劉嫦娥,岳敏慧,譚輝林,張 悅,張維蘭,肖艷蘭,潘 瑛,段昌群

納米零價鐵(nZVI,nano-zero-valent iron)是一種高氧化還原活性金屬,由于其高還原活性和優(yōu)越的吸附性能可快速去除環(huán)境中重金屬離子、鹵代有機物及其他無機陰離子等多種污染物[1],對持久性有機污染物也有很好的去除效果[2],在環(huán)境污染修復(fù)中具有不可比擬的優(yōu)勢。但其產(chǎn)生的環(huán)境效應(yīng)和生態(tài)影響尚不明確[3],尤其缺乏綜合系統(tǒng)研究,需要進(jìn)一步探討其環(huán)境安全性。由于對納米粒子在環(huán)境中的行為和最終存在形態(tài)的研究有限[4],因此對生態(tài)系統(tǒng)尤其是土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響難以預(yù)測。目前,多數(shù)研究采用nZVI對受試對象的毒性效應(yīng)來確定其對自然界中多種生物體和大環(huán)境的影響; 只有少數(shù)研究調(diào)查了nZVI對土壤動物的影響,發(fā)現(xiàn)其毒性和濃度呈正相關(guān)。研究表明,nZVI對細(xì)菌[5-6]、魚(Oryzias latipes)[7]、浮游植物(Isochrysis galbana)和水蚤(Daphnia magna)[8]均有影響,但nZVI對土壤生態(tài)系統(tǒng)的毒性研究較少。Chen等[9]研究了nZVI 對土壤理化性質(zhì)包括pH、陽離子交換容量、溶解性有機質(zhì)等的影響,但少見nZVI 與土壤組分相互作用及其效應(yīng)的系統(tǒng)闡述[10]。蚯蚓作為大型土壤動物在土壤中廣泛分布,不僅可通過自身活動改善土壤團粒結(jié)構(gòu)與質(zhì)量,還作為土壤的指示生物對土壤生態(tài)系統(tǒng)發(fā)揮重要作用[11],在一定程度上nZVI對蚯蚓的毒性效應(yīng)可以指示nZVI對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響。目前關(guān)于nZVI對蚯蚓-微生物-土壤生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)影響需綜合、系統(tǒng)地展開研究。

因此,本研究構(gòu)建室內(nèi)模擬試驗,研究nZVI對蚯蚓、土壤微生物及土壤質(zhì)量的影響,進(jìn)一步探討其對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響,為nZVI應(yīng)用于土壤污染修復(fù)的潛在風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

自制圓柱狀PVC管作為試驗裝置,管內(nèi)徑13 cm,高12 cm,上端開口。供試土壤采于云南省昆明市云南大學(xué)多年無污染廢棄地(24°49＇N、102°51＇E)0～10 cm土層紅壤,采集地海拔1980 m; 商用腐殖土購于云南圣比科技有限公司。將紅壤和商用腐殖土按照質(zhì)量比2∶1混合均勻得到試驗土壤。試驗土壤大團聚體、小團聚體和黏土質(zhì)量占比分別為3%、77%和20%,鎘、有機質(zhì)、全氮、堿解氮、全磷和速效磷含量分別為0 g·kg-1、96.59 g·kg-1、2.74 g·kg-1、342.34 mg·kg-1、1.18 g·kg-1和 434.32 mg·kg-1。

供試nZVI選用粒徑為 50～70 nm 的nZVI顆粒,具有核-殼結(jié)構(gòu),即核心為立方結(jié)構(gòu)的單質(zhì)鐵,表面包裹一層鐵氧化物,兼具還原和吸附的性能,購于北京德科島金科技有限公司,型號為DK-Fe-001。

供試蚯蚓選用評估土壤污染物毒性的模式動物且具有廣泛敏感反應(yīng)的國際標(biāo)準(zhǔn)蚓種赤子愛勝蚓(Eisenia foetida),系寡毛綱(Oligochaeta)后孔寡毛目(Opisthopora)正蚓科(Lumbricidae)愛勝蚓屬,食碎屑類表棲型蚯蚓,購于云南圣比科技有限公司。試驗前選擇大小一致(300～500 mg)、性成熟的蚯蚓置于供試土壤馴化1周,清腸處理24 h后,用蒸餾水清洗體表后,添加至試驗裝置中。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

