵w種類主要包括多抗（血漿來源，如美國Sab Biotherapeutics開發(fā)的SAB-185，是利用轉(zhuǎn)基因牛研發(fā)的多抗）、單抗、抗體融合蛋白和單域抗體等，均取得了明顯進(jìn)展（表1）。其中進(jìn)展較快的品種為GSK公司的S309單抗及禮來公司的雙抗體雞尾酒療法，均已獲得了FDA的緊急使用授權(quán)［45-53］。

表1 用于治療新型冠狀病毒肺炎（COVlD-19）的部分中和抗體和類抗體融合蛋白（截至2021年6月20日）

2.2.1 單抗

ELISA結(jié)果顯示(圖3C)：APPsw質(zhì)粒對(duì)照組細(xì)胞外液Aβ1-42的表達(dá)水平較NC組明顯升高(P<0.05)，尼可地爾處理組明顯降低細(xì)胞外液Aβ1-42的分泌水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，尼可地爾+格列本脲處理組與質(zhì)粒對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.1.1 國外研究進(jìn)展

荷蘭烏得勒支大學(xué)的Wang等［54］用SARS-CoV-2 S蛋白免疫轉(zhuǎn)基因H2L2小鼠，獲得51株抗SARSCoV-2 S蛋白雜交瘤，其中47D11表現(xiàn)出對(duì)SARSCoV和SARS-CoV-2假病毒感染的交叉中和活性，IC50值均為 0.061 mg·L-1；在 SARS-CoV-2 真病毒感染細(xì)胞模型中，其IC50值分別為0.19和0.57 mg·L-1。47D11靶向RBD，與SARS-CoV和SARS-CoV-2結(jié)合的親和力接近（KD分別為16.1和9.6 nmol·L-1），EC50值分別為0.02和0.03 mg·L-1。47D11不能競爭ACE2受體與SARS-CoV-2 S蛋白的結(jié)合，但可抑制SARS-CoV-2形成融合必須的合胞體。47D11識(shí)別1個(gè)保守的表位，這是其具有交叉中和SARS-CoV和SARS-CoV-2的分子基礎(chǔ)。2020年12月，美國艾伯維公司（AbbVie）宣布將繼續(xù)推動(dòng)HBM9022（初名ABBV-47D11）的臨床開發(fā)。

多個(gè)團(tuán)隊(duì)宣布利用單細(xì)胞測序技術(shù)獲得了能夠良好抑制SARS-CoV-2的中和抗體。Rogers等［55］鑒定了3160個(gè)抗原結(jié)合陽性的B細(xì)胞，克隆和表達(dá)了2045個(gè)抗體。其中與RBD結(jié)合的抗體較少，但大部分能中和SARS-CoV-2假病毒。其中單抗CC12.19似乎與針對(duì)2個(gè)不同表位的抗體（RBDB和S-A）競爭，表明該單抗識(shí)別表位可能較寬，跨越了RBD-B和S-A表位。最有效的中和抗體是識(shí)別RBD-A表位的抗體，包括CC6.29和CC6.30，中和SARS-CoV-2的IC50為2.0和1.0 μg·L-1，提示表位RBD-A是誘導(dǎo)中和抗體的首選靶點(diǎn)，且單抗親和力增加中和能力相應(yīng)提高。倉鼠體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，倉鼠iv給予較高劑量RBD-A中和抗體（每只 125，500 或 2000 μg），其 SARS-CoV-2 載量較低；而iv給予S-B表位抗體，3個(gè)濃度均無保護(hù)作用。Gils團(tuán)隊(duì)鑒定了84個(gè)高親和力單抗，7個(gè)中和效應(yīng)良好（IC50為0.1～1.0 mg·L-1），靶向RBD的抗體COVA1-18和COVA2-15的中和效應(yīng)最佳（IC50分別為0.007和0.009 mg·L-1），它們可與ACE2競爭結(jié)合抗原。有趣的是，與抗RBD抗體相比，不識(shí)別RBD的抗體均具有更長的重鏈CDR3區(qū)［56］。同時(shí)，Sun等［57］用SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD分別免疫小鼠，檢測免疫小鼠血清與RBD的結(jié)合，并檢測了多株雜交瘤抗體對(duì)假病毒的中和效應(yīng)，從中篩選出抗SARS-CoV-2人源抗體HA001。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HA001能夠中和SARS-CoV-2，但未能識(shí)別SARS-CoV。同時(shí)，HA001識(shí)別表位包括A475，V483，F(xiàn)486和 S494，其中 A475和 F486更是RBD結(jié)合 HA001或hACE2的關(guān)鍵點(diǎn)。HA001通過競爭RBD與受體結(jié)合的關(guān)鍵殘基以中和SARS-CoV-2。Hansen等［44］經(jīng)單細(xì)胞分選、基因擴(kuò)增從SARS-CoV-2免疫人源化小鼠和COVID-19患者康復(fù)期外周血中獲得了200多個(gè)中和單抗。其中9種最有效的單抗中和效價(jià)為 7～99 μmol·L-1，均結(jié)合 SARS-CoV-2的RBD區(qū)，阻斷RBD與ACE2的相互作用。這些抗體與單體SARS-COV-2的RBD（KD為0.56～45.20 nmol·L-1）或二聚體 SARS-COV-2 的 RBD（KD為5.7～42.8 pmol·L-1）均能特異性結(jié)合。假病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其中多個(gè)抗體中和活性良好，比重組ACE2高1000倍。中和活性最好的4種單抗中和活性接近，彼此間無協(xié)同中和效應(yīng)。他們還從這4個(gè)抗體選擇了REGN10987和REGN10933組成雞尾酒抗體，以獲得最佳的抗病毒效應(yīng)，同時(shí)將病毒逃逸的概率降低。REGN10933 Fab區(qū)從頂部方向與RBD結(jié)合，靶向RBD上與ACE2作用界面的棘狀環(huán)區(qū)域，與ACE2的結(jié)合位點(diǎn)廣泛重疊。而REGN10987的結(jié)合表位遠(yuǎn)離REGN10933的結(jié)合表位，與ACE2結(jié)合位點(diǎn)幾乎無重疊。單粒子冷凍電鏡結(jié)果顯示，抗體REGN10987和REGN10933可同時(shí)結(jié)合SARS-CoV-2 RBD的不同區(qū)域。

