鮑榮華 周虹 李旭云 孔令成

細(xì)胞衰老的過程是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)的過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活非折疊蛋白反應(yīng)以保護由應(yīng)激所引起的細(xì)胞損傷，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)，恢復(fù)細(xì)胞功能，但如果應(yīng)激刺激過于強烈、持久，內(nèi)環(huán)境紊亂無法糾正，則相應(yīng)凋亡機制被激活并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。成骨細(xì)胞作為骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞，它不僅參與骨形成，而且還參與破骨細(xì)胞性骨吸收的調(diào)節(jié)，因此筆者認(rèn)為調(diào)控成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)，對防治骨質(zhì)疏松癥有重要的意義。目前的研究[1-2]已證明補腎中藥復(fù)方對骨代謝既可抑制骨吸收，又可促進(jìn)骨形成，縮短再造周期，提高骨生物力學(xué)性能，改善骨質(zhì)量。本院根據(jù)右歸飲(《景岳全書》)加減化裁而來的補腎健脾方，在臨床實踐中具有較好的治療骨質(zhì)疏松癥的作用。但其對成骨細(xì)胞的作用機制不明確，為了弄清該方對大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響及其作用機制，本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法，檢測Caspase-3、Bax、ERO1和Bcl-2的表達(dá)量，并分析三者的關(guān)系，為研究中藥復(fù)方治療骨質(zhì)疏松癥提供客觀量化的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6月齡SD大鼠15只，雌性，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號44005800010719。

1.2 實驗藥物及試劑

補腎健脾方由肉蓯蓉、菟絲子、淫羊藿等10味中草藥組成，據(jù)臨床用藥劑量及新藥研究中動物用藥劑量要求，該方的提取藥物，含生藥量1.65 g/mL。阿侖膦酸鈉片，由默沙東公司提供(國藥準(zhǔn)字J20080073，批號為H20130241)。DMEM培養(yǎng)基(Lot1896968)、胎牛血清(FBS；Lot1755919)、Ⅱ型膠原蛋白酶(Lot1934492)、胰蛋白酶溶液(Trypsin；Lot1851925)來自澳大利亞Thermo Fisher公司。青霉素和鏈霉素(P/S；Lot076M4762V)來自美國Sigma-aldrich公司。Trizol裂解液(Lot180506)來自美國Thermo Fisher公司。RNA提取試劑盒(Cat9767)來自美國Takara生物有限公司。Oligo-dT等RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑、PCR反應(yīng)試劑盒(Lot0000256582)、Tetrazolium salt (Lotab146310)來自澳大利亞Promega公司。

1.3 方法

1.3.1動物分組、干預(yù)及取樣 15只SD大鼠，隨機分為補腎健脾方組、阿倫膦酸鈉組、空白對照組(等體積生理鹽水)，每組5只。按照人-大鼠體表面積比值折算大鼠等效給藥劑量，計算得出補腎健脾方組給藥濃度為5 mg/kg，阿倫膦酸鈉組給藥濃度為1 mg/kg，空白對照組給予同等體積的生理鹽水。1次/d，連續(xù)12 d，最后一次給藥后1 h處死，各組動物在1%水合氯醛3 mL/kg麻醉下，無菌條件下腹主動脈采血，4 ℃冰箱靜置待全血凝固后(約4 h)，3 500 r/min離心15 min，取上清。同組混合，56 ℃滅活30 min，用0.22 μm 針頭微孔濾器過濾除菌，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2大鼠成骨細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及成骨分化 將2只新生24 h內(nèi)的SD大鼠脫頸處死，在70%酒精中浸泡5～10 min，無菌環(huán)境下取大鼠顱骨，在D-Hanks平衡溶液中去除附著在骨表面的血管及結(jié)締組織，將顱骨剪碎，并在無血清的DMEM中用1 mg/mL膠原胰酶消化在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化5次，分別持續(xù)30 min(第1組分)，25 min(第2組分)，25 min(第3組分)，20 min(第4組分)和15 min(第5組分)。將第1組分和第2組分混合，第3，4，5組分混合，150 r/min離心10 min，用D-Hanks液洗滌兩次，重懸細(xì)胞于DMEM完全培養(yǎng)基中(含10% 胎牛血清，1%雙抗)，將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h換液，棄去懸浮細(xì)胞，每隔2 d換液1次。待細(xì)胞融合率達(dá)到90%以上時，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基各成分比例為 100 nmol/L的地塞米松，50 μg/mL的維生素C膦酸酯，10 mmol/L的β-甘油膦酸鈉。