在PVC裝置中加入500 g的試驗土壤,加入去離子水,土壤含水率保持45%,穩(wěn)定28 d后風(fēng)干; 投加nZVI攪拌均勻,設(shè)置nZVI為0、0.05%、0.25%和0.50% 4個含量處理,再次加入去離子水,使其含水率保持45%,之后投加蚯蚓,設(shè)每桶0和5條2個處理,共計8個處理。裝置上端用紗網(wǎng)封口,防止蚯蚓逃逸及外來物干擾,每組處理設(shè)12個平行; 分別在第15 d(3個)、第30 d(3個)和第45 d(6個)進(jìn)行分批收樣,測定第15 d、30 d、45 d蚯蚓存活率、生物量及抗氧化酶活性等及第45 d的土壤團聚體穩(wěn)定性、土壤理化指標(biāo)性質(zhì)及土壤微生物多樣性。

1.2.2 測定指標(biāo)與方法

蚯蚓生物量(鮮重)減少量采用重量法測定,生物量減少量=試驗開始蚯蚓生物量-試驗結(jié)束時蚯蚓生物量。蚯蚓酶活的測定方法:用蒸餾水清洗蚯蚓體表5次,吸水紙吸干蚯蚓體表水分,稱取0.1 g蚯蚓,依據(jù)生物試劑盒說明書按比例加入提取液,用研磨槍研磨,按照說明書進(jìn)行離心,將樣品置于4 ℃低溫保存待測。蚯蚓體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醇(MDA)和脯氨酸(Pro)均采用生物試劑盒進(jìn)行測定,試劑盒購買于上海優(yōu)選生物科技有限公司。

土壤理化指標(biāo)測定方法:采用重鉻酸鉀氧化外加熱法(GB 9834-88)、硫酸-高氯酸消煮法(GB 9837-1988)、凱氏定氮法(HJ 717-2014)、堿解擴散吸收法(GB 7849-1987)、雙酸浸提-鉬銻抗比色法(GB 1229-1990)、電位法(HJ 962-2018)分別測定土壤有機質(zhì)、全磷、全氮、堿解氮、速效磷含量和pH。

土壤團聚體穩(wěn)定性:采用團聚體尺寸分布(aggregate size distribution,ASD)和平均重量直徑(mean weight diameter,MWD)指標(biāo)來評價[12]。具體方法為:采用濕篩法對土壤水穩(wěn)性團聚體進(jìn)行篩分,將風(fēng)干土壤樣品浸入蒸餾水5 min,使土壤樣品快速崩解,然后2 min內(nèi)以3 cm幅度手動上下震動篩子50 次,篩分為大團聚體(＞250 μm)、小團聚體(53～250 μm)和黏土、泥沙(＜53 μm)3種組分。之后用蒸餾水將土壤篩中的各組分全部洗入容器中,自然風(fēng)干,稱重并計算不同團聚體比例。團聚體尺寸分布(ASD)和平均重量直徑(MWD)計算公式如下:

式中:W為土壤團聚體總質(zhì)量,Wi為i尺寸團聚體質(zhì)量。

式中:Xi為i尺寸團聚體平均直徑。

土壤微生物:隨機選取6個裝置中3個裝置,用高溫滅菌的鑰匙取土壤樣品,裝在高溫滅菌的離心管中,-20 ℃低溫保存,待檢測。從樣本中提取基因組DNA后,擴增16S rDNA的V3-V4區(qū)。引物序列為:338F(5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3＇)和806R(5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇),擴增子長度約460 bp。PCR擴增產(chǎn)物切膠回收,用Quanti-FluorTM熒光計進(jìn)行定量。將純化的擴增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合,連接測序接頭,構(gòu)建測序文庫,Hiseq 2500 PE250上機測序,并使用Illumina MiSeq高通量測序平臺對其進(jìn)行雙末端(Paired-End)測序。DNA的提取和測序委托廣東基迪奧公司完成。本文采用生物多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))和豐富度指數(shù)(Ace指數(shù)、Chao指數(shù))、細(xì)菌相對豐度來評價nZVI對土壤細(xì)菌生物多樣性與群落構(gòu)成情況的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

