喬千里 付志華 蔡功玉 葉榮軍 康 凡 王學(xué)文 雷乾坤 陳燁韜 賀海波 許登清

(1. 中國石油化工股份有限公司 湖北化肥分公司， 湖北 宜昌 443200； 2. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院, 湖北 宜昌 443002)

乙二醇(ethylene glycol，EG)是一種廣泛應(yīng)用于精細(xì)化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域的重要原料[1]。隨著EG需求的日益增加，導(dǎo)致了EG產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展[2,3]。但是合成EG過程中會產(chǎn)生大量的碳酸二甲酯、氮氧化物等副產(chǎn)物，且它們多以氣溶膠的形式存在于工作場所的空氣中。自EG工業(yè)化生產(chǎn)以來，陸續(xù)有職業(yè)性急性中毒事故的報道[4,5]。近年來，職業(yè)性碳酸二甲酯亞急性中毒所致器官損傷成為關(guān)注焦點，但其毒性機(jī)制尚未完全闡明。碳酸二甲酯中毒主要以血液凈化聯(lián)合抗氧化應(yīng)激、營養(yǎng)支持等對癥治療來減輕器官損傷。由于EG合成過程中的副產(chǎn)物碳酸二甲酯多以氣溶膠形式存在于廠區(qū)的空氣中，故迫切需要了解碳酸二甲酯對接觸者可能造成的傷害，廠區(qū)空氣中的容許濃度和職業(yè)接觸限值標(biāo)準(zhǔn)，降低廠區(qū)中此類物質(zhì)的方法等。在此基礎(chǔ)上建立一套切實有效的防止碳酸二甲酯傷害的安全防護(hù)措施，以確保EG一線生產(chǎn)職工的生命安全。據(jù)此，本文對碳酸二甲酯小鼠亞急性吸入的毒性作用和靶器官進(jìn)行研究，以便為EG生產(chǎn)過程中的職業(yè)防護(hù)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 藥物

碳酸二甲酯由中國石油化工股份有限公司湖北化肥分公司提供，批號：20191027。

1.2 動物

SPF級雌雄各半的昆明小鼠(18～22 g)由三峽大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2017-0061，試驗編號為2020037。實驗小鼠飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)中，待適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行毒性實驗。實驗研究按照《化學(xué)品毒性鑒定技術(shù)規(guī)范》(衛(wèi)監(jiān)督發(fā)[2005]272號)進(jìn)行操作和評價，并被三峽大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)和在其指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.3 試劑

血常規(guī)試劑購自拜耳醫(yī)藥。肌鈣蛋白I(cTnI)購自南京建成，批號為：20200825。生化試劑：肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性和血糖(glucose，GLU)、總膽固醇(cholesterol，CHOL)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、總蛋白(total protein，TP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CREA)，購自北京利德曼，批號分別為：20200821、20200819、20200823、20200820、20200825、20200824、20200819、20200817、20200813、20200815、20200821。

1.4 儀器

電子體重秤(上海力衡)；電子天平(梅特勒-托利多)；生理記錄儀(美國Biopac)；離心機(jī)(德國Eppendorf)；血細(xì)胞分析儀(美國雅培)；生化分析儀(德國Siemens)；酶標(biāo)儀(瑞士Tecan)；顯微鏡(日本Nikcon)；切片機(jī)(奧地利萊卡)；脫水機(jī)、圖像分析系統(tǒng)(德國Leica)。

1.5 方法

1.5.1 預(yù)實驗

20只小鼠按照1∶0.8組間劑量比值隨機(jī)分成4組，放入吸入染毒裝置內(nèi)(體積為97.5 L)吸入染毒。找出全部死亡的最小劑量(minimum dose for all deaths，Dm)及最大全不死劑量(maximum undead dose，Dn)。