1.3.3MTS檢測補腎健脾方對大鼠成骨細(xì)胞毒性的影響 根據(jù)MTS試劑盒測定補腎健脾方對大鼠成骨細(xì)胞的影響。將成骨細(xì)胞以3 000個細(xì)胞/孔接種在96孔板上并過夜。后將(0.0，0.1，0.5，1.0，2.5， 5.0 μmol/L)的大鼠補腎健脾方含藥血清加入成骨細(xì)胞一起孵育48 h和72 h，再將試劑10 μL加入96孔中，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長處測定各孔吸光度。

1.3.4qRT-PCR實驗 將成骨細(xì)胞按每孔5×104個細(xì)胞的密度種入6孔板中，長至80%時則更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入大鼠補腎健脾方含藥血清，大鼠阿倫膦酸鈉含藥血清，空白對照組加入相應(yīng)體積的PBS。每2 d更換1次培養(yǎng)基或分化液，至第7天使用PBS清洗各組細(xì)胞1次，隨后進(jìn)行qRT-PCR實驗。每孔加入1 mL Trizol裂解液，冰上裂解20 min，加入200 μL氯仿，充分混勻，室溫放置10 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清水相，轉(zhuǎn)至新的EP管中，隨后使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，操作流程參照試劑盒使用說明。以O(shè)ligo-dT等試劑為反轉(zhuǎn)錄引物，以提取的總RNA為模版，在酶的催化下特異反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR采用SYBR Green和表1的特定引物。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 s，變性95 ℃ 5 s，退火、延伸60 ℃ 31 s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，并采用2-△△Ct法進(jìn)行定量分析。RNA相對表達(dá)量參照內(nèi)參基因Hprt。

表1 qRT-PCR實驗引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTS細(xì)胞毒性檢測

細(xì)胞毒性的檢測結(jié)果表明，補腎健脾復(fù)方含藥血清(0.0，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0 μmol/L)在48 h和72 h對成骨細(xì)胞未見明顯毒性作用(見圖1)，差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 補腎健脾復(fù)方中藥MTS毒性實驗結(jié)果

2.2 補腎健脾方含藥血清抑制成骨細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)

通過qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)相比于空白對照組，補腎健脾方含藥血清組和阿侖膦酸鈉含藥血清組均能明顯降低大鼠成骨細(xì)胞中Caspase-3和Bax基因表達(dá)的水平，提高Bcl-2基因表達(dá)的水平(見表2)，其中阿侖膦酸鈉含藥血清組抑制大鼠成骨細(xì)胞凋亡基因表達(dá)比補腎健脾方含藥血清組強。而ERO1在各組的變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 補腎健脾方組和阿侖膦酸鈉組對大鼠成骨細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松癥可能導(dǎo)致嚴(yán)重的骨折和殘疾，并與年齡密切相關(guān)，但任何原因所致的峰值骨量(BMD)下降、骨吸收增加和形成不足都可引起骨量降低和股脆性增加[3-4]。越來越多的證據(jù)表明，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在骨形成和骨吸收過程中的不平衡是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的重要原因[5-6]。值得注意的是，骨形成依賴于成骨細(xì)胞的增殖和分化，李淑梅等[7]研究表明淫羊藿甙能提高成骨細(xì)胞中ALP和ColⅠmRNA的表達(dá)水平，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化，并通過提高BMP-2的表達(dá)水平來促進(jìn)成骨細(xì)胞Osterix的基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)骨形成，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡會進(jìn)一步導(dǎo)致骨破壞[8]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶，該酶屬于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，是六大蛋白酶家族之一[9]。BCL-2蛋白家族控制細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑，BAX的活性受到BCL-2家族內(nèi)外復(fù)雜蛋白網(wǎng)絡(luò)的精確控制。Bax通過滲透線粒體外膜和隨后啟動Caspase級聯(lián)，使細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡[10]。ERO1主要參與維持 ERS內(nèi)氧化狀態(tài)，ERO1激活過多就會導(dǎo)致是細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的增多，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡加速。