本研究試驗數(shù)據(jù)使用EXCEL、SPSS進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布和齊次性要求。其中,平均值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用皮爾遜相關(guān)性分析并進(jìn)行雙尾檢驗、單因素重復(fù)測量方差分析、雙因素重復(fù)測量方差分析和Duncan檢驗法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 nZVI對蚯蚓毒性效應(yīng)的影響

2.1.1 對蚯蚓存活率和生物量的影響

nZVI對蚯蚓的存活率不存在顯著性影響(圖1a);暴露15 d和45 d,除添加0.05% nZVI處理蚯蚓存活率(均為93.33%)變化不顯著外,其他處理蚯蚓存活率隨著暴露時間的延長而下降,暴露15 d,0和0.25%nZVI處理中蚯蚓存活率相同,均由93.33%顯著降低為45 d的66.67%,但0.50% nZVI處理蚯蚓存活率由93.33%降為66.67%,但差異不顯著?？梢?nZVI不是導(dǎo)致蚯蚓存活率下降的主要原因,蚯蚓存活率下降可能與暴露時間有關(guān),蚯蚓進(jìn)入新的生境可能需要付出適應(yīng)代價。

如圖1b所示,同一nZVI濃度下,暴露時間顯著影響蚯蚓生物量減少量,整體呈隨暴露時間增長生物量減少量增大的趨勢。但是,相同暴露時間下不同nZVI濃度對蚯蚓生物量減少量無顯著影響。15 d時,0和0.25% nZVI處理中蚯蚓生物量減少量小于0.05%和0.50% nZVI處理; 45 d時,0.50% nZVI處理中生物量減少量最大,平均為0.9514 g,但與其他處理組并無顯著差異。

2.1.2 對蚯蚓生理的影響

如圖所示2a,在不同暴露階段,0.50%、0.05%和0.25% nZVI處理蚯蚓體內(nèi)SOD活性無顯著性差異; 但是對照處理中,暴露時間顯著影響蚯蚓體內(nèi)SOD活性(P＜0.05); 15 d時,對照處理中蚯蚓體內(nèi)SOD活性最低,為48.986 U·g-1,0.50%、0.05%和0.25% nZVI處理蚯蚓體內(nèi)SOD活性顯著高于對照處理; 30 d時,0.50%、0.05%和0.25% nZVI處理中蚯蚓體內(nèi)SOD活性與15 d相比顯著降低,而對照處理蚯蚓體內(nèi)SOD活性升高,但此時不同處理之間無顯著性差異; 45 d時,nZVI濃度影響蚯蚓體內(nèi)SOD活性,0.50% nZVI處理蚯蚓體內(nèi)SOD活性最高,為147.117 U·g-1,顯著高于0.25% nZVI處理(P＜0.05)。

由圖2b所示,蚯蚓暴露在不同濃度nZVI下,體內(nèi)CAT活性隨暴露時間基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。0.25%和0.50% nZVI處理中,暴露時間顯著影響蚯蚓體內(nèi)CAT活性(P＜0.05); 30 d和45 d時,nZVI的濃度顯著影響蚯蚓體內(nèi)CAT活性(P＜0.05)。15 d和45 d,0.25% nZVI處理中蚯蚓體內(nèi)CAT活性均最高,分別為132.513 U·g-1和280.3167 U·g-1。0.50%nZVI處理蚯蚓體內(nèi)CAT活性隨暴露時間呈現(xiàn)急劇升高后迅速下降趨勢,30 d蚯蚓體內(nèi)CAT活性最高,為379.702 U·g-1。