基于以上工作，美國Regeneron公司推動(dòng)雞尾酒抗體REGN-COV2（含有REGN10987和REGN10933）進(jìn)入臨床試驗(yàn)。結(jié)果顯示，REGNCOV2能夠明顯降低COVID-19患者的病毒載量，安全性高［58］。此外，Seydoux等［59］從COVID-19患者血清中分離并制備了45株S蛋白特異性單抗，其中3株CV5，CV30和CV4可結(jié)合RBD。CV30功能最佳，可結(jié)合RBD并阻止RBD與ACE2結(jié)合?？贵wCV1不識(shí)別RBD，但可中和SARS-CoV-2。CV5和CV43與CR3022類似，識(shí)別表位遠(yuǎn)離ACE2結(jié)合位點(diǎn)。ACE2和CV30以相近的親和力（KD分別為4.4和3.6 nmol·L-1）結(jié)合 RBD，然而動(dòng)力學(xué)參數(shù)有明顯不同，ACE2與RBD的結(jié)合率和解離率均高于CV30。AZD7442（含COV2-2196和COV2-2130單抗）是從SARS-CoV-2感染患者恢復(fù)期外周血中篩到的2株長效單抗組合。母本抗體由美國范德比爾特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心發(fā)現(xiàn)，并于2020年6月授權(quán)給美國阿斯利康。美國阿斯利康采用其專有的半衰期延長技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，延長了半衰期，使得單次給藥療效可維持6～12個(gè)月。AZD7442獲得了美國政府的研發(fā)資助。在未接種疫苗的密接者中開展的研究結(jié)果顯示，與安慰劑對(duì)照組相比，AZD7442使出現(xiàn)COVID-19癥狀的風(fēng)險(xiǎn)降低了33%，但并未達(dá)到有效預(yù)防SARSCoV-2密接者感染的主要目標(biāo)。即使如此，該抗體有助于預(yù)防尚未感染的個(gè)體在接觸SARS-CoV-2后出現(xiàn)臨床癥狀［48］。