1.5.2 正式實驗

預(yù)實驗測出碳酸二甲酯小鼠吸入染毒Dn為89.681 5 g，Dm為223.983 0 g，按照黃偉等[6]介紹的方法計算得組間r為0.80。實驗除正常組外，染毒小鼠分設(shè)5個劑量組：碳酸二甲酯223.983 0 g劑量組、碳酸二甲酯179.186 4 g劑量組、碳酸二甲酯143.349 1 g劑量組、碳酸二甲酯114.6793 g劑量組和碳酸二甲酯91.743 4 g劑量組，每組20只，雌雄各半。實驗動物給藥前禁食12 h，不禁水。實驗時依次將各組小鼠置于吸入染毒裝置內(nèi)(體積為97.5 L)，按照分組每次稱取相應(yīng)劑量的碳酸二甲酯晶體放入陶瓷蒸發(fā)皿內(nèi)，關(guān)上染毒裝置柜門；然后開啟電磁加熱器電源加熱熔化、沸騰至完全揮發(fā)，然后依次開啟循環(huán)風(fēng)機(jī)、O2檢測探頭、溫度監(jiān)測探頭，并實時監(jiān)測染毒柜內(nèi)O2濃度，通過鼓風(fēng)機(jī)和抽風(fēng)機(jī)，以保持染毒裝置內(nèi)所需的O2濃度。持續(xù)染毒2 h后將動物移至實驗動物中心觀察室內(nèi)，觀察小鼠一般狀況。實驗結(jié)束后，計算碳酸二甲酯的半數(shù)致死量(median lethal dose, LD50)及置信區(qū)間。

1.5.3 一般狀況觀察

觀察動物的中毒表現(xiàn)、死亡數(shù)及死亡時間，進(jìn)行心電圖(electrocardiogram，ECG)檢測、依次取血、腦、肺、心、肝、脾、胃、腎、大小腸、子宮、卵巢、睪丸等組織，觀察上述臟器組織學(xué)病理變化。

1.5.4 ECG檢測

小鼠吸入染毒碳酸二甲酯2 h后，記錄實驗小鼠ECG指標(biāo)變化。

1.5.5 血液學(xué)指標(biāo)檢測

小鼠染毒7 d后，取血檢測白細(xì)胞(white blood cells，WBC)、紅細(xì)胞(red blood cells，RBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、血小板(platelets，PLT)、中性粒細(xì)胞(neutrophils，NEU)、淋巴細(xì)胞(lymphocytes，LYM)、嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophagocytes，EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞(basophilic granulocytes，BASO)、單核細(xì)胞(monocytes，MONO)。

1.5.6 血液生化指標(biāo)檢測

分離血清，進(jìn)行心肌cTnI(膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測)、CK-MB(免疫抑制法檢測)、LDH(比色法檢測)、AST(比色法檢測)、ALT(賴氏法檢測)活性和TBIL(化學(xué)氧化法檢測)、TP(比色法檢測)、ALP(比色法檢測)、CHOL(TCH酶法)、BUN(比色法檢測)、CREA(肌氨酸氧化酶法)、GLU含量檢測。

1.5.7 組織病理學(xué)HE染色

完成實驗小鼠取血后，分別摘取腦、肺、心、肝、脾、胃、腎、大小腸、子宮、卵巢、睪丸等組織，稱量上述臟器質(zhì)量，計算臟器質(zhì)量指數(shù)；然后觀察上述臟器解剖學(xué)及鏡下病理學(xué)變化。對出現(xiàn)病理學(xué)損傷的器官，每張組織切片鏡下觀察6個視野，對組織損傷的病變程度進(jìn)行評分。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以單因素方差分析進(jìn)行多組間差異的比較，以Dunnett-t檢驗比較兩組間均數(shù)的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 碳酸二甲酯吸入染毒后小鼠一般情況

吸入給藥后，碳酸二甲酯223.983 0 g劑量組可觀察到小鼠出現(xiàn)痙攣、煩躁不安等中毒反應(yīng)，并在2 h內(nèi)全部死亡；179.186 4 g劑量組和143.349 1 g劑量組吸入給藥后也出現(xiàn)抽搐、煩躁不安等中毒反應(yīng)，并在給藥2 h后各死亡1只；吸入給藥2 h內(nèi)114.679 3 g劑量組可見上述中毒反應(yīng)，但未出現(xiàn)小鼠死亡。給藥劑量越大，死亡潛伏期越短，中毒癥狀越明顯。未死亡小鼠也出現(xiàn)上述中毒反應(yīng)，約1 h后恢復(fù)自主活動。用寇氏法計算得小鼠吸入染毒碳酸二甲酯的LD50為11.117 9×10-4g/cm3，95% CI為8.267 1×10-4～14.949 3×10-4g/cm3(見表1)。