如圖2c和2d所示,相同暴露時間下,nZVI濃度對蚯蚓體內(nèi)MDA和Pro含量無顯著影響。對照處理中15 d蚯蚓體內(nèi)MDA含量顯著低于45 d(P＜0.05),在處理時間內(nèi)各處理蚯蚓體內(nèi)MDA含量差異不顯著。相同nZVI濃度下,蚯蚓體內(nèi)Pro含量整體呈先降低后升高趨勢,但差異均不顯著。

本研究通過暴露45 d蚯蚓相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)分析(表1)。從表1可以看出,蚯蚓存活率與生物量減少量呈顯著負(fù)相關(guān),與其他指標(biāo)不相關(guān)。從本相關(guān)分析可以看出,隨著蚯蚓存活率增加,生物量減少量顯著降低,也就是說,蚯蚓生物量隨著存活率增加而顯著增大。

表1 納米零價鐵(nZVI)暴露45 d后蚯蚓指標(biāo)間的相關(guān)分析(R值)Table 1 Correlation analysis of earthworm indicators after 45 days of exposure to nano-zero-valent iron(nZVI)(R value)

2.2 nZVI對土壤微生物的影響

基于OUT水平的Sobs指數(shù)和Good-coverage指數(shù)的結(jié)果構(gòu)建稀釋曲線表明,各樣本的Sobs指數(shù)隨測序深度的加深逐漸趨于平緩,nZVI和蚯蚓對Goodcoverage指數(shù)不存在顯著影響,所有處理組Goodcoverage指數(shù)均大于88%,從而說明樣本測序所得數(shù)據(jù)合理,N50指示的tag測序長度可覆蓋土壤中V3-V4區(qū)域中的細(xì)菌,具有可靠性。

蚯蚓和nZVI對土壤細(xì)菌豐度與多樣性的影響如表2所示。蚯蚓和nZVI濃度不會顯著影響土壤中微生物多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))和豐度指數(shù)(Ace指數(shù)、Chao指數(shù))。無蚯蚓介導(dǎo)下，土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐度指數(shù)與nZVI處理濃度無關(guān),其中0.50% nZVI處理中,土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐度指數(shù)均為最大值,與對照相比差異不顯著; 蚯蚓介導(dǎo)下,0.05% nZVI處理中,土壤微生物豐度指數(shù)高于其他處理,Ace指數(shù)和Chao指數(shù)分別為3242.72和3197.37,與對照差異不顯著?？梢?試驗各處理nZVI對土壤-蚯蚓生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物組成、多樣性和豐度不產(chǎn)生負(fù)面影響,不會破壞土壤中微生物的生態(tài)。

表2 不同添加量納米零價鐵(nZVI)和蚯蚓對土壤細(xì)菌豐度和多樣性的影響Table 2 Effects of nano-zero-valent iron(nZVI)on abundance and diversity of soil bacteria(16S rRNA gene)(97% similarity level)

對試驗第45 d的土壤樣品通過高通量測序?qū)?6S r DNA V3-V4區(qū)土壤細(xì)菌進(jìn)行分析,總結(jié)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征,結(jié)果如圖3所示。在門水平下土壤中超過99%的細(xì)菌均已分類,主要包括浮霉菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、Pates-cibacteria、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、其他菌門和非分類菌門。其中浮霉菌門、變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門為主要的優(yōu)勢菌門。不同處理中土壤微生物組成相同,但是每個菌門所占比例和豐度略存差異。nZVI和蚯蚓對綠彎菌門的相對豐度存在顯著影響(P＜0.05),對其他菌門相對豐度均無顯著影響,有無添加蚯蚓的高濃度nZVI處理均不會對土壤細(xì)菌門水平的相對豐度產(chǎn)生負(fù)面影響。

2.3 nZVI對土壤質(zhì)量的影響

2.3.1 對土壤團聚體的影響

nZVI對蚯蚓-土壤-微生物系統(tǒng)影響研究中,nZVI和蚯蚓活動對土壤團聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響如圖4所示。