韓國Celltrion集團(tuán)也研發(fā)了可以識(shí)別SARSCoV-2 RBD的瑞丹維單抗（CT-P59）［60］，該抗體能夠顯著中和包括Alpha UK變體（B.1.17）在內(nèi)的SARS-CoV-2野生型和突變型病毒。在體內(nèi)模型中，CT-P59可有效降低雪貂、倉鼠和恒河猴SARSCoV-2載量，改善肺部炎癥。Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，CT-P59對(duì)輕中度COVID-19患者具有良好的安全性和耐受性，抗病毒效應(yīng)顯著［46］。2021年6月公布的全球Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，CT-P59 40 mg·kg-1在輕度至中度COVID-19患者中達(dá)到所有主要和關(guān)鍵次要終點(diǎn)（1315例）。與安慰劑相比，CT-P59將進(jìn)展為重癥COVID-19的患者第28天的住院或死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著降低72%，達(dá)到主要有效性終點(diǎn)〔3.1%vs11.1%〕。同時(shí)，CT-P59顯著降低全部患者的住院或死亡風(fēng)險(xiǎn)，降幅70%，達(dá)到第一個(gè)關(guān)鍵次要終點(diǎn)〔2.4%〕。美國Vir公司研發(fā)的2株單抗VIR-7831和VIR-7832對(duì)SARS-CoV-2 S蛋白具有高度親和力，既能阻斷SARS-CoV-2進(jìn)入健康細(xì)胞，又能清除被感染的細(xì)胞，且英國、南非、巴西和美國加州的變種病毒突變位點(diǎn)均與VIR-7831識(shí)別的高度保守的表位無重疊，因此VIR-7831對(duì)變種病毒也具有潛在的中和活性。美國GSK公司聯(lián)合美國Vir公司推動(dòng)VIR-7831的臨床研究，一項(xiàng)名為COMET-ICE（COVID-19 Monoclonal Antibody Efficacy Trial-Intent to Care Early）的Ⅲ期臨床有效性和安全性中期分析結(jié)果顯示，VIR-7831單藥治療具有高住院風(fēng)險(xiǎn)的成人COVID-19患者，能夠使患者住院或死亡風(fēng)險(xiǎn)減少85%（P=0.002），達(dá)到主要終點(diǎn)。隨即美國GSK公司和美國Vir公司向美國FDA遞交了VIR-7831的緊急使用授權(quán)（EUA）申請(qǐng)并獲得批準(zhǔn)，用于治療輕中度COVID-19患者［47］。

利用傳統(tǒng)的抗體庫技術(shù)，美國Sorrento公司從大容量抗體庫中篩到了12株中和抗體。2020年5月16日，該公司就宣布其中的1株抗體STI-1499能100%抑制SARS-CoV-2感染，4 d內(nèi)可清除病毒。隨即STI-1499獲得美國FDA批準(zhǔn)，在住院的COVID-19患者中進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)。隨后，該公司與美國Mount Sinai Health System合作開發(fā)了COVI-SHIELD，含有包括STI-1499在內(nèi)的3株抗體。這3株抗體能共同識(shí)別SARS-CoV-2 S蛋白的3個(gè)不同區(qū)域，發(fā)揮中和活性。2020年10月30日，美國Sorrento Therapeutics公司向?qū)W術(shù)論文在線快速發(fā)布平臺(tái)bioRxiv上傳了一項(xiàng)研究結(jié)果，證實(shí)STI-2020單抗在倉鼠體內(nèi)經(jīng)鼻內(nèi)或靜脈給藥的陽性結(jié)果［60］。STI-2020與多種抗藥性SARS-CoV-2突變株均表現(xiàn)出相似的高親和力。2020年12月，美國Sorrento公司宣布，美國FDA已接受STI-2020（COVI-AMG）的研究性新藥申請(qǐng)（investigational new drug），將評(píng)估健康志愿者和癥狀較輕的門診COVID-19患者單次注射STI-2020的安全性、藥動(dòng)學(xué)和療效。

2.2.1.2 國內(nèi)研究進(jìn)展

2020年6月，君實(shí)生物和中國科學(xué)院微生物研究所聯(lián)合宣布，JS016已經(jīng)在復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)的首例健康志愿者給藥。這是中國第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的SARS-CoV-2中和抗體。JS016也是利用單細(xì)胞測序技術(shù)從COVID-19康復(fù)者外周血分離得到的抗體，是繼美國Lilly公司和美國AbCellera公司聯(lián)合開發(fā)的中和抗體巴尼韋單抗（bamlanivimab）（又名LY-CoV555），進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)后在全球第2個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的SARS-CoV-2中和抗體。值得一提的是，LY-CoV555抗體也是從COVID-19康復(fù)者外周血中分離的，已經(jīng)完成了Ⅲ期臨床試驗(yàn)，但是由于無證據(jù)證實(shí)LY-CoV555能夠改善COVID-19患者的臨床癥狀，該研究一度暫停。但美國Lilly公司并未放棄這一抗體，他們聯(lián)合君實(shí)生物，推出了埃特司韋單抗（etesevimab）（JS016或LY-CoV016）及巴尼韋單抗聯(lián)用的雙抗體療法［50］，于2021年2月已獲得美國FDA緊急使用授權(quán)用于COVID-19的治療。