表1 碳酸二甲酯吸入染毒后小鼠的情況觀察(n=20)

2.2 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠ECG的影響

與正常組相比，碳酸二甲酯吸入染毒2 h后，小鼠ECG出現(xiàn)QRS波增寬、R-R間期延長和J點上移(均P<0.05或P<0.01)；碳酸二甲酯吸入染毒組小鼠心率相比正常組小鼠加快(均P<0.05或P<0.01)。實驗結(jié)果表明，碳酸二甲酯吸入染毒早期可出現(xiàn)明顯的ECG異常，而且隨著碳酸二甲酯吸入染毒劑量增加ECG異常更為明顯(見表2)。

表2 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠ECG的影響

2.3 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠心肌酶活性的影響

與正常組相比，碳酸二甲酯組小鼠血液中cTnI含量和LDH、CK-MB活性明顯升高(均P<0.05或P<0.01)(見表3)。

表3 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠血液cTnI含量和LDH、CK-MB活性的影響

2.4 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

與正常組相比，碳酸二甲酯組小鼠血液中RBC、PLT、NEU和HGB明顯降低，而EOS、LYM、BASO、WBC、MONO明顯升高(均P<0.05或P<0.01)。實驗結(jié)果表明，碳酸二甲酯對實驗小鼠血液學(xué)指標(biāo)有明顯的不良影響，而且隨著吸入染毒劑量增加血液學(xué)指標(biāo)異常更為嚴(yán)重(見表4)。

表4 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

2.5 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠血液生化指標(biāo)的影響

與正常組相比，碳酸二甲酯組小鼠血液中AST、ALT活性和BUN、TBIL、ALP、TP、CREA含量明顯升高(均P<0.05或P<0.01)；而CHOL、GLU含量無明顯改變(均P>0.05)。實驗結(jié)果表明，碳酸二甲酯對實驗小鼠血液生化指標(biāo)有明顯的不良影響，而且隨著吸入染毒劑量增加，血液生化指標(biāo)異常更為嚴(yán)重(見表5)。

表5 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠血液中生化指標(biāo)的影響

2.6 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠臟器質(zhì)量系數(shù)的影響

與正常組相比，碳酸二甲酯染毒組小鼠心、肺、肝、腎的臟器質(zhì)量系數(shù)明顯升高(均P<0.05或P<0.01)(見表6)。

表6 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠臟器質(zhì)量系數(shù)的影響

2.7 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響

光鏡下可見正常組小鼠肺泡上皮結(jié)構(gòu)完整，肺泡形態(tài)均勻、纖毛排列整齊；碳酸二甲酯吸入染毒后可見小鼠肺泡和肺泡隔中大量炎性細(xì)胞浸潤、肺泡隔增厚，毛細(xì)血管充血水腫(見圖1)。根據(jù)肺損傷病理評分標(biāo)準(zhǔn)[7]，碳酸二甲酯吸入染毒組(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠肺組織損傷病理學(xué)評分分別為1.36±0.15、1.57±0.18、1.89±0.21、2.25±0.54和3.59±0.78分，明顯高于正常組0.34±0.09分(均P<0.01)。實驗結(jié)果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明顯的肺損傷。

注：A：正常組；B：碳酸二甲酯91.743 4 g組；C：碳酸二甲酯114.679 3 g組；D：碳酸二甲酯143.349 1 g組；E：碳酸二甲酯179.186 4 g組；F：碳酸二甲酯223.983 0 g組；HE染色(×100)圖1 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響

2.8 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)的影響

光鏡下可見正常組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰。碳酸二甲酯吸入染毒后可見心肌細(xì)胞凋亡壞死、心肌纖維排列紊亂、胞核破碎溶解，而且隨著吸入染毒劑量增加其損傷更加明顯(見圖2)。根據(jù)心肌損傷病理評分標(biāo)準(zhǔn)[8]，碳酸二甲酯吸入染毒組(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠的心肌組織損傷病理學(xué)評分分別為0.64±0.09、1.03±0.13、1.14±0.23、1.29±0.27和1.48±0.21分，明顯高于正常組0.00±0.00分(均P<0.01)。實驗結(jié)果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明顯的心肌損傷。