從圖4A可見,蚯蚓活動和nZVI濃度會極顯著影響土壤大團聚體(d＞250 μm)質(zhì)量比(P＜0.01),并顯著影響小團聚體(53＜d＜250 μm)質(zhì)量比(P＜0.05); 添加蚯蚓未投加nZVI的土壤中,大團聚體質(zhì)量比最高,為44.00%; 在蚯蚓和nZVI復(fù)合處理中土壤大團聚體質(zhì)量比高于同濃度處理的單一添加nZVI處理,且不管復(fù)合處理還是單一處理,大團聚體質(zhì)量比隨nZVI濃度的升高呈現(xiàn)下降趨勢。 在蚯蚓和0.05%nZVI復(fù)合處理中,土壤中小團聚體質(zhì)量比最高,為38.34%; 單一的nZVI處理中,土壤小團聚體質(zhì)量比隨nZVI濃度升高而降低; 蚯蚓-nZVI復(fù)合處理中,高濃度的nZVI沒有促進(jìn)土壤中小團聚體的形成,0.50% nZVI處理中小團聚體質(zhì)量比為33.10%。然而,蚯蚓和nZVI對土壤黏土質(zhì)量比不存在顯著性影響(P=0.3),單一的nZVI處理中,土壤黏土質(zhì)量比隨nZVI濃度升高而增大,但是蚯蚓-nZVI復(fù)合處理中黏土質(zhì)量比不同處理間無顯著差異。

蚯蚓和nZVI對土壤團聚體平均重量直徑的影響如圖4B所示。蚯蚓介導(dǎo)下0.05%、0.25%和0.50%nZVI處理中土壤團聚體平均重量直徑分別為515.49、531.25 和536.38,顯著高于無蚯蚓的單一nZVI處理及空白處理(P＜0.001),蚯蚓活動極顯著影響土壤團聚體平均重量直徑(P＜0.001)?？梢?蚯蚓和nZVI復(fù)合作用顯著提高了土壤團聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

2.3.2 對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

nZVI對蚯蚓-土壤-微生物生態(tài)系統(tǒng)影響研究中,nZVI和蚯蚓活動對土壤理化性質(zhì)的影響如表3所示。nZVI和蚯蚓會顯著影響土壤全氮含量和速效磷含量(P＜0.01),對土壤有機質(zhì)含量、堿解氮含量和全磷含量不存在顯著性影響。無論單一的nZVI處理還是蚯蚓-nZVI復(fù)合處理,土壤有機質(zhì)含量隨nZVI濃度的升高而逐漸減少,且蚯蚓和nZVI復(fù)合處理土壤有機質(zhì)含量低于與之對應(yīng)的單一nZVI處理; 其中空白處理土壤有機質(zhì)含量最高,為114.78 g·kg-1,蚯蚓介導(dǎo)下0.50% nZVI處理土壤有機質(zhì)含量最低,為88.29 g·kg-1。蚯蚓和nZVI復(fù)合處理土壤中全磷含量均低于與其對應(yīng)的單一nZVI處理; 單一nZVI處理中0.25% nZVI處理中土壤全磷含量最高,為1.45 g·kg-1; 蚯蚓和nZVI復(fù)合處理0 nZVI處理土壤全磷含量最高,為1.28 g·kg-1。蚯蚓和nZVI復(fù)合處理,土壤速效磷含量隨nZVI濃度的升高而呈現(xiàn)升高趨勢;蚯蚓介導(dǎo)下 0.50% nZVI處理土壤速效磷含量最高,為540.84 mg·kg-1,蚯蚓活動和高濃度nZVI有利于全磷向速效磷轉(zhuǎn)化。單一的nZVI處理中土壤全氮含量隨nZVI濃度的升高而逐漸升高,復(fù)合處理中呈現(xiàn)相反趨勢。無nZVI投加，有、無蚯蚓土壤堿解氮含量分別為392.92 mg·kg-1和395.68 mg·kg-1,高于nZVI各處理土壤堿解氮含量,高濃度nZVI抑制其他組分的氮轉(zhuǎn)化為堿解氮,蚯蚓活動和0.25% nZVI的復(fù)合作用會將這種抑制作用降到最低。

表3 納米零價鐵(nZVI)脅迫下蚯蚓活動對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響Table 3 Effects of earthworm activities on soil chemical properties under nano-zero-valent iron(nZVI)stress

nZVI和蚯蚓活動對土壤團聚體組成和化學(xué)指標(biāo)的雙因素分析結(jié)果如表4所示。nZVI極顯著影響土壤中大團聚體所占比例、小團聚體所占比例和堿解氮含量(P＜0.01); 蚯蚓活動極顯著影響土壤中大團聚體所占比例、小團聚體所占比例、全氮含量、速效磷含量和平均重量直徑; 蚯蚓和nZVI復(fù)合作用顯著影響土壤中大團聚體比例(P＜0.05)并對速效磷含量產(chǎn)生極顯著的影響(P＜0.01)。蚯蚓和nZVI復(fù)合作用不會造成土壤中碳、氮和磷的損失,對土壤中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性不會產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響。

表4 納米零價鐵(nZVI)脅迫下蚯蚓活動對土壤質(zhì)量的雙因素方差分析Table 4 Two factor analysis of variance of earthworm activity on soil quality under nano-zero-valent iron(nZVI)stress(P values)

3 討論

3.1 nZVI影響蚯蚓保護膜系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)能力

一般來說,外來物質(zhì)nZVI可能影響蚯蚓生存、生長、生理和行為等[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),蚯蚓在暴露期間出現(xiàn)死亡與生物量減少等情況,但存活率及生物量減少均與0.50% nZVI濃度(未投加蚯蚓)無顯著相關(guān),這表明nZVI賦予的應(yīng)激和毒性不同于其他金屬/類金屬,如As、Cu、Pb、Zn[15]或銀納米粒子[16],造成這種差異的原因可能是,鐵是土壤中的一種常見元素,也是所有生物所必需的元素。其他研究也表明,nZVI低于500 mg·kg-1時對粉正蚓(Lumbricus rubellus)和赤子愛勝蚓的趨避行為、體重變化和死亡率均無顯著影響; 低濃度nZVI污染組(100 mg·kg-1)幾乎沒有引起赤子愛勝蚓生殖、組織病理學(xué)和ANN的明顯變化[13]。但是,發(fā)現(xiàn)蚯蚓體組織鐵濃度的依賴性增加、脂質(zhì)過氧化和C-nZVI對DNA分子的損傷等產(chǎn)生不同效應(yīng); 且nZVI暴露濃度為60 mg·kg-1時誘發(fā)蚯蚓的氧化應(yīng)激和組織鐵濃度與DNA損傷有關(guān)[17-18]。

本研究表明,與暴露第15 d相比,第45 d蚯蚓體內(nèi)MDA含量和脯氨酸含量降低,CAT活性和SOD活性升高?？赡苁球球驹趎ZVI脅迫下,其保護膜系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)能力受到影響,包括抗氧化酶保護(SOD、CAT活性)、脂質(zhì)過氧化作用(MDA含量)與滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)(脯氨酸含量)可能發(fā)生改變。

盡管鐵是許多生物體內(nèi)酶催化活性的一種必需元素,但過量攝入也會產(chǎn)生嚴(yán)重后果,比如因活性氧(ROS)的形成引起的氧化損傷。從nZVI中釋放Fe2+是組織攝取和利用的基礎(chǔ)[19]。大量研究表明,nZVI在土壤中發(fā)生一系列的氧化還原反應(yīng)后以Fe2+的形式存在[20],Fe2+進(jìn)入生物體內(nèi)的細(xì)胞,刺激細(xì)胞產(chǎn)生的ROS和自由基(-OH)是破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜的主要機制[13,21],最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡并對生物體產(chǎn)生負(fù)面影響。同時,蚯蚓SOD、CAT活性和MDA含量的變化表明,nZVI可誘導(dǎo)赤子愛勝蚓產(chǎn)生氧化應(yīng)激[14]。蚯蚓體內(nèi)脯氨酸含量降低,表明在nZVI脅迫下蚯蚓機體受到了損傷,其滲透調(diào)節(jié)能力下降[22]。然而,隨著脅迫時間的延長,nZVI對蚯蚓的負(fù)面影響明顯減弱。主要原因是隨著反應(yīng)時間的增加,nZVI會發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng),被氧化為Fe3+并以鐵氧化物或鐵氫氧化物(如 FeOOH,Fe3O4,α-Fe2O3和β-Fe2O3)的形式存在[23-24],外層的氧化鐵薄膜對nZVI顆粒活性存在很大影響,因此會降低其團聚和生物毒性[25]。