2.2.2 抗體融合蛋白和小分子抗體

2.2.2.1 抗體融合蛋白

ACE2是腎素-血管緊張素（angiotensin，Ang）系統(tǒng)的重要組成部分。在該系統(tǒng)中，腎素-Ang原首先被腎素轉(zhuǎn)化為AngⅠ，然后在ACE2的作用下將AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ。ACE2下調(diào)AngⅠ和AngⅡ的水平，后者可與AngⅡ的Ⅰ型受體結(jié)合并引起某些類型的肺損傷，主要是肺動(dòng)脈高壓、肺纖維化和急性肺損傷［15］。將hACE2胞外區(qū)與人IgG1的Fc區(qū)域融合獲得的重組蛋白在體外可中和SARS-CoV假病毒或SARS-CoV-2假病毒，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明其具有良好的中和活性?？扇苄詇ACE2還能減少SARS-CoV-2載量，并在感染早期抑制血管和人腎器官中的SARS-CoV-2感染，提示外源性ACE2可以阻斷SARS-CoV-2的早期入侵［61］。臨床在研藥物GSK2586881即ACE2-Fc融合蛋白，體外可通過結(jié)合SARS-CoV的S蛋白競爭性阻斷該病毒與真核細(xì)胞的結(jié)合，有效中和SARS-CoV，IC50為 2 nmol·L-1。ACE2-Fc 也可以阻斷 SARSCoV-2與ACE2的結(jié)合，阻止SARS-CoV-2感染細(xì)胞，同時(shí)ACE2-Fc還保留了自身獨(dú)特的酶催化功能，舒張血管、降低血壓的同時(shí)保護(hù)肺組織，無形中增加了對(duì)COVID-19患者產(chǎn)生積極治療作用的可能性［62］。SI-F019是中國SystImmune公司在疫情暴發(fā)初期啟動(dòng)研發(fā)的雙價(jià)hACE2-Fc融合蛋白，可以作為誘餌蛋白競爭結(jié)合病毒，具有廣義強(qiáng)中和活性，且可改善COVID-19患者的肺部呼吸窘迫癥狀。2020年9月，該公司宣布該品種正處于研究性新藥申請(qǐng)階段，即將申報(bào)臨床，并預(yù)期在當(dāng)年底在中國和美國開展臨床試驗(yàn)。美國Sorrento公司也研發(fā)了一個(gè)ACE2融合蛋白STI-4398/COVIDTRAP，在低濃度下能夠完全抑制SARS-CoV-2感染非洲綠猴腎上皮細(xì)胞（VERO/E6）。早在2020年6月，該公司就宣布STI-4398獲得了美國FDA的臨床試驗(yàn)指導(dǎo)，用于COVID-19患者治療和預(yù)防性使用。