注：A：正常組；B：碳酸二甲酯91.743 4 g組；C：碳酸二甲酯114.679 3 g組；D：碳酸二甲酯143.349 1 g組；E：碳酸二甲酯179.186 4 g組；F：碳酸二甲酯223.983 0 g組；HE染色(×100)圖2 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響

2.9 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響

光鏡下可見正常組小鼠肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列、肝血竇結(jié)構(gòu)規(guī)整、胞核清晰完整；碳酸二甲酯吸入染毒后可見肝細(xì)胞排列紊亂、呈片狀壞死、胞核破碎溶解，而且隨著吸入染毒劑量增加其損傷更加明顯(見圖3)。根據(jù)肝臟損傷病理評分標(biāo)準(zhǔn)[9]，碳酸二甲酯吸入染毒組(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠肝組織損傷病理學(xué)評分分別為0.95±0.11、1.28±0.10、1.37±0.18、1.59±0.31和1.83±0.34分，明顯高于正常組0.00±0.00分，(均P<0.01)。實驗結(jié)果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明顯的肝臟損傷。

注：A：正常組；B：碳酸二甲酯91.743 4 g組；C：碳酸二甲酯114.679 3 g組；D：碳酸二甲酯143.349 1 g組；E：碳酸二甲酯179.186 4 g組；F：碳酸二甲酯223.983 0 g組；HE染色(×100)圖3 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響

2.10 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠小腸組織形態(tài)學(xué)的影響

光學(xué)顯微鏡下可見正常組小鼠腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞間連接緊密、杯狀細(xì)胞及腺體豐富；碳酸二甲酯吸入染毒后可見上皮細(xì)胞充血水腫、排列雜亂，杯狀細(xì)胞及腺體減少，而且隨著吸入染毒劑量增加其損傷更加明顯(見圖4)。根據(jù)小腸損傷病理評分標(biāo)準(zhǔn)[10]，碳酸二甲酯吸入染毒組(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠小腸組織損傷病理學(xué)評分分別為0.70±0.11、0.81±0.13、0.94±0.17、1.07±0.19和1.28±0.21分，明顯高于正常組0.11±0.03分(均P<0.01)。實驗結(jié)果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明顯的小腸損傷。

注：A：正常組；B：碳酸二甲酯91.7434 g組；C：碳酸二甲酯114.679 3 g組；D：碳酸二甲酯143.349 1 g組；E：碳酸二甲酯179.186 4 g組；F：碳酸二甲酯223.983 0 g組；HE染色(×100)圖4 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠小腸組織形態(tài)學(xué)的影響

2.11 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響

光鏡下可見正常組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊、規(guī)則。碳酸二甲酯吸入染毒后可見腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂、呈片狀壞死、腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，而且隨著吸入染毒劑量增加其損傷更加明顯(見圖5)。根據(jù)腎損傷病理評分標(biāo)準(zhǔn)[11]，碳酸二甲酯吸入染毒組(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠腎組織損傷病理學(xué)評分分別為1.15±0.13、1.37±0.18、1.66±0.19、2.05±0.35和3.44±0.41分，明顯高于正常組0.00±0.00分(均P<0.01)。實驗結(jié)果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明顯的腎損傷。

注：A：正常組；B：碳酸二甲酯91.743 4 g組；C：碳酸二甲酯114.679 3 g組；D：碳酸二甲酯143.349 1 g組；E：碳酸二甲酯179.186 4 g組；F：碳酸二甲酯223.983 0 g組；HE染色(×100)圖5 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響