中醫(yī)認(rèn)為“腎藏精，生髓，主骨”，是腎中精氣促進(jìn)機體生長發(fā)育功能的具體體現(xiàn)，骨的生長發(fā)育依賴腎中精氣的滋養(yǎng)與推動，腎中精氣充盈則骨髓生化有源，骨才能得到髓之滋養(yǎng)[11]。并認(rèn)為骨質(zhì)疏松性骨折愈合就是“瘀去、新生、骨合”的過程，且在“腎主骨”理論的指導(dǎo)下進(jìn)行組方用藥。因此，補腎中藥已被用作治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥物，有研究[12-13]證明以“補腎健脾法”擬定的補腎健脾方對骨代謝有雙向作用，既可抑制骨吸收，又可促進(jìn)骨形成，縮短再造周期，提高骨生物力學(xué)性能，改善骨的質(zhì)量，是一個較理想的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。林巧璇等[14]觀察補腎活血湯對骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折(OVCF)經(jīng)皮椎體后凸成形術(shù)(PKP)后患者疼痛和血清骨代謝的改善作用，認(rèn)為補腎活血湯能緩解OVCF術(shù)后患者疼痛，提高日常生活能力，促進(jìn)骨形成，減少骨吸收，增加骨密度，可能降低OVCF術(shù)后患者再發(fā)骨折的風(fēng)險。秦夢等[15]觀察右歸丸、淫羊藿、淫羊藿苷含藥血清對成骨細(xì)胞增殖及Wnt/β-catenin信號通路的作用，發(fā)現(xiàn)右歸丸、淫羊藿、淫羊藿苷三者均能促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞的增殖，以右歸丸作用最顯著；右歸丸可顯著促進(jìn)wnt3a、wnt7b、β-catenin蛋白的表達(dá)。而本研究中的中藥復(fù)方是根據(jù)右歸飲加減化裁而來，方中由肉蓯蓉、菟絲子、淫羊藿等10味中草藥組成，該方從骨質(zhì)疏松癥的腎虛、脾虛等病因病機立法，全方諸藥共奏補腎壯骨、健脾益氣、活血化瘀之功效。經(jīng)過臨床的實踐應(yīng)用，認(rèn)為對骨質(zhì)疏松癥具有較好的治療作用，然而，該方對成骨細(xì)胞的影響及其作為治療骨質(zhì)疏松癥的新化合物的潛力還有待進(jìn)一步研究。

在本研究中，數(shù)據(jù)顯示補腎健脾方能顯著下調(diào)Bax基因的表達(dá)，降低Caspase-3的活性，而Bcl-2的表達(dá)在大鼠成骨細(xì)胞中上調(diào)。但是ERO1的表達(dá)不顯著，筆者分析有可能補腎健脾方?jīng)]有通過由ERO1所介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，而對Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)顯著，有可能是通過Caspases途徑進(jìn)行細(xì)胞凋亡的調(diào)控?；谏鲜鼋Y(jié)果，筆者認(rèn)為補腎健脾方減少大鼠成骨細(xì)胞的凋亡，而且是通過Caspase-3/Bcl-2途徑進(jìn)行調(diào)控。而且本實驗利用MTS法，通過觀察補腎健脾方對大鼠成骨細(xì)胞活性的影響，證實補腎健脾方對大鼠成骨細(xì)胞無毒性作用。

綜上所述，補腎健脾方可在一定程度上抑制大鼠成骨細(xì)胞的凋亡，而且是通過Caspase-3/Bcl-2途徑進(jìn)行調(diào)控，是治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶向藥物。