2.2.2.2 小分子抗體

單域抗體僅包含重鏈可變區(qū)（variable region of heavy chain，VH），分子質(zhì)量約為15 ku，制備相對(duì)容易，價(jià)格經(jīng)濟(jì)，穩(wěn)定性高，組織穿透性強(qiáng)，是近年來抗體分子研究的熱點(diǎn)。單域抗體可以用于高效檢測，而且具有作為中和抗體進(jìn)行疾病防治的潛力。Sun等［63］基于人單抗重鏈可變區(qū)骨架IGHV3-30開發(fā)了單域抗體，37℃下穩(wěn)定，且聚集＜1%。VH ab6和m397只結(jié)合SARS-CoV-2 S蛋白，與ACE2競爭結(jié)合RBD。為延長體內(nèi)半衰期和潛在的中和活性，ab6和m397與人Fc融合表達(dá)，對(duì)SARS-CoV-2真病毒顯示了很強(qiáng)的抑制活性，IC50值分別為 0.35 和 1.5 mg·L-1；同時(shí)，SARS-CoV S蛋白S2亞基的1個(gè)片段（1029～1192位氨基酸）在SARS-CoV-2中高度保守，而在MERS-CoV和引起人類常見感冒的冠狀病毒中不存在。Zheng等［64］篩選到4株針對(duì)這種片段的小鼠單抗，可識(shí)別細(xì)胞表面表達(dá)的SARS-CoV-2 S蛋白，其中最好的是mab1a9（表位位于1111～1130位氨基酸），具有結(jié)合和交叉中和人SARS-CoV、果子貍SARS-CoV和bat-SL-CoV假病毒的潛能。進(jìn)一步的配伍實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mab1a9與CR3022（識(shí)別SARS-CoV S1亞基的單抗）配對(duì)，可檢測出低至15.6 μg·L-1的SARS-CoV-2 S蛋白，提示這2株抗體可用于開發(fā)SARS-CoV-2檢測試劑盒。

英國Ossianix公司擁有VNAR抗體庫，正在開發(fā)抗SARS-CoV-2納米抗體。相比而言，瑞士Molecular Partners研發(fā)的基于骨架蛋白DARPin的三價(jià)蛋白MP0423和MP0420進(jìn)展似乎更快。MP0423能夠同時(shí)識(shí)別S蛋白的RBD、S1 N端和S2，發(fā)揮明顯的病毒抑制功能。DARPin類蛋白分子小，組織滲透性強(qiáng)，可同時(shí)作用于6個(gè)不同的靶點(diǎn)，免疫原性低，生產(chǎn)簡單。瑞士Novatis公司于2020年10月參與了這2個(gè)品種的應(yīng)用開發(fā)，Molecular Partners公司負(fù)責(zé)2個(gè)候選產(chǎn)品的Ⅰ期臨床試驗(yàn)和MP0423的所有非臨床工作。Novatis則承諾負(fù)責(zé)Ⅱ和Ⅲ期臨床試驗(yàn)。在MP0420的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，23名健康志愿者均表現(xiàn)出良好的耐受性。2021年5月，Novatis宣布啟動(dòng)新型DARPin蛋白療法ensovibep（MP0420）全球多中心Ⅱ/Ⅲ期臨床研究EMPATHY，在處于感染早期的COVID-19患者中開展療效評(píng)估，計(jì)劃入組2100例患者，初步結(jié)果預(yù)計(jì)在2021年8月獲得。EMPATHY的結(jié)果如顯示抗體的良好療效，將為Novatis通過美國FDA的緊急使用授權(quán)鋪平道路。與此同時(shí)，Molecular Partners繼續(xù)推動(dòng)MP0423的非臨床研究。

3 結(jié)語

目前SARS-CoV-2正處于全球大流行階段，全球有數(shù)十個(gè)疫苗產(chǎn)品陸續(xù)被批準(zhǔn)用于人體預(yù)防免疫，抗體藥物中也出現(xiàn)了被授權(quán)緊急使用的品種。然而，隨著疫苗接種的大規(guī)模開展，其不良反應(yīng)也日益凸顯，包括高熱、頭痛、肌痛、局部紅腫和疲倦等，甚至對(duì)心腦血管和生殖系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。另外，疫苗接種后產(chǎn)生抗體的比例因人而異（50%～90%），抗體滴度和中和強(qiáng)度均不穩(wěn)定；且從理論上推測，個(gè)別接種者甚至可能出現(xiàn)感染SARS-CoV-2后病情反而加重的現(xiàn)象，類似單抗的抗體依賴性增強(qiáng)（antibody dependent enhancement，ADE）效應(yīng)。因此，可同時(shí)發(fā)揮防治功能的中和抗體藥物的開發(fā)顯得尤為重要。在抗體研發(fā)過程中，要充分考慮避免表位逃逸、規(guī)避ADE效應(yīng)、降低不良反應(yīng)、提高抗體功能等原則，適當(dāng)采用制備抗體雞尾酒乃至重組多克隆抗體等策略［65］。此外，改造抗體恒定區(qū)以提高體內(nèi)藥效、藥代特性也值得探索。相信對(duì)SARS-CoV-2中和抗體的研究將有助于SARSCoV-2感染的防控，為COVID-19治療提供決定性的技術(shù)和產(chǎn)品支持。