2.12 碳酸二甲酯吸入染毒后對小鼠其他臟器組織形態(tài)學(xué)的影響

病理組織學(xué)檢測結(jié)果表明，與正常組比較，碳酸二甲酯吸入染毒后，小鼠腦、胃、脾、腎上腺、睪丸、卵巢肉眼及鏡檢均無病理性改變。

3 討論

EG工業(yè)化生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物碳酸二甲酯對人體刺激性主要體現(xiàn)在眼結(jié)膜、呼吸道、消化道、皮膚，而其他器官傷害則報道不一[12]。由于目前尚缺乏規(guī)范的安全防護(hù)措施，職業(yè)性急性碳酸二甲酯中毒傷害時有發(fā)生[13-15]。因此，迫切需要了解碳酸二甲酯在廠區(qū)空氣中的容許濃度和職業(yè)接觸限值標(biāo)準(zhǔn)、對一線生產(chǎn)職工的毒性作用和作用的靶器官等，在此基礎(chǔ)上建立切實有效的安全防護(hù)措施。

眾所周知，CK-MB和cTnI常作為臨床診斷心肌損傷的重要標(biāo)志物[16]。正常情況下，血液中CK-MB和cTnI活性較低；當(dāng)心肌細(xì)胞遭受到物理、化學(xué)或生物性損傷時，胞漿內(nèi)CK-MB和cTnI會釋放入血液，使得血液中CK-MB和cTnI水平異常升高[17,18]。此外，當(dāng)心肌預(yù)后不好時，血液中CK-MB和cTnI也會明顯升高。因此，分析血液中CK-MB和cTnI水平可判斷心肌損傷程度，評價藥物的治療效果[19,20]。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，小鼠吸入染毒后血液中CK-MB和cTnI水平明顯升高，此結(jié)果與ECG異常變化和心臟臟器系數(shù)升高，心肌凋亡壞死、心肌纖維排列紊亂、胞核破碎溶解的形態(tài)學(xué)損傷結(jié)果相一致。

ALT和AST是評估肝細(xì)胞損傷較為特異的指標(biāo)之一[21]。當(dāng)肝臟受到化學(xué)性等損傷時，肝細(xì)胞膜的通透性明顯增加，原來存在于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)的ALT和AST迅速釋放入血液，導(dǎo)致血液中ALT和AST水平明顯升高[22,23]。此外，血液中的ALP、LDH在肝細(xì)胞受損時也會明顯升高[24,25]。本研究結(jié)果顯示，小鼠染毒后肝臟臟器系數(shù)，血液中ALT、AST、LDH、ALP活性明顯高于正常組。提示碳酸二甲酯具有肝臟毒性，可導(dǎo)致肝細(xì)胞排列紊亂、呈片狀壞死、胞核破碎溶解等器質(zhì)性改變和肝功能受損。

BUN和CREA是人體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物，主要通過腎臟排泄。當(dāng)腎臟受到化學(xué)、生物等損傷時，會導(dǎo)致濾過能力下降，進(jìn)而引起血液中BUN、CREA迅速升高[26,27]。因此，分析血液中BUN、CREA水平可判斷腎臟損傷程度，預(yù)測治療效果。在實驗中，我們發(fā)現(xiàn)碳酸二甲酯吸入染毒小鼠的腎臟臟器系數(shù)、血液中BUN和CREA的含量均較正常組明顯升高，提示碳酸二甲酯具有較強(qiáng)的腎臟毒性。腎臟組織形態(tài)學(xué)分析也進(jìn)一步證實染毒后的小鼠腎臟腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂、呈片狀壞死、腎小球結(jié)構(gòu)紊亂。此結(jié)果與Marchetti等[28]報道一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，碳酸二甲酯染毒后的小鼠小腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)了充血水腫、排列雜亂，杯狀細(xì)胞及腺體減少等病理性損傷，證實小腸也可能是其損傷的靶器官之一。此外，我們還發(fā)現(xiàn)血液中RBC、PLT、NEU、EOS、LYM、BASO、WBC、MONO和HGB較正常組均出現(xiàn)了異常改變，推測碳酸二甲酯可能也對血液系統(tǒng)造成損害。

綜上所述，碳酸二甲酯吸入染毒具有較強(qiáng)的毒性，可引起實驗小鼠ECG和血液學(xué)指標(biāo)異常改變，可導(dǎo)致肺、心、肝、小腸和腎出現(xiàn)病理學(xué)改變。本研究為碳酸二甲酯的職業(yè)危害防治提供了實驗依據(jù)。