薛姝婧 高媛媛 楊俏玲 李光華 耿瑤

摘?要：目的：探討PI3K/Akt信號通路在過氧化氫（H2O2）致大鼠血管內皮細胞凋亡中的作用。方法：體外培養(yǎng)大鼠血管內皮細胞（RAEC），復制H2O2氧化損傷模型，采用PI3K/Akt信號通路的特異性阻斷劑渥曼青霉素（Wortmannin，W）對模型細胞株進行干預，實驗分為3組：對照組、H2O2組、H2O2+渥曼青霉素（W）組，采用Western?blot法檢測各組細胞中Bcl2及Bax蛋白的表達。結果：渥曼青霉素干預后，與對照組比較，H2O2組及H2O2+W組Bcl2蛋白表達和Bcl2/Bax比值下降、Bax蛋白表達升高（P均<0.05）。H2O2組與H2O2+W組間Bcl2蛋白表達和Bcl2/Bax比值差異均無統(tǒng)計學意義（P均>0.05）。H2O2+W組Bax蛋白表達高于H2O2組（P<0.05）。結論：渥曼青霉素抑制PI3K/Akt信號通路促進過氧化氫致血管內細胞損傷。

關鍵詞：氧化應激;血管內皮細胞;細胞凋亡;PI3K/AKT

血管內皮細胞位是血管組織內壁的單層柱狀上皮細胞，它是機體循環(huán)系統(tǒng)對抗外部損失與破壞的第一道防線，它不僅具有內分泌功能，還具有對血管組織的保護功能能，對維持機體正常血液循環(huán)的穩(wěn)定狀態(tài)具有重要作用[1]。血管內皮細胞的完整性一旦破壞，會導致高血壓、動脈粥樣硬化及血栓等一系列疾病[2]。渥曼青霉素及其類似物是真菌的代謝產物，可以通過與胞內磷脂酰肌醇激酶（PI3K）的催化亞單位p110結合，不可逆地抑制PI3K的激酶活性，從而阻斷PI3K/AKT信號通路[3]。渥曼青霉素極其類似物是真菌的代謝產物，可以通過與PI3K的催化亞單位p110結合，非競爭性和不可逆的阻斷PI3K/AKT信號通路[3]，抑制信號通路的傳導，因此本研究主要以H2O2復制內皮細胞氧化損傷模型，采用PI3K信號通路抑制劑渥曼青霉素對細胞進行干預，檢測PI3K/Akt信號通路下游Bcl2、Bax的表達情況，探討PI3K/AKT信號通路在H2O2致體外培養(yǎng)大鼠血管內皮細胞（RAEC）氧化損傷中的作用，明確PI3K/Akt信號通路對過氧化氫致細胞凋亡的作用。

一、材料和方法

（一）主要試劑和儀器

大鼠胸主動脈血管內皮細胞（RAEC，為原代細胞）;H2O2（30%）;渥曼青霉素;Bcl2、Bax一抗;大鼠主動脈內皮細胞專用培養(yǎng)基。CO2培養(yǎng)箱;Transblot?SD半干轉印槽;電泳凝膠成像分析儀（TH690B）。

（二）實驗方法

1.細胞實驗分組

RAEC（大鼠胸主動脈血管內皮細胞）在37℃、5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細胞達到融合狀態(tài)時開始傳代，并分三組：對照組、H2O2組、H2O2+渥曼青霉素（W）組。

2.細胞培養(yǎng)

大鼠主動脈內皮細胞專用培養(yǎng)基（每50mL加0.5mL的青鏈霉素混合液及300μL的環(huán)丙沙星注射液）顯微鏡觀察細胞的狀態(tài)，放入37℃、5%CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱中靜置24h過夜，第二天更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細胞狀態(tài)是否穩(wěn)定、內皮細胞貼壁數(shù)量是否超80%時進行傳代。

3.過氧化氫損傷主動脈內皮細胞模型制備

30%過氧化氫原液用滅菌三蒸水稀釋得1mmol·L-1的過氧化氫母液;使用前吸取大鼠主動脈內皮細胞專用培養(yǎng)液稀釋過氧化氫母液，得終濃度為100μmol·L-1的過氧化氫培養(yǎng)基。用微量移液器將大鼠主動脈內皮單細胞混懸液接種在96孔板上，每孔接種100μL，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細胞貼壁并待生長至覆蓋85%時，棄去培養(yǎng)液，用多通道移液器加入上述終濃度含100μmol·L-1過氧化氫的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，制成過氧化氫損傷細胞模型。

4.CCK8法檢測渥曼青霉素對大鼠主動脈內皮細胞存活率的影響及渥曼青霉素最大抑菌濃度篩選

將大鼠主動脈內皮細胞分為6組，每組5個復孔，1×104個/孔細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入含有0、10、50、100、500和1000nmol·L-1渥曼青霉素的不同濃度的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h和48h。按照試劑使用說明書，用完全培養(yǎng)基1︰10稀釋CCK8原液，每孔加入100μL稀釋液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h。待板內液體變成橙黃色時，放入酶標儀（波長450nm）中檢測，記錄光密度（OD）值，計算出各組細胞的存活率（細胞存活率=[（AsAb）/（AcAb）]×100%;抑制率=[（AcAs）/（AcAb）]×100%;As：實驗孔吸光度;Ac：對照孔吸光度;Ab：空白孔吸光度），篩選對大鼠主動脈內皮細胞抑制率最大的渥曼青霉素濃度。

5.Western?blot檢測

將三組組大鼠主動脈內皮細胞消化收集完畢，檢測其Bcl2，Bax蛋白表達含量，使用PBS沖洗洗3遍。置于低溫環(huán)境下，使用搖床進行震蕩混勻30min，加入Lysis?Buffer，15000r·min1，低溫離心20min，取上清為全蛋白提取物，蛋白定量（BCA法）后，分別保存于超低溫冰箱（-80℃）。隨后，取凍存蛋白100μg上樣，緩沖液按照8∶2體積混合并加入到樣本中，沸水煮沸10min。一式四份，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（15%）分離轉膜（PVDF），用脫脂奶粉（5%）低溫（4℃）封閉1h。分別加入抗bcl2（2∶400）、抗bax（1∶3000）、抗βactin（1∶500）一抗，4℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次10min。二抗（1∶800），低溫孵育2h。采用PBST洗膜、ECL化學發(fā)光、顯影。運用Quantity?One圖像分析軟件測定條帶灰度值，條帶與內參條帶灰度值比值表示各組結果。