此外,雖然鐵是生物體內(nèi)酶催化活性的基本元素,但過量攝入也會產(chǎn)生高活性物質(zhì),即通過Fenton反應(yīng)從超氧化物和過氧化氫(H2O2)中產(chǎn)生羥基自由基(OH·)。自由基連鎖反應(yīng)的刺激有可能通過脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)過氧化氫和羰基化合物的復(fù)合物(如MDA)、修飾核酸和組織而引起損傷[26]。此外,脂質(zhì)過氧化的連鎖反應(yīng)將進(jìn)一步加劇。本研究表明,蚯蚓體內(nèi)MDA含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。赤子愛勝蚓MDA含量的升高反映了顯著的氧化應(yīng)激/損傷,這種損傷可能與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等細(xì)胞成分相互作用,同時從多不飽和脂肪酸的雙鍵中提取一個氫原子,產(chǎn)生一種新的自由基,從而建立鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。MDA等是在鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中形成的脂質(zhì)過氧化氫分解后產(chǎn)生的,其結(jié)果可能對信號產(chǎn)生影響,然后導(dǎo)致不可逆的亞致死或致死毒性作用[27]。蚯蚓暴露在不同濃度的nZVI下,體內(nèi)CAT活性隨暴露時間呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。表明CAT有足夠的時間排出過量的H2O2。除此之外,由于SOD的早期激活,CAT活性顯著增強,表明兩者在蚯蚓體內(nèi)的互補機制。此外,在暴露初期nZVI對蚯蚓存在一定的負(fù)面影響,但隨著暴露時間延長,蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶不斷清除因環(huán)境脅迫產(chǎn)生的ROS和-OH[17],nZVI被氧化與周圍物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)[28],使其對蚯蚓負(fù)面影響減弱。因此,nZVI不會導(dǎo)致蚯蚓大量死亡、生物量驟減和嚴(yán)重的生理脅迫。

此外,研究表明非納米ZVI(non-nano-ZVI)顆粒已被證明無毒,不會對蚯蚓產(chǎn)生顯著的毒性作用[29]。因此,可以推測本研究中SOD、CAT和MDA等變化主要受納米特異性影響。此外,研究發(fā)現(xiàn)鐵離子可能有能力進(jìn)入細(xì)胞,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并進(jìn)一步損傷細(xì)胞膜[6]。假設(shè)的機制可能是nZVI附著在蚯蚓表面,將電子轉(zhuǎn)移到不同的生化物質(zhì)上,進(jìn)而對蚯蚓生理產(chǎn)生反應(yīng)。

3.2 nZVI脅迫下蚯蚓活動改善了土壤質(zhì)量

本研究表明nZVI脅迫下蚯蚓活動可顯著提高土壤團聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,土壤中有機質(zhì)含量降低、全氮含量增加并促進(jìn)土壤中全磷轉(zhuǎn)化為速效磷。研究表明:蚯蚓活動促進(jìn)土壤中微團聚體和黏粒結(jié)合轉(zhuǎn)化為大團聚體(d＞2 mm),其他各粒級團聚體比例均降低,蚯蚓糞便可增加土壤中水穩(wěn)性團聚體含量[30];赤子愛勝蚓、南美岸蚓(Pontoscolex corethrurus)、壯偉遠(yuǎn)盲蚓(Amynthas robustus)和參狀遠(yuǎn)盲蚓(A.aspergillum)均可顯著提高紅壤中大團聚體(d＞2000 μm)所占比例(P＜0.05)[31]。這可能是由于土壤動物蚯蚓新陳代謝過程中會消耗和排泄植物與殘留物,并通過自身運動加速植物和殘留物與土壤團聚體融合,促進(jìn)土壤團聚體的形成和穩(wěn)定[32]。也有研究表明,蚯蚓活動有利于土壤中不穩(wěn)定的碳組分吸附在黏土上,促進(jìn)土壤中微團聚體的形成[33],同時蚯蚓的運動和食用促進(jìn)土壤有機質(zhì)的分解,導(dǎo)致土壤中有機質(zhì)含量減少[34]。隨著nZVI濃度的升高,土壤有機質(zhì)含量降低,其主要原因是蚯蚓分解有機質(zhì)[34]以及不溶性有機質(zhì)黏附在nZVI表面的活性位點上[17],土壤團聚體的穩(wěn)定性提高和土壤質(zhì)量改善的同時抑制了不利因素導(dǎo)致的土壤中氮的損失[35],因此全氮含量增加。單一的nZVI處理中土壤全氮含量隨nZVI濃度的升高而逐漸減少,蚯蚓-nZVI復(fù)合處理中呈現(xiàn)相反趨勢。這與蚯蚓和微生物分解有機質(zhì),促進(jìn)土壤中的物質(zhì)向全氮和全磷轉(zhuǎn)化有關(guān)[36-37]。

nZVI濃度相同,添加蚯蚓的土壤微生物相對豐度顯著提高,主要原因與蚯蚓活動提高土壤團聚體的穩(wěn)定性并改良土壤環(huán)境[38]以及蚯蚓自身通過新陳代謝攜帶微生物進(jìn)入土壤系統(tǒng)有關(guān)[22]。本研究表明,nZVI暴露濃度不會影響土壤微生物組成、多樣性和豐富度。而有研究表明,土壤中芽孢桿菌可促進(jìn)Fe3+還原并富集于nZVI外層附近,形成更穩(wěn)定的固體相[25,39]。然而,nZVI會抑制革蘭氏陰性菌如酸桿菌屬(Acidobacterium)等和革蘭氏陽性菌的生長,其根本原因是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中沒有肽聚糖層[3],nZVI被氧化為Fe2+進(jìn)入細(xì)胞破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞結(jié)構(gòu)[23]; 革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的主要組成部分是磷酸脂,nZVI與其結(jié)合形成鐵氧化物沉淀物,堵塞細(xì)胞膜的孔隙,阻止其吸收外部環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì),從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[2,39-40]。

當(dāng)然,蚯蚓活動、土壤質(zhì)量與nZVI之間的關(guān)系是復(fù)雜相互的。土壤質(zhì)地和有機質(zhì)含量強烈影響蚯蚓的行為以及納米顆粒在土壤中的流動性和有效性[41-42];相反,土壤中納米顆粒的毒性也會受到黏土和有機質(zhì)等土壤成分的影響[43]。

4 結(jié)論

1)nZVI導(dǎo)致蚯蚓氧化酶保護(SOD、CAT活性)、脂質(zhì)過氧化作用(MDA含量)與滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)(脯氨酸含量)改變,但隨著暴露時間延長,蚯蚓不斷適應(yīng)環(huán)境、nZVI被氧化或與周圍物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),沒有顯著造成蚯蚓的大量死亡和生物量驟減現(xiàn)象。因此,一定濃度范圍內(nèi)的nZVI對土壤動物不會產(chǎn)生明顯的毒性影響。

2)蚯蚓介導(dǎo)下,nZVI脅迫土壤會降低土壤有機質(zhì)含量,但不會造成土壤氮和磷的損失; 同時蚯蚓活動可顯著提高土壤團聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,促進(jìn)土壤全磷向生物有效磷的轉(zhuǎn)化,且不影響土壤微生物多樣性?？梢?在一定時間一定濃度范圍內(nèi),nZVI對蚯蚓-微生物-土壤生態(tài)系統(tǒng)沒有顯著的負(fù)面影響,同時改善了土壤質(zhì